Đánh giá mức độ ảnh hưởng của tảo haematococcus pluvialis lên sức đề kháng cá tra nuôi (pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuẩn (edwardsiella ictaluri)​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA TẢO Haematococcus pluvialis LÊN SỨC ĐÊ KHÁNG CÁ TRA NUÔI (Pangasianodon hypophthalmus) ĐỐI VỚI BỆNH GAN THẬN MỦ DO VI KHUẨN (Edwardsiella ictaluri) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS VÕ MINH SƠN Sinh viên thực MSSV: 0851110182 : NGÔ THANH PHONG Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) loài thủy sản nước xuất chiến lược Việt Nam.Theo Tổng cục Thủy sản năm (2011), diện tích ni cá tra đạt 5.400 sản lượng đạt 1,141 triệu năm 2010; diện tích ni sản lượng cá tra ước đạt 6.000 – 6.300 1,2 – 1,3 triệu năm 2011 (Phạm Thị Kim Oanh, 2011) Sản lượng cá tra ngày gia tăng đơi với suy thối mơi trường nước thải bùn ao nuôi cá tra thâm canh, dẫn đến bùng phát dịch bệnh gây thiệt hai cho người ni cá tra Trong bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xảy thường xuyên gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi cá Để quản lý dịch bệnh kháng sinh lựa chọn hàng đầu người nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên việc làm dụng sử dụng thuốc kháng sinh hóa chất diệt khuẩn dẫn đến hệ lụy tạo chủng vi khuẩn, virus có khả kháng lại kháng sinh, tăng độc lực Do nhiều phương pháp thân thiện với mơi trường sử dụng nuôi trồng thủy sản vaccine, probiotic, chất tăng cường hệ miễn dịch Trong chất kích thích miễn dịch sử dụng rộng rãi nuôi trồng thủy sản nhằm mục đích tăng cường sức đề kháng thơng qua tăng cường hệ miễn dịch không đặc hiệu, tiết chất kháng khuẩn, kích thích khả sinh trưởng phát triển Xuất phát từ tình hình thực tiễn thực đề tài “Đáng giá mức độ ảnh hưởng tảo Haematococcus pluvialis lên sức đề kháng cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) bệnh gan thận mủ vi khuần Edwardsiella ictaluri” nhằm mục đích tăng cường khả chống chịu cá tra vi khuẩn gây bệnh Đồ án tốt nghiệp 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên cá tra nuôi kháng bệnh gan thận mủ 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng tảo Haematococcus pluvialis đến khả kháng bệnh - bệnh gan thận mủ cá tra nuôi - Khảo sát ảnh hưởng tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên cá tra nuôi thông qua thông số miễn dịch  Hoạt động thực bào (Phagocyte activity) -  Sản sinh O2 (Superoxide anion production)  Hoạt tính lysozyme (Lysozyme activity assay) Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.1.1 Giới thiệu chung Cá tra 2.1.1.1 Phân bố Cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) loài cá da trơn nước có giá trị kinh tế cao, ni phổ biến số quốc gia như: Việt Nam, Lào, Thái Lan, Campuchia…Ở Việt Nam đối tượng nuôi với quy mô công nghiệp số tỉnh Đồng sông Cửu Long An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang…(Đồng Thanh Hà ctv, 2009) 2.1.1.2 Phân loại Giới: Animalia Ngành: Chordata Phân ngành: Vertebrata Lớp: Actinopterygii Phân lớp: Neopterygii Liên bộ: Ostariophysi Bộ: Siluriformes Họ: Pangasiidae Hình 2.1: Cá Tra [ 50] Lồi: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) 2.1.2 Đặc điểm cá Tra 2.1.2.1 Đặc điểm sinh lý Cá tra có thân dài, khơng vẩy, màu sắc đen xám, bụng bạc, miệng rộng có đơi râu dài Cá sống chủ yếu nước ngọt, chịu nước lợ nhẹ (độ muối 10%0), chịu đựng nước phèn có pH > Cá tra có quan hơ hấp phụ nên Đồ án tốt nghiệp sống ao hồ chật hẹp, thiếu oxi nên nuôi mật độ cao (Phạm Văn Khánh ctv, 2011) 2.1.2.2 Đặc điểm sinh học cá tra Hiện có 11 lồi thuộc họ cá tra tìm thấy Việt Nam Khi ni ao, cá tra có khả thích nghi với nhiều loại thức ăn: mùn bã hữu cơ, cám, rau, động vật đáy, thức ăn hỗn hợp Trong tự nhiên, cá tra sống 20 năm Tuổi thành thục cá tra từ năm Vào mùa thành thục từ tháng trở cá có tập tính bơi ngược dịng di cư tìm đến bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho phát triển tuyến sinh dục đẻ trứng Vì vậy, cá khơng đẻ tự nhiên phần sông MêKông Việt Nam Bãi đẻ cá nằm khu vực từ địa phận Cratie Campuchia trở lên Tại bãi đẻ, cá bố mẹ đẻ trứng thụ tinh tự nhiên, trứng dính vào cỏ thủy tinh ven bờ Sau nở, cá bột trơi theo dịng nước hạ lưu đến vùng ngập nước Campuchia xi dịng theo sơng MêKơng phía Việt Nam (Phạm Văn Khánh ctv, 2011) 2.1.3 Tình hình ni cá tra Việt Nam Đồng sơng Cửu Long (ĐBSCL) có hệ thống sơng rạch chằng chịt, điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nông nghiệp đánh bắt thủy sản Từ năm 1940 nghề nuôi cá nước bắt đầu phổ biến phát triển Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) cá basa (Pangasius bocourti) lồi ni trồng thủy sản nuôi thông dụng đươc phát triển với tốc độ nhanh tỉnh ĐBSCL (chủ yếu tỉnh An Giang Đồng Tháp) Đến nay, cá tra nuôi hầu hết tỉnh thành Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang (Tạp chí thủy sản, 2012) Đồ án tốt nghiệp 2.1.4 Một số bệnh thường gặp cá tra  Bệnh đốm đỏ Tác nhân gây bệnh Bệnh đốm đỏ gọi bệnh xuất huyết, bệnh nhiễn trùng máu, bệnh sởi Là bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây Ngoài ra, số trường hợp phân lập vi khuẩn A sobria, A caviae Pseudomonas sp cá bị bệnh đốm đỏ Dấu hiệu bệnh lý Bệnh đốm đỏ có loại hình biểu qua mức độ trạng thái bệnh cá: bệnh cấp tính, bệnh thứ cấp tính, bệnh ác tính, bệnh mãn tính (Từ Thanh Dung ctv, 2005)  Bệnh nấm thủy mi Tác nhân gây bệnh Nguyên nhân gây bệnh giống nấm thường có nước, nước bẩn bùn ao Saprolegnia Achlya, thuộc họ Saprolegniaceae Sợi nấm dài trong, có phân nhánh khơng phân nhánh, khơng có vách ngăn Phần cắm sâu vào tổ chức thể cá, phần lơ lửng nước trơng bơng, người ni cá miền Nam gọi bệnh "bệnh bọ gòn" Dấu hiệu bệnh lý Khi ký sinh, mắt thường khó nhìn thấy, phần cuối sợi nấm đâm sâu vào khe tổ chức da mang cá Phần đầu lơ lửng nước có màu trắng Cá có cảm giác ngứa ngáy, gầy, đen sẫm Bệnh thường xảy cá mè, rô phi, tra bị thương Khi nấm phát triển tổ chức cá, điều kiện phục hồi bệnh khó khăn Nấm ngày phát triển lớn Vi khuẩn có điều kiện xâm nhập vào làm bệnh nặng thêm Kết dẫn đến chết tổ chức cá làm chúng rời khỏi thể, cá sống mà thân có chỗ cịn xương Khi ấp trứng cá gặp thời tiết lạnh, nhiệt độ nước 20 C thời gian ngắn nấm thủy mi phát triển bao phủ toàn trứng Nấm làm hư trứng nấm hút chất Đồ án tốt nghiệp dinh dưỡng trứng tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng nước phát triển bề mặt vỏ trứng, làm cho trứng bị ung thối rữa nhanh (Từ Thanh Dung ctv, 2005)  Bệnh mủ gan vi khuẩn E ictaluri cá tra Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh xác định Edwardsiella ictaluri (Crumlish ctv, 2002) Dấu hiệu bệnh Dấu hiệu bên ngoài: Cá bệnh mặt nước , bơi lờ đờ cặp mé, màu sắc nhợt nhạt có dấu hiệu giảm ăn thời gian ngắn sau ăn trở lại bình thường Trên thể có đốm xuất huyết mõm, gốc vi, nắp mang, hậu môn, mang màu sắc nhạt, bụng chướng to, đơi có tượng mắt lồi (Nguyễn Thị Thúy Liễu ctv, 2008) Dấu hiệu bên trong: Cá bệnh dày trướng hơi, mạch máu trương to, gan màu sắc nhạt, thận sưng, có dịch lỏng đỏ bên xoang nội quan Trên gan, thận, tỳ tạng có đốm nhỏ màu trắng đục kích cỡ khơng (đường kính khoảng 1-3 mm) Đơi có tượng nhũng thận cá bệnh nặng Cá chớm bệnh thấy xuất đốm trắng thận (Nguyễn Thị Thúy Liễu ctv, 2008) Theo Bùi Quang Tề ctv (2006) cá bệnh cịn có dấu hiệu bụng trương to, xuất huyết gốc vây, mắt lồi, xung quanh miệng xuất đốm xuất huyết Tình hình bệnh gan thận mủ cá tra Bệnh xuất vào mùa lũ năm 1998 số vùng nuôi cá tra thâm canh trọng điểm An Giang, Đồng Tháp Cần Thơ Sau lan rộng hầu hết tỉnh ĐBSCL thời gian gần (Từ Thanh Dung ctv, 2009) Bệnh xuất hầu hết giai đoạn phát triển cá tra, tập trung giai đoạn cá giống cá thịt có khối lượng nhỏ 300 gram Bệnh gây chết tích Đồ án tốt nghiệp lũy 10-90% cá nuôi khơng có biện pháp can thiệp kịp thời bênh xảy (Từ Thanh Dung ctv, 2009) Phòng trị bệnh E.ictaluri cá tra Trong q trình ni tác phịng ngừa dịch bệnh ln xem quan trọng chữa trị Việc phịng ngừa bệnh tốt khơng hạn chế xuất dịch bệnh mà cịn tiêu chí hàng đầu làm tăng giá trị sản phẩm cá tra, giảm chi phí ni tăng lợi nhuận cho người ni Có thể áp dụng biện pháp sau để phòng trị bệnh mủ gan cá tra: quản lý tốt môi trường ao nuôi, mật độ thả ni thích hợp, chế độ dinh dưỡng phù hợp, sử dụng chế phẩm vi sinh học, sử dụng vaccine để phòng (Từ Thanh Dung ctv, 2005) 2.2 Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2.1 Hệ thống phân loại theo Bergey Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Edwardsilla Lồi: Edwardsiella ictaluri Hình 2.2: Vi khuẩn 2.2.2 Đặc điểm sinh hóa Edwardsiella ictaluri [48] Edwardsiella ictaluri vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy nghi, có dạng hình que, kích thước x 2-3 µm, không sinh bào tử Trên môi trường Blood agar sau 48 khuẩn lạc có màu trắng đục, trịn, bờ bóng, đường kính từ 1,5 – mm Phát triển tốt môi trường thạch máu, BHI, nhiệt độ thích hợp 28 - 30 C, pH - (Holt ctv, 1994) Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1: Bảng thử nghiệm sinh hóa Edwardsiella ictaluri (Holt ctv, 1994) Thử nghiệm sinh hóa Indol Methyl red Simmons Citrate H2S Lysine decarboxylase Ornithin decarboxylase Motility Malonate D-Glucose, gas production Acid production from: L-Arabinose Lactose D-Mannitol Melblose L-Rhamnose D-Sorbitol Trehalose D-Xylose ONPG Chú thích: D (Depend): phụ thuộc tùy nơi mà có kết dương âm Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Con đường xâm nhiễm Edwardsiella ictaluri Từ nguồn nước vi khuẩn xâm nhập vào cá qua đường:  Vi khuẩn nước qua đường mũi cá xâm nhập vào quan khứu giác vào bên dây thần kinh khứu giác sau lên não Sự truyền nhiễm lan rộng từ màng não đến sọ da (thường gọi “hole in the head”) (Shotts ctv, 1986) E.ictaluri theo đường tiêu hóa vào máu xuyên qua ruột dẫn đến bệnh nhiễm trùng máu Bằng đường này, vi khuẩn xâm chiếm mạnh đến mạch mao quản bên da, nguyên nhân dẫn đến hoại tử làm sắc tố da cá (Shotts ctv, 1986)  Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan viêm cầu thận vòng tuần sau nhiễm khuẩn A Hình 2.3: Cá Tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A); Cá Tra bị bệnh mũ gan thận với nội tạng sưng to nhiều đốm mủ trắng thận, lách gan (B) Đồ án tốt nghiệp 4.2 Ảnh hưởng Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên 4.2.1 Hoạt động thực bào A Hình 4.2 Hoạt động thực bào tế bào bạch cầu cá sau cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis lô đối chứng (A), 100 mg/kg (B) Tế bào thực bào Hình 4.3 Hoạt động thực bào tế bào bạch cầu cá sau cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis 200mg/kg 40 Đồ án tốt nghiệp a Hình 4.4 Tỉ lệ thực bào (A) số thực bào (B) Tỉ lệ thực bào (A) số thực bào (B) cá tra cho ăn thức ăn trộn 41 Đồ án tốt nghiệp Haematococcus pluvialis sau 28 ngày Mỗi cột biểu thị số trung bình lần lặp lại độ lệch chuẩn Số liệu thời điểm thu mẫu có kí hiệu chữ khác biểu thị khác biệt có ý nghĩa (p < 0.05) Bảng 4.3 Tỉ lệ thực bào (PA) số thực bào (PI) cá tra sau cho ăn thức ăn đối chứng thức ăn trộn Haematococcus pluvialis 28 ngày Nghiệm thức ĐC dương 100 mg/kg 200mg/kg Kết tỉ lệ thực bào sau bổ sung tảo vào thức ăn có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê nghiệm thức Điều chứng tỏ việc bổ sung tảo vào thức ăn làm tăng hệ miễn dịch tự nhiên cá tra bảo vệ chống lại tác nhân gây bệnh Nghiệm thức đối chứng dương tỉ lệ thực bào thấp (8,3%) so với nghiệm thức 100 mg/kg (31,4%) 200 mg/kg (27,3%) Nghiệm thức 100 mg/kg tăng 3,78 lần so với nghiệm thức đối chứng dương khơng có khác biệt so với nghiệm thức 200 mg/kg Tỉ lệ thực bào nghiệm thức 100 mg/kg cao so với nghiệm thức 200 mg/kg nghiệm thức đối chứng dương Sự khác biệt giải thích tác động astaxanthin lên hệ thống miễn dịch không đặc hiệu cá, làm gia tăng số lượng hoạt động đại thực bào Các nghiên cứu gần cho thấy cá bị vi khuẩn gây bệnh xâm nhập máu dịch gian bào, vi khuẩn gặp phải hàng rào quan trọng chế bảo vệ không đặc hiệu cá bao gồm tế bào thực bào như: bạch cầu trung tính đại thực bào tăng lên nhanh chóng Vũ Triệu An (2003) Theo Newman ctv (1993), đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thực việc gia tăng tế bào bạch cầu chống lại tác nhân gây bệnh 42 Đồ án tốt nghiệp Trong số thực bào (PI) cá tra ngày sau 28 ngày cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê nghiệm thức (p>0,05) Chỉ số thực bào nghiệm thức 100 mg/kg có tăng khơng đáng kể so với nghiệm thức đối chứng nghiệm thức 200 mg/kg 4.2.2 Sản sinh O2- Hình 4.5 Sản xuất oxi hoạt hóa cá sau cho ăn Haematococcus pluvialis sau 28 ngày Bảng 4.4 Oxy hoạt hóa cá tra sau cho ăn thức ăn đối chứng thức ăn trộn Haematococcus pluvialis 28 ngày 43 Đồ án tốt nghiệp Kết hoạt động oxy hoạt hóa thời gian ngày khơng có khác biệt mặt thống kê (p>0.05) Nhưng sau 28 ngày cho ăn thức ăn có bổ sung tảo Haematococcus pluvialis có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Nghiệm thức 200 mg/kg sản xuất oxi hoạt hóa tăng 1,2 lần so với 100 mg/kg 1,84 lần so với nghiệm thức đối chứng Kết chứng minh việc bổ sung Haematococcus pluvialis vào thức ăn làm tăng khả sản xuất oxi hoạt hóa cá Đồng thời kích thích hệ miễn dịch khơng đặc hiệu cá giúp chống lại vi khuẩn gây bệnh Oxy hoạt hóa sản sinh tế bào thực bào phagocyte (hay tế bào bạch cầu, leucocyte) có tác dụng tiêu diệt mầm bệnh suốt trình thực bào chế bảo vệ vật chủ xảy thường xuyên nhằm chống lại khả xâm nhiễm mầm bệnh Tuy nhiên, hoạt động mức chất hoạt hóa dẫn xuất từ oxy (ROIs) gây hại độc cho tế bào chủ Dalmo ctv (1997) Do đó, tế bào vật chủ có chế bảo vệ chuyển hóa chất độc tạo từ trình ROIs - enzyme chống oxy hóa Superoxide dismutase (SOD) chuyển hóa O thành H2O2, glutathione peroxidase catalase chuyển hóa H 2O2 thành nước có lợi cho tế bào Sampaio ctv (2008), Scandalios ctv (2005) Tăng hoạt động thực bào oxy hoạt hóa tế bào bạch cầu cá hồi sau chúng cho ăn với thức ăn có bổ sung Lactobacillus Lactic Lactobacillus mesenteroides với mật độ 10 cfu/g khoảng 14 ngày Balcázar ctv (2007b) Tuy nhiên nghiên cứu tăng có khác biệt có ý nghĩa hoạt động thực bào, số thực bào, đồng thời tăng oxy hoạt hóa tế bào bạch cầu sau cho cá tra thức ăn bổ sung tảo Điều chứng tỏ gia tăng oxy hoạt hóa có tương quan với hoạt động thực bào 44 Đồ án tốt nghiệp 4.2.3 Hoạt tính lysozyme Kết khảo sát hoạt tính lysozyme theo phương pháp Elis (1990) ta có sau: Hình 4.6 Hoạt động lysozyme sau 28 ngày cho ăn tảo Haematococcus pluvialis Bảng 4.5 Hoạt tính lysozyme huyết cá tra sau cho ăn thức ăn bổ sung Haematococcus pluvialis sau 28 ngày Qua biểu đồ ta nhận thấy ngày nghiệm thức đối chứng 100 mg/kg, 200 mg/kg cho nồng độ lysozyme khơng có khác biệt mặt thống kê nghiệm thức 45 Đồ án tốt nghiệp Hoạt tính lysozyme huyết cá tra sau 28 ngày cho ăn thức ăn bổ sung Haematococcus pluvialis khơng có khác biệt mặt thống kê nghiệm thức: đối chứng, 100 mg/kg 200 mg/kg Việc bổ sung tảo H.pluvialis vào thức ăn không ảnh hưởng đến hoạt tính lysozyme huyết cá Lysozyme yếu tố bảo vệ chống lại xâm nhiễm mầm bệnh động vật có xương sống Osserman ctv (1974) Lysozyme có khả phân giải vi khuẩn gram dương tiêu diệt vi khuẩn gram âm sau phá vỡ vỏ tế bào Hjelmeland ctv (1983) Ngoài hoạt động bổ thể tham gia bảo vệ tế bào từ xâm nhiễm vi khuẩn, nấm, virus ký sinh trùng Muller-Eberhard ctv (1988) Một số nghiên cứu Thompson (1994) đối tương cá hồi Đại Tây Dương chứng tỏ việc bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn không ảnh hưởng đến nồng độ lysozyme huyết 46 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Thức ăn bổ sung 100 mg/kg Haematococcus pluvialis giúp nâng cao khả đề kháng cá tra Edwardsiella ictaluri với tỷ lệ sống cao 86,7±5,8 % Ngoài việc bổ sung tảo vào thức ăn nâng cao hệ miễn dịch không đặc hiệu cá tra cụ thể là: - Hoạt động thực bào (PA) tế bào bạch cầu cá cho ăn với thức ăn có bổ sung astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis 100 mg/kg (31.4 ± 5.0) 200 mg/kg (27.3 ± 10.8) tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p