Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực : Nguyễn Thị Tâm MSSV: 1051110142 Lớp: 10DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đồ án kết nghiên cứu em, tiến hành phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học thuộc khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Các kết quả, số liệu đồ án hoàn tồn trung thực, chưa có cơng bố Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Tâm Đồ án tốt nghiệp Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy cô Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM, đặc biệt Thầy cô Khoa Môi trường Công nghệ sinh học tận tình dạy bảo cho em bao năm qua, trang bị cho em kiến thức quý giá tạo dựng cho em nhiều kinh nghiệm suốt trình học tập Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Nguyễn Hồi Hương, Cơ bên cạnh giúp đỡ bảo, hướng dẫn cho em suốt trình triển khai nghiên cứu hoàn thành đề tài tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy phịng thí nghiệm tạo điều kiện cung cấp hóa chất để em thực thí nghiệm Và cuối em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân ln bên em động viên, ủng hộ em suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Kiến thức nhiều hạn chế, chắn không tránh khỏi sai sót, em mong thơng cảm góp ý chân thành thầy bạn Xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Tâm Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích để tài 1.3 Mục tiêu, nhiệm vụ đề tài 1.4 Nội dung đề tài 1.5 Phƣơng pháp xử lí số liệu 1.6 Các kết đạt đƣợc đề tài CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu thuốc bảo vệ thực vật sin 2.1.1 Khái niệm phân loại 2.1.2 Ứng dụng tuyến trùng diệt sâu 2.1.3 Ứng dụng vi khuẩn diệt sâu 2.2 Mối quan hệ vi khuẩn tuyến tr 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.6 2.4 2.2.2 Vi khuẩn cộng sinh tạo đ Giới thiệu Serratia marcescens Lịch sử phát Serratia marcescens Phân loại Serratia marcescens Đặc điểm sinh lí Đặc điểm sinh hóa Đặc điểm phân bố Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Một số hợp chất đƣợc tổng hợp Se 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.5 2.6 Khả diệt sâu Serratia marce Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình lê 2.6.1.Quá trình lên men 2.6.2.Ảnh hƣởng môi trƣờng i Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng 29 2.6.2.2 Ảnh hƣởng điều kiện lên men 30 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 3.2 Vật liệu – môi trƣờng – thiết bị sử dụng nghiên cứu 32 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 32 3.2.2 Môi trƣờng 32 3.2.3 Hóa chất 32 3.2.4 Dụng cụ 33 3.2.5 Thiết bị 33 3.3 Phƣơng pháp luận 34 3.4 Bố trí thí nghiệm 34 3.5 Phƣơng pháp khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng SH1 38 3.5.1 Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý 38 3.5.2 Thử nghiệm sinh hóa định danh chủng SH1 Kit API 20E 39 3.5.3 Thử nghiệm hoạt tính enzyme 42 3.6 Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 42 3.6.1 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng môi trƣờng Nutrient broth 43 3.6.2 Xác định nguồn Nitơ tốt cho phát triển Serratia marcescen SH1 44 3.6.3 Xác định nguồn Cacbon tốt phát triển Serratia marcescens SH1 45 3.7 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S marcescens SH1 46 3.7.1 Khảo sát ảnh hƣởng pH lên phát triển S marcescensSH1 47 3.7.2 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện oxy lên phát triển S marcescens SH1 47 3.7.3 Khảo sát ảnh hƣởng mật độ cấy giống lên phát triển S marcescens SH1 47 ii Đồ án tốt nghiệp 3.7.4 Khảo sát ảnh hƣởng việc b marcescens SH1 3.7.5 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣ trƣờng mớivà điều kiện nuôi cấy CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BỆNH LUẬN 4.1 Kết quan sát hình thái sinh lý thử nghiệm hóa sinh 4.1.1 Quan sát hình thái, sinh lý 4.1.2 Kết hóa sinh với Kit API 20E 4.1.3 Kết thử nghiệm enzyme 4.2 Kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy S marcescens SH1 4.2.1 Đƣờng cong tăng trƣởng môi trƣờng Nutrient broth 4.2.2 Ản 4.2.3 Ảnh hƣởng nguồn Cacbon lên phát triển S marcescens SH1 4.3 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy S marcescens SH1 4.3.1 Ảnh hƣởng pH lên phát triển S marcescens SH1 4.3.2 Ản 4.3.3 Ảnh hƣởng mật độ cấy giống lên phát triển S mar 4.3.4 Ảnh hƣởng việc bổ sung đệm lên phát triển S mar 4.3.5 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng S marcescens SH1 môi trƣờ CHƢƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 5.2 Kết Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens 15 Bảng 2.2 Đặc điểm loài thuộc chi Serratia 16 Bảng 2.3 Tỉ lệ loài Serratia phân lập đƣợc từ môi trƣờng khác .18 Bảng 2.4 Tỉ lệ chủng Serratia marcescens phân lập đƣợc từ môi trƣờng khác 18 Bảng 3.1 Các tiêu định danh S marcescens SH1 Kit API 20E 40 Bảng 3.2 Hàm lƣợng % nitơ tổng nguồn nitơ 44 Bảng 3.3 Thành phần môi trƣờng nguồn nitơ khảo sát 44 Bảng 3.4 Thành phần môi trƣờng nguồn cacbon khảo sát 45 Bảng 3.5 Tỉ lệ mật độ giống khảo sát 48 Bảng 4.1 Kết sinh hóa Kit API chủng S marcescens SH1 .52 Bảng 4.2 Mật độ tế bào (cfu/ml) sử dụng nguồn nitơ 57 Bảng 4.3 Mật độ tế bào (cfu/ml) sử dụng nguồn Cacbon 59 Bảng 4.4 Mật độ tế bào (cfu/ml) với độ pH 60 Bảng 4.5 Mật độ tế bào (cfu/ml) với điều kiện lắc 61 Bảng 4.6 Mật độ tế bào (cfu/ml) với tỉ lệ cấy giống 63 Bảng 4.7 Mật độ tế bào (cfu/ml) với nồng độ đệm môi trƣờng nuôi cấy .64 Bảng 4.8 Các thông số động học nuôi cấy S marcescens SH1 môi trƣờng .66 Bảng 4.9 Tính tốn giá thành mơi trƣờng 67 Bảng 4.10 Chi phí sản xuất sinh khối mơi trƣờng 67 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Serratia marcescens dƣới kính hiển vi .13 Hình 2.2 Khuẩn lạc S.marcescens môi trƣờng XLD 17 Hình 2.3 Khuẩn lạc S marcescens NA 17 Hình 2.4 Quy trình cơng nghệ lên men thu sinh khối 24 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa S marcescens SH1 35 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn thành phần cho môi trƣờng tốt cho phát triển S marcescen SH1 36 Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát điều kiện ni cấy 37 Hình 4.1 Khuẩn lạc S marcescens SH1 môi trƣờng NA 50 Hình 4.2 Kết nhuộm Gram 51 Hình 4.3 Kết sinh hóa Kit API 20E 52 Hình 4.4 Thử nghiệm hoạt tính lipase SH1 Tween 20 54 Hình 4.5 Thử nghiệm hoạt tính protease 54 Hình 4.6 Khả phân giải chitin 55 Hình 4.7 Đƣờng cong tăng trƣởng S marcesces SH1 mơi trƣờng NB 56 Hình 4.8 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ lên phát triển S marcescens SH1 57 Hình 4.9 Ảnh hƣởng nguồn Cacbon lên phát triển S marcescens SH1 58 Hình 4.10 Ảnh hƣởng pH lên phát triển S marcescens SH1 60 Hình 4.11 Ảnh hƣởng Oxy lên phát triển S marcescens SH1 61 Hình 4.12 Ảnh hƣởng tỉ lệ cấy giống lên phát triển S marcescens SH1 62 Hình 4.13 Ảnh hƣởng việc bổ sung đệm lên trình lên men phát triển S marcescens SH1 64 v Đồ án tốt nghiệp Hình 4.14 Đƣờng cong tăng trƣởng S marcescens SH1 môi trƣờng NB môi trƣờng 65 vi Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ xa xưa người biết sử dụng vi sinh vật đời sống ngày Các trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua… ứng dụng đặc tính sinh học nhóm vi sinh vật Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trị vi sinh vật việc ứng dụng sản xuất đời sống ngày rộng rãi có hiệu Ví dụ việc chế vắc xin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh Sử dụng vi hại sinh vật việc tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật không gây môi trường, làm cân sinh thái Trong tự nhiên, vi sinh vật có lợi cịn có vi sinh vật gây hại, ví dụ nhóm vi sinh vật gây bệnh cho người, động vật thực vật, lồi gây nhiễm nước, thực phẩm Nhưng ta nắm vững mặt lợi hay hại nó, ta đưa biện pháp khoa học để phát huy mặt lợi hạn chế mặt hại chúng gây Serratia marcescens biết đến loài vi khuẩn hội, bên cạnh biết đến với nhiều khả ứng dụng công nghệ sinh học khả diệt sâu, khả kháng khuẩn kháng nấm hợp chất thứ cấp sinh ra… Ngày để tăng suất sản lượng trồng trọt người dân thường sử dụng loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học Tuy nhiên, việc sử dụng đem lại lợi ích trước mắt mà khơng đảm bảo thâm canh bền vững, bên cạnh đó, sản phẩm làm cho đất đai ngày bị ô nhiễm, diệt trừ nhiều lồi thiên địch có lợi cho trồng, cân sinh thái đất số vi sinh vật đất bị tiêu diệt Các thuốc trừ sâu hóa học tồn dư lâu, chúng không dễ dàng bị phân hủy dẫn đến tình trạng tồn dư tích đọng lại, ngấm sâu vào lòng đất nước gây hại cho động vật, trồng mà người sống sống gần Nếu người hoăc loài động vật ăn loại Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG Thành phần mơi trường: - Mơi trường Nutrient broth [NB] (gam/lít) Meat extract Peptone - Mơi trường Peptone glycerol [PG] (gam/lít) Glycerol Peptone - Mơi trường thử nghiệm hoạt tính lipase (Gram/Lít) Glucose Yeast extract Tween 20 NH4Cl K2HPO4 MgCl2 CaCl2 pH cuối 25 C 7,0 ± 0,2 - Mơi trường gelatine (Gram/Lít) Gelatine Agar - Mơi trường casein (Gram/Lít) Casein Agar - Mơi trường thạch huyền phù chitin Dịch huyền phù chitin 1% Agar Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: SỐ LIỆU THỐNG KÊ  Đường chuẩn tế bào SH1  Đường cong tăng trưởng S marcescens môi trường NB Summary Statistics for log mật độ tế bào môi trường NB THOI GIAN 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Đồ án tốt nghiệp 28 30 32 34 36 Total ANOVA Table for Log mật độ tế bào môi trường NB by thời gian Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by thời gian Method: 95.0 percent LSD THOI GIAN Đồ án tốt nghiệp  Thí nghiệm khảo sát nguồn Nitơ Summary Statistics for log mật độ tế bào NGUON NITO Casein enzyme hydrolysale Peptone Tryptone Yeast extract Total ANOVA Table for log mật độ tế bào by nguồn nito Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by nguồn Nito Method: 95.0 percent LSD NGUON NITO Casein enzyme hydrolysale Tryptone Peptone (ĐC) Yeast extract Contrast Casein enzyme hydrolysale - Peptone Casein enzyme hydrolysale - Tryptone Casein enzyme hydrolysale - Yeast extract Peptone – Tryptone Peptone - Yeast extract Tryptone - Yeast extract Đồ án tốt nghiệp  Thí nghiệm khảo sát nguồn cacbon Summary Statistics for log mật độ tế bào NGUON CACBON Glucose Glycerol Không bổ sung cacbon Maltose Mannitol Sucrose Total ANOVA Table for log mật độ tế bào by nguồn cacbon Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by nguồn cacbon Method: 95.0 percent LSD NGUON CACBON Không bổ sung cacbon Glycerol Maltose Manitol Glucose Sucrose Đồ án tốt nghiệp Contrast glucose – glycerol glucose - khong bo sung glucose – maltose glucose – manitol glucose – sucrose glycerol - khong bo sung glycerol – maltose glycerol – manitol glycerol – sucrose khong bo sung – maltose khong bo sung – manitol khong bo sung – sucrose maltose – manitol maltose – sucrose manitol – sucrose  Thí nghiệm khảo sát pH Summary Statistics for log mật độ tế bào DO Ph Count pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 pH 8.0 Total ANOVA Table for log mật độ tế bào by độ pH Source Between groups Within groups Total (Corr.) Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by độ pH Method: 95.0 percent LSD DO pH pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 pH 8.0 Contrast pH pH pH pH pH pH  Khảo sát điều kiện Oxy Summary Statistics for log mật độ tế bào SO VONG LAC 120v/p 150v/p 180v/p 210v/p KHONG LAC Total Cou ANOVA Table for log mật độ tế bào by số vòng lắc Source Between groups Within groups Total (Corr.) Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by số vòng lắc Method: 95.0 percent LSD SO VONG LAC KHONG LAC 120v/p 150v/p 210v/p 180v/p Contrast 120v/p - 150v/p 120v/p - 180v/p 120v/p - 210v/p 120v/p - KHONG LAC 150v/p - 180v/p 150v/p - 210v/p 150v/p - KHONG LAC 180v/p - 210v/p 180v/p - KHONG LAC 210v/p - KHONG LAC  Khảo sát mật độ cấy giống Summary Statistics for log mật độ tế bào TI LE CAY GIONG 0,5% 1,0% 1,96% 3,84% 7,4% Total Count Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for log mật độ tế bào by tỉ lệ cấy giống Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by tỉ lệ cấy giống Method: 95.0 percent LSD Đồ án tốt nghiệp  Khảo sát nông độ đệm cổ sung vào môi trường Summary Statistics for log mật độ tế bào NONG C DO DEM 0,01M 0,02M 0,05M 0,1M KHONG DEM Total ANOVA Table for log mật độ tế bào by nồng độ đệm Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by nồng độ đệm Method: 95.0 percent LSD NONG DO DEM KHONG DEM 0.02M 0,05M 0,1M 0,01M 10 Đồ án tốt nghiệp Contrast 0,01M 0,01M 0,01M 0,01M 0,02M 0,02M 0,02M 0,05M 0,05M 0,1M - KHONG DEM  - 0,02M - 0,05M - 0,1M - KHONG DEM - 0,05M - 0,1M - KHONG DEM - 0,1M - KHONG DEM Đường cong tăng trưởng S.marcescens SH1 môi trường Summary Statistics for log mật độ tế bào THOI Count GIAN 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Total 11 Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for log mật độ tế bào by thời gian Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for log mật độ tế bào by thời gian Method: 95.0 percent LSD THOI GIAN 12 ... trọng chủng Serratia marcescens sản phẩm trao đổi chất Serratia marcescens mà em chọn đề tài: ? ?Thiết lập môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia marcescens. .. chất dinh dưỡng môi trường Lượng sinh khối đạt pha ổn định gọi hiệu suất sản lượng Sản lượng phụ thuộc vào tính chất sốlượng chất dinh dưỡng sử dụng vào điều kiện ni cấy Đó sai khác sốlượng vi khuẩn. .. vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy (như chất dinh dưỡng cần thiết) điều kiện nuôi cấy nhiệt độ, pH, điều kiện thơng khí, thời gian ni cấy? ?? Vấn đề đặt nên thu sinh khối giai đoạn tốt chất