Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn serratia marcescens sh1​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1051110139 :TRẦN LÂM TÚ QUYÊN Lớp: 10DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỞI CẢM ƠN Em xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức tảng, kinh nghiệm quý báu cho em suốt trình học tập làm đồ án tốt nghiệp Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hồi Hương, người đáng kính, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em nội dung kỹ năng, phương pháp, cách thức tiến hành thí nghiệm để em hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành thầy Nguyễn Trung Dũng tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình em thực đồ án phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án tốt nghiệp em Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ln ủng hộ, thương u dành cho điều tốt đẹp suốt trình học tập sống Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Sinh viện thực Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, số liệu kết trung thực Nếu phát có gian lận nào, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung đồ án Trường Đại học Công Nghệ TP HCM không liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền gây q trình thực TP.Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Sinh viên thực Đồ án tốt nghiệp Mở Đầu Tính cấp thiết đề tài Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn thực vật, vi sinh vật, động vật có xương sống khơng xương sống nguồn có giá trị hợp chất hoạt tính sinh học Một số lượng lớn loại thuốc phát triển ngành y từ sản phẩm tự nhiên (Amador cộng 2003) Kể từ phát thành công việc điều trị peniciline, vi sinh vật sử dụng nguồn đặc biệt tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng ứng dụng điều trị chất chuyển hóa vi sinh vật cung cấp hội cho việc phát kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch cấy ghép, tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain mevastatin) tác nhân chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin pentostatin) Từ khoa học đại bắt đầu, hợp chất thứ cấp tự nhiên chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ từ vi sinh vật sử dụng việc làm thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm , Nhưng sau đó, hợp chất thứ cấp tự nhiên nghiên cứu sâu cấu trúc hóa học cách tổng hợp phương pháp hóa học, người ta cho chúng bền hơn, sản xuất quy mơ lớn chi phí sản xuất thấp Tuy nhiên, vấn đề ô nhiễm môi trường ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây hợp chất tổng hợp hóa học bắt đầu quan tâm So với hợp chất thứ cấp từ thực vật động vật hợp chất từ vi sinh vật ngày quan tâm phát triển, vi sinh vật yếu tố tự nhiên an toàn để sử dụng, sản xuất quanh năm điều kiện địa lý khác tăng trưởng nhanh chóng vi sinh vật nên làm giảm thời gian sản xuất xuống vài ngày So với nguồn khác từ thực vật động vật hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật dễ dàng kiểm soát dự đoán sản lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984) Trong sắc tố từ vi sinh vật hợp chất prodigiosin biết đến với ý nghĩa quan trọng Đồ án tốt nghiệp Một số lồi Serratia, đặc biệt lồi Serratia marcenscens có khả tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams Qadri, 1980, Kobayashi El-Barrad, 1996; Press cộng sự, 1997; Someya cộng sự, 2000; Roberts cộng sự, 2005) Prodigiosin sắc tố màu đỏ, có hoạt tính kháng vi sinh vật bắt đầu nghiên cứu từ năm 1960, thu hút nhiều quan tâm khả sử dụng làm màu tự nhiên ứng dụng lĩnh vực bảo vệ thực vật hoạt chất kháng ức chế miễn dịch chống khối u (D’Alessio Rossi, 1996; Azuma cộng sự, 2000; Bennet Bentley, 2000; Melvin cộng sự, 2000, Tsuji cộng sự, 1990; Kataoka cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia cộng sự, 1997) Dựa sở lợi ích quan trọng hợp chất prodigiosin tách từ việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN S MARCESCENS SH1” tiến hành nhằm tìm mơi trường điều kiện nuôi cấy để tổng hợp prodigiosin cao Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát loại môi trường tổng hợp prodigiosin cao Khảo sát điều kiện nuôi cấy tổng hợp prodigiosin cao Ý nghĩa khoa học Tìm mơi trường nuôi cấy tốt để tổng hợp prodigiosin nhiều Thiết lập điều kiện nuôi cấy tối ưu để tổng hợp prodigiosin nhiều Ý nhĩa thực tiễn Prodigiosin hợp chất thứ cấp vi sinh vật nghiên cứu phát triển dược phẩm nên bán thị trường với giá cao Thành công đề tài góp phần vào việc tìm mơi trường tốt điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất ứng dụng hợp chất prodigiosin Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1 Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp chất tạo từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, thường gọi chất có hoạt tính sinh học đóng vai trị điều hòa quan hệ sinh thái chủ thể với tác động lên chủ thể môi trường xung quanh Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật hợp chất vi sinh vật tạo từ trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp 1.1.2 Triển vọng tiềm sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật sử dụng thời gian dài cho sản xuất phân tử sinh học thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine tác nhân thị Có quan tâm ngày tăng ngành công nghiệp thực phẩm việc sử dụng thành phần tự nhiên Các thành phần, chẳng hạn hợp chất thứ cấp, xem tự nhiên xuất phát từ nguồn gốc sinh học động vật, thực vật vi sinh vật Hợp chất thứ cấp vi sinh vật sử dụng ngành cơng nghiệp chế biến cá, ví dụ để tăng màu hồng cá hồi nuôi Hơn nữa, số hợp chất tự nhiên có tiềm thương mại để sử dụng chất chống oxy hóa Ngành công nghiệp sản xuất số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng thực phẩm, mỹ phẩm vật liệu dệt Trong tự nhiên phong phú hợp chất vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men vi khuẩn) Trong sắc tố tự nhiên vi sinh vật cung cấp số lượng hợp chất lớn như: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin cụ thể monascin, violacein indigo (Dufosse, 2009) Các loại hợp chất có tiềm khai thác cao, trình sản xuất đơn giản, đa dạng di truyền vi sinh vật, dễ dàng tối ưu hóa quy trình cơng nghệ (Juailova cộng sự, 1997) Bên cạnh đó, số vi sinh vật có khả sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm chi Monascus (Hajjaj cộng sự, 2000) Serratia (Williams cộng sự, 1971a) Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia Phaffia có khả sản xuất số lượng lớn hợp Đồ án tốt nghiệp chất thứ cấp (Krishna, 2008), kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả gây chết kìm hãm vi sinh vật phát triển, số vi sinh vật (fungi, actmomycetes, bacteria) tạo ra, thành tựu quan trọng việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng Bảng 1.1 tóm tắt số hợp chất thứ cấp sản xuất vi sinh vật Bảng 1.1 Danh sách số hợp chất thứ cấp sản xuất vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ Ứng dụng cấp Kiểu tác động ức chế Penicillium notatum, Ức chế tụ cầu Ức chế tạo polymer Penicillium khuẩn, nhiễm vách tế bào vi khuẩn, trùng kỵ khí, ức chế hấp thu amino giang mai, hen acid protein, ức chế suyễn tạo enzyme Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối Gram âm ram số amino acid vào dương Trị bệnh protein, tác động lên lao, bệnh viêm hệ enzyme vi màng não, ho gà khuẩn tham gia chrysogenum Penicillin Streptomyces griceus Streptomycin chuyển pyruvate vào chu trình Creb… Steptomyces Ức chế Ức chế đặc hiệu sinh venezuelae bệnh lỵ, sốt cao, tổng hợp protein vi sốt phát ban khuẩn liên quan đến Chloramphenicol peptidyl transferase tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide Đồ án tốt nghiệp Streptomyces aureomycin Tetracilin Ức chế phổ rộng Ức chế tổng hợp vi khuẩn Gram protein âm, Gram dương Streptomyces erythraeus Erythromycin Chữa bệnh tụ ức chế vi khuẩn Gram cầu khuẩn âm Gram dương streptococcal gây Streptomyces fradiae Tác dụng vi Neomycin Hơi độc khuẩnn Gram âm Gram dương Streptomyces kanamycetius Kanamycin Điều trị lao, ức Tác động giống chế vi khuẩn streptomycin Gram âm neomycin Gram dương Streptomyces lavendulae 1.2 Điều trị bệnh lao Cycloserine Cản trở tổng hợp vách tế bào Tổng quan prodigiosin 1.2.1 Khái niệm prodigiosin Prodigiosin tripyrrole phát lần khuẩn lạc đặc trưng vi khuẩn Serratia marcescens Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa điều kỳ diệu Prodigiosin tìm thấy dạng túi bên tế bào tế bào liên kết, dạng hạt bên tế bào (Kobayashi Ichikawa, 1991) Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin chất chuyển hóa thứ cấp, sản xuất vi khuẩn Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli Streptomyces longisporus (Khanafari cộng sự, 2006) Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học hợp chất đại diện prodigiosin Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin Mãi đến năm 1960, cơng thức hóa học xác prodigiosin tổng hợp Serrattia marcescens biết đến (Rapoport Holden, 1962) Do tiến nhanh chóng khoa học phân tích quang phổ năm tiếp theo, mà cấu trúc prodigiosin dần nghiên cứu rõ ràng (Hesse, 2000) Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có cơng thức phân tử C20H25N3O trọng lượng phân tử 323,44 Da (Harris cộng sự, 2004; Song cộng sự, 2006; Williamson cộng sự, 2006) Prodigiosin alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành khung pyrrolylpyrromethane, hai vịng đầu liên kết trực tiếp với nhau, cịn vịng thứ ba gắn vào thơng qua cầu nối methene (Qadri Williams, 1972; Gerber, 1975) Cấu trúc prodigiosin có bảy liên kết đơi miêu tả tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008) Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng không tan nước Prodigiosin tan tương đối alcohol ether; bên cạnh đó, dễ tan chloroform, methanol, acetonitrile DMSO (Grimont cộng sự, 1977; Khanafari cộng sự, 2006) Bảng 1.2 Xác định cấu trúc số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Loài Danh pháp Tên sắc tố prodigiosin Serratia marcescens Prodigiosin Serratia marcescens Norprodigiosin Nocardia (Actinomadura) Nonylprodigiosin madurae Trọng lƣơng phân tử công thức 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da C20 methoxy prodigiosene H25 N30 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da hydroxy-prodigiosene C10 H23N3O 2-Nonly-6- 363,5 Da methoxyprodigiosene C23H31 N3O Phần trăm hàm lƣợng prodigiosin môi trƣờng (%) Đồ án tốt nghiệp 120 100 100 80 60 45.9 30.2 40 40 34.7 38.1 20 MT2 MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + Sor Man Mal Suc TB Môi trƣờng MT2 nguồn đƣờng Hình 3.15 Kết hàm lượng prodigiosin loại đường Qua kết hình 3.15 cho thấy hàm lượng prodigiosin môi trường không thêm đường cao so với tất môi trường bổ sung đường, môi trường bổ sung Sorbitol cho hàm lượng prodigiosin thấp Theo Khanafari cộng (2006), trình sản xuất prodigiosin Serratia macecens giảm glucose loại đường lên men khác có giảm pH canh trường ni cấy, kết thí nghiệm với kết Khanafari cộng Từ đây, người thực đề tài định không bổ sung đường vào môi trường huyền phù đậu phộng peptone Như số nguồn cacbon bổ sung, 1% dầu hướng dương làm tăng hàm lượng prodigiosin cao (32,5% so với đối chứng) Do mơi trường lên men thu prodigiosin chọn MT3 = MT1 (10% đậu phộng) + 5% peptone + 1% dầu hướng dương Môi trường MT3 sử dụng cho khảo sát 70 Đồ án tốt nghiệp 3.5 Xác định điều kiện lên men tổng hợp prodigiosin 3.5.1 Xác định tỉ lệ cấy giống môi trường MT3 Tỉ lệ cấy giống quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến trình tăng trưởng tế bào vả sản xuất sắc tố Sau 48 tăng sinh, thu mẫu, tiến hành trích ly dung mơi Ethanol:HCl (95:5), sau đo OD535nm dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin mẫu thu Kết tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến trình tổng hợp prodigiosin thể bảng 3.8 hình 3.16 Bảng 3.8 Hảm lượng prodigiosin môi trường MT3 qua tỉ lệ cấy giống Tỉ lệ cấy giống Hàm lượng 1% 3% 5% 7% prodigiosin (mg/ml) 8,24b±0,58 9,4a± 0,12 7,03c±0,54 5,57d ± 0,52 Hàm lƣợng prodigiosin (% so với đối chứng) 140 120 100 114 100 85 80 68 60 40 20 1% 3% 5% 7% Tỉ lệ cấy giống Hình 3.16 Kết hàm lượng prodigiosin qua tỉ lệ cấy giống 71 Đồ án tốt nghiệp Trong nghiên cứu này, quan sát thấy tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến trình sản xuất prodigiosin chủng SH1 Một loạt thử nghiệm tỉ lệ cấy giống 1%, 3%, 5%, 7% cho thấy khác biệt hàm lượng prodigiosin, kết thấy tỉ lệ cấy giống 3% ≈ 3,84x108 (cfu/ml) cho hàm lượng prodigiosin cao đạt 9,4 ± 0,12 (mg/ml) Vì vậy, từ kết nghiên cứu người thực đề tài định chọn tỉ lệ cấy giống 3% làm thí nghiệm tỉ lệ cấy giống tốt 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng vận tốc lắc đến trình tổng hợp prodigiosin mơi trường MT3 Mỗi vi sinh vật có điều kiện oxi khác nhau, có chủng hiếu khí, có chủng kị khí có chủng kỵ khí tùy nghi, biết điều kiện cần thiết góp phần làm tăng q trình sinh trưởng vi sinh vật Oxy ảnh hưởng đến trình tổng hợp prodigiosin S.marcescens, có ghi nhận prodigiosin sản xuất tốc độ lắc 150 vòng/phút (Krishna, 2008) 200 vòng/phút (Wei cộng sự, 2005) Từ đây, người thực đề tài thí nghiệm vịng lắc cho kết bảng 3.9 hình 3.17 Bảng 3.9 Hàm lượng prodigiosin môi trường MT3 qua vận tốc lắc Vận tốc lắc (vịng/phút) Khơng lắc 150 180 180/150 5,06b±0,31 6,11a ± 0,07 Hàm lượng prodigiosin (mg/ml) 2,75d±0,35 3,65c± 0,23 72 Hàm lƣợng prodigiosin (% so với đối chứng) Đồ án tốt nghiệp 180 160 140 120 100 80 60 40 20 167 139 100 75 không lắc 150 180 180->150 Vận tốc lắc (vịng/phút) Hình 3.17 Kết hàm lượng prodigiosin qua vận tốc lắc Kết hình 3.17 cho thấy có khác biệt hàm lượng prodigiosin thu vận tốc lắc khác Không lắc hiển nhiên hàm lượng prodigiosin tổng hợp 75% so với đối chứng 100%, giảm 25% Ở tốc độ lắc 180 vòng/phút hàm lượng prodigiosin tăng 39% so với đối chứng 150 vịng/phút Điều cho thấy mơi trường chứa huyền phù đậu phộng độ nhớt cao môi trường lỏng thông thường nên nhu cầu oxy cao Khi giữ nguyên vận tốc lắc 180 vòng/phút 24 đầu giảm 150 vòng/phút 24 sau hàm lượng prodigiosin cao tăng 67% so với đối chứng Có thể giải thich rằng: prodigiosin hợp chất thứ cấp, trình tổng hợp xảy hai pha: pha tăng trưởng pha tổng hợp Trong pha tăng trưởng cần cung cấp oxy cho tế bào, mà độ nhớt môi trường NB thấp độ nhớt mơi trường đậu phộng cao gấp nhiều lần so với NB chình vỉ để thu sinh khối tốt cần tăng vận tốc lắc lên 180 vịng/phút Ở giai đoạn sau, q trình tổng hợp prodigiosin có gắn kết protein lên lớp màng ngồi tế bào (Allen cơng sự, 1983), vận tốc lắc lớn ảnh hưởng đến gắn kết nên cần giảm vận tốc xuống 150 73 Đồ án tốt nghiệp vòng/phút Kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu trước Vì vậy, từ kết nghiên cứu người thực đề tài định chon điều kiện 24 đầu lắc 180 vịng/phút 24 sau lắc 150 vịng/phút làm thí nghiệm 3.6 Động học trình tổng hợp prodigiosin môi trƣờng MT3 Kết khảo sát động học tổng hợp prodigiosin chủng vi khuẩn SH1 thể hình 3.18 Kết tính tốn tốc độ sinh trưởng cực đại μmax = 0,157 (h-1) pha log từ đến 12 Thời gian thu prodigiosin từ 36 không trễ 48 Trong tổng hợp prodigiosin bắt đầu tứ 10 thực mạnh từ 36 – 48 với tốc độ tổng hợp prodigiosin cực đại qpmax= 0,3 (mg/ml/h) Quá trình tổng hợp sắc tố chủng vi sinh vật xảy không song song với trình tổng hợp sinh khối, mà trễ pha Như tế bào vào pha cân động trình tổng hợp mạnh prodigiosin thực bắt đầu Đến 48 trình tổng hợp sinh khối bắt đầu giảm mạnh q trình tổng hợp prodigiosin cịn nằm pha cân Chỉ sau 54 sắc tố giảm mạnh pH mơi trường thay đổi làm cho cấu trúc sắc tố thay đổi 74 Log mật độ tế bào (Log cfu/ml) 10.5 9.00 8.00 10 7.00 9.5 6.00 5.00 8.5 4.00 3.00 2.00 7.5 1.00 0.00 20 40 60 Hàm lƣợng prodigiosin mẫu (mg/ml) Đồ án tốt nghiệp 80 Thời gian (giờ) Series2 Log mật độ tế bào Hàm lượng prodigiosin(mg/ml) Series1 Hình 3.18 Đường cong tăng trưởng tế bào tổng hợp prodigiosin SH1 môi trường MT3 75 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Điều kiện nhân giống chủng Serratia marcescens mơi trường NB có pH nằm khoảng 6,2 đến 8,2, có điều kiện hiếu khí lắc 150 vịng/phút có tỉ lệ cấy giống 1% Trong q trình lên men thu prodigiosin, mơi trường huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lượng prodigiosin 248,4% so với môi trường peptone glycerol 100% Bổ sung gelatin không làm tăng mà giảm prodigiosin tổng hợp đáng kể tăng độ nhớt môi trường Bổ sung peptone 5% vào môi trường MT1 (10%) làm tăng hàm lượng prodigiosin tổng hợp lên đến 150,4%, tăng 50,4% so với môi trường MT (10%) Trong số nguồn C bổ sung, đường không làm tăng prodigiosin tổng hợp, bổ sung dầu hướng dương 1% làm tăng prodigiosin tổng hợp lên đến 132,5%, tăng 32,5% so với môi trường MT2 (MT1 bổ sung 5% peptone) Tỉ lệ cấy giống 3% tương đương 3,84x108 (cfu/ml) tỉ lệ cho hàm lượng prodigiosin tăng 14% so với tỉ lệ 1% làm đối chứng Vận tốc pha tăng trưởng (24 đầu) 180 vòng/phút pha tổng hợp (24 sau) 150 vòng/phút làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp lên đến 167%, tăng 67% so với vận tốc 150 vòng/phút làm đối chứng Đường cong tăng trưởng tế bào tổng hợp prodigiosin cho thấy nuôi cấy vi khuẩn thu prodigiosin môi trường chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton 1% dầu hướng dương, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút 24 đầu sau giảm cịn 150 vịng/phút Thời điểm thu hồi prodigiodin 36 kết thúc không muộn 48 Kết hợp tất yếu tố điều kiện tốt cho q trình ni cấy chủng SH1 sản xuất prodigiosin 76 Đồ án tốt nghiệp 4.2 Kiến nghị Cần nghiên cứu thêm số vấn đề sau: - Khảo sát thêm nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy để sản xuất prodigiosin nhiều - Thử nghiệm môi trường điều kiện nuôi cấy thu điều kiện kiểm soát nhiệt độ để hàm lượng prodigiosin tổng hợp ổn định - Tối ưu hóa quy trình trích ly tinh prodigiosin - Khảo sát kháng nấm nhiều loại nấm bệnh khác phù hợp - Prodigiosin thu dạng thơ, cần nghiên cứu q trình tinh prodigiosin dạng tinh để có giá trị cao - Prodigiosin sau tinh sạnh đem thử nghiệm khả diệt tế bào ung thư - Prodigiosin sau tinh sạnh đem khảo sát khả miễn dịch 77 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Hiếu Dân, (2013) Khảo sát hoạt tính sinh học vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN hợp chất màu dạng prodigiosin tổng hợp vi khuẩn Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hoàng Anh Kha, (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Amaya D.B.R (2001) A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, OMNI Research, ILSI Press, United States of America, pp -71 Aguilera M.M and Smart J.R (1993) Development, reproduction, and pathogenicity of Steinernema scapterisci in monoxenic culture with different species of bacteria, J Invertebr, Pathol, 62: 289-294 Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006) Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological Sciences, (1): 1-13 Bauernfeind J.C (1981) Natural food colors Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors, Bauernfeind J.C., Academic Press, New York, 1-45 Bizio B (1823) Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo Bellani sopra il fenomeno della polenta porporina Biblioteca Italiana o sia Giornale di Letteratura, Scienze e Arti, 30: 275-295 Brigida P.V de Q and Itamar S de M (2006) Antagonism of Serratia marcescens towards Phytophithora parasitica and its effects in promoting the growth of Citru s, Brazilian Journal of Microbiology, 37: 448-450 Casullo de Araújo, Helvia W., K Fukushima, and Galba M Campos Takaki "Prodigiosin production by Serratia marcescens UCP 1549 using renewableresources as a low cost substrate." Molecules 15.10 (2010): 6931-6940 78 Đồ án tốt nghiệp Chang, Chia-Che, et al "Development of natural anti-tumor drugs by microorganisms." Journal of bioscience and bioengineering 111.5 (2011): 501-511 Chidambaram K.V., Perumalsamy L (2009) An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, Vol 5(3): 49-61 Counsell J.N., Jeffries G.S and Knewstubb C.J (1979) Some other natural colors and their applications, Natural Colors for Foods and Other Uses, Counsell J.N and Dunastable J.A., Eds Applied Science, London, 122-151 Dauenhauer S.A., Hull R.A and Williams R.P (1984) Cloning and expression in Escherichia coli of Serratia marcescens genes encoding prodigiosin biosynthesis, Journal of Bacteriology, 158: 1128-1132 David R Caprette (2012) Enterobacteriaceae: Serratia marcescens Rice University Houston, Texas, US Estrada, Castro, Regina Basurto-Ríos, Jorge Toledo, Jorge E Ibarra (2012) Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae, Florida Entomologist, 95(1):120-127 Feng J.S., Webb J.W and Tsang J.C (1982) Enhancement by sodium dodecyl sulfate of pigment fonnation in Serratia marcescens O8, Appl, Environ, Microbiol, 43: 850-853 Florencio J.A., Soccol C.R., Furianetto L.F., Bonfim T.M.B., Krieger N., Baron M and Fontana J.D (1998) A factorial approach for a sugarcane juicebased low cost culture medium: increasing the astaxanthin production by the red yeast Phaffia rhodozyma, Bioprocess Eng, 19,161-164 Fodor A., Fodor A.M., Forst S., Hogan J.S., Klein M.G., Lengyel K., Saringer G., Stackebrandt E., Taylor R.A.J and Lehoczky E (2010) Comparative analysis of antibacterial activities of Xenorhabdus species on related and non-related bacteria in vivo, J Microbiol, Antimicrob, 2: 36-46 79 Đồ án tốt nghiệp Furstner A (2003) Chemistry and biology of roseophilin and the prodigiosin alkaloids: A survey of the last 2500 years, Chem Int Ed Engl, 42: 3582-3603 Khanafari, Anita, Mahnaz M Assadi, and Fatemeh A Fakhr "Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens." Online Journal of Biological Sciences 6.1 (2006): Gargallo D., Loren J.G., Guinea J., Vinas M (1987) Glucose-6-phosphate dehydrogenase alloenzymes and their relationship to pigmentation in Serratia marcescens, Appl Environ Microbiol, 53: 1983-1986 Gaughran E.R.L (1969) From superstition to science the history of a bacterium,Transactions of the New York Academy of Sciences, 31:3-24 Gauthier, M J "Alteromonas rubra sp nov., a new marine antibiotic-producing bacterium." International Journal of Systematic Bacteriology 26.4 (1976): 459-466 Gillen A.L and Gibbs R (2011) Serratia marcescens: The Miracle Bacillus, Department of Biology and Chemistry, Liberty University Giri, Anuradha V., et al "A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil." BMC microbiology 4.1 (2004): 11 Goldschmidt M.C and WiIliams R.P (1968) Thiamine-induced Formation of the Monopyrrole Moiety of Prodigiosin, J Bacteriol, 96: 609-616 Grimont, Patrick AD, and Francine Grimont "The genus Serratia." Annual Reviews in Microbiology 32.1 (1978): 221-248 Gulani, Chandni, Sourav Bhattacharya, and Arijit Das "Assessment of process parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia marcescens and evaluation of its antimicrobial, antioxidant and dyeing potentials." Malaysian Journal of Microbiology 8.2 (2012): 116-122 Han S.B., Park S.H., Jeon Y.J., Kim Y.K., Kim H.M., Yang K.H (2001) Prodigiosin blocks T cell activation by inhibiting interleukin - 2Rα 80 Đồ án tốt nghiệp expression and delays progression of autoimmune diabetes and collagen induced arthritis, J Pharm Exp Ther, 299: 415-425 Hardjito L., Huq A., Colwell R.R (2002) The influence of environmental conditions on the production of pigment by Serratia marcescens, Biotechnol Bioprocess Eng, 7: 100-104 Harris K.P., Williamson R., Slater H., Cox A., Abbasi S., Foulds I., Simonsen T., Leeper J and Salmond P.C (2004) The Serratia gene cluster encoding biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, shows species and strain dependent genome context variation, Microbiol, 150: 3547-3560 Helvia W.C de A., Fukushima K and Gallba M.C.T (2010) Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable-Resources as a Low Cost Substrate, Molecules, 15: 6931-6940 Hiroaki M., Hiroyuki A., Masakatsu F., Takeji S., Teisuya T (1996) Industrial production of optically active intermediate in the synthesis of dialtizem with lipase, Seibutsu kogaku, 74: 273-288 Kataoka T., Magae J., Kasamo K., Yamanishi H., Endo A., Yamasaki M., Nagai K (1992) Effects of prodigiosin 25-c on cultured cell lines: Its similarity to monovalent polyether ionophores and vacuolar type H+-ATP ase inhibitor, J Antibiot, 45: 1618-1625 Khanafari A., Assadi M.M and Fakhr F.A (2006) Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13 Krishna J.G (2008) Pigment production by marine Serratia sp BTWJ8, PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology Cochin University of Science and Technology, Kerala, India Lawanson A.O and Sholeye F.O (1975) Inhibition of prodigiosin formation in Serratia marcescens by adenosine triphosphate, Experientia, 32: 439-440 Lewis S.M., Corpe W.A (1964) Prodigiosin producing bacteria from marine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17 81 Đồ án tốt nghiệp Iranshahi M., Shahverdi A.R., Mirjani R., Amin G., Shafiee A (2004) Umbelliprenin from Ferula persica roots inhibits the red pigment production in Serratia marcescens, Z Naturforsch, 59: 506-508 Johnson E.A., Lewis M.J and Grau C.R (1980) Pigmentation of Egg Yolks with Astaxanthin from the Yeast Phaffia rhodozyma Poultry Science, 59,1777-1782 Malpartida F., Niemi J., Navarrete R and Hopwood D.A (1990) Cloning and expression in a heterologous host of the complete set of genes for the biosynthesis of the Streptomyces coelicolor antibiotic undecylprodigiosin, Gene, 93: 91-99 Mandarville R.A (2001) Synthesis, Proton affinity and Anticancer properties of the prodigiosin group of natural product, Curr Med Chem, 1: 195-218 Ortega-Estrada, María De Jesús, et al "Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae." Florida Entomologist95.1 (2012): 120-127 Pérez-Tomás R and Viñas M (2010) New insights on the antitumoral properties of prodiginines, Curr Med Chem., 17: 2222-2231 Pfander H., Riesenz R and Nigglil U (1994) HPLC and SFC of carotenoids - scope and limitations, Pure Appl, Chem 66: 947-954 Phonnok, Sirinet, Wanlaya Uthaisang-Tanechpongtamb, and Benjamas Thanomsub Wongsatayanon "Anticancer and apoptosis-inducing activities of microbial metabolites." Electronic Journal of Biotechnology 13.5 (2010): 1-2 Qadri S.M.H and Williams R.P (1972) Induction of Prodigiosin Biosynthesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens, Appl Microbiol, 23: 704-709 Ramina M Samira Y.Y (2009) The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268-274 82 Đồ án tốt nghiệp Rosenzwcig W.D and Stotzky G (1980) Prodigiosin and the inhibition of Aspergillus niger by Serratia marcescens in soil, Soil Bioi Biochent, 12: 295296 Shahitha S and Poornima K (2012) Enhanced Production of Prodigiosin Production in Serratia Marcescens, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 02 (08): 138-140 Slater H., Crow M., Everson L and Salmond G.P.C (2003) Phosphate availability regulates biosynthesis of two antibiotics, prodigiosin and carbapenem, in Serratia via both quorum sensing-dependent andindependent pathways, Mol Microbiol, 47: 303-320 Tariq A.L and John J.P (2010) Molecular Characterization of Psychrotrophic Serratia marcescens TS1 Isolate form Apple Garden at Badran Kashmir, Journal of Agriculture and Biological Sciences, 6(3): 364-369 Thomson R.H (1962a) Melanins, Comparative Biochemist'y, Florkin M and Mason H.S., Vol III: Constituents of Life Part A, Academic Press, New York, 727-753 Turner J.M and Messenger A.J (1986) Occurrence, biochemistry, and physiology of phenazinc pigment production, Adv Microbial Physiol, 27, 211-275 Venil, Chidambaram Kulandaisamy, and Perumalsamy Lakshmanaperumalsamy "An insightful overview on microbial pigment, prodigiosin." Electronic Journal of Biology 5.3 (2009): 49-61 Wei Y.H., Chen W.C (2005) Enhanced production of prodigiosin-like pigment from Serratia marcescens SMΔR by medium improvement and oil supplementation strategies, J Biosci Bioeng, 99: 616-622 Williams R.P., Gott C.L and Qadri S.M.H (1971) Induction of pigmentation in non proliferating cells of Serratia marcescens by addition of single amino acids, J Bacteriol, 106,444-448 Williams R.P (1973) Biosynthesis of prodigiosin, a secondary metabolite of Serratia marcescens, Appl Microbiol, 25: 396-402 83 Đồ án tốt nghiệp Williamson N.R., Simonsen H.T., Ahmed R.A., Goldet G., Slater H., Woodley L., Leeper F.J., Salmond P.C (2005) Biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, in Serratia: identification of a novel 2-methyl-3-n-amylpyrrole (MAP) assembly pathway, definition of the terminal condensing enzyme, and implications for undecylprodigiosin biosynthesis in Streptomyces, Mol Microbiol, 56: 971-989 Williamson N.R., Fineram P.C., Leeper F.J., Salmond G.P.C (2006) The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines Nat Rev Microbiol, 4: 887-899 Zhang J., Shen Y., Liu J and Wei D (2005) Antimetastatic effect of prodigiosin through inhibition of tumor invasion, Biochem Pharmacol., 69: 407-414 TÀI LIỆU WEB http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/prodigiosin-serratiamarcescens,EMD_BIO-529685 http://www.scbt.com/datasheet-202298-prodigiosin.html http://www.biovision.com/prodigiosin-6686.html http://www.bioaustralis.com/productorder.php?prodid=BIAP1194&name=Prodigiosin&searchtermf=Antitumor http://www.biomerieuxusa.com/servlet/srt/bio/usa/dynPage?doc=USA_PRD_LST_G_PRD_USA_5& pubparams.sform=0 http://localhost/jsp/ident/index.jsp 84 ... marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN S MARCESCENS SH1” tiến hành nhằm tìm môi trường điều kiện nuôi cấy để tổng hợp prodigiosin. .. loại môi trường tổng hợp prodigiosin cao Khảo sát điều kiện nuôi cấy tổng hợp prodigiosin cao Ý nghĩa khoa học Tìm môi trường nuôi cấy tốt để tổng hợp prodigiosin nhiều Thiết lập điều kiện nuôi cấy. .. Dịch môi trường và điều kiện nuôi cấy định nồng độ prodigiosin tổng hợp Nghiên cứu dựa báo cáo trước tác giả ngồi nước để xác định mơi trường dinh dưỡng điều kiện ni cấy cho chủng phân lập phịng