Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN ENZYME CHITINASE Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Sinh viên thực hiện: Hai Trần Đức Vinh MSSV: 1051110243 Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 7/2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy kiến thức truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt năm đại học Tơi xin bày tỏ lịng cám ơn chân thành cô Nguyễn Thị Hai, người nhiệt tình, tận tụy dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ kiến thức chuyên ngành để tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người nhiệt tình hỗ trợ thiết bị, vật tư giúp đỡ tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Tơi cám ơn bạn phịng thí nghiệm đặc biệt người bạn nhóm ESS động viên, giúp đỡ tơi Và cuối cùng, hết, xin cám ơn ba mẹ, người hết lòng lo lắng, vất vả để tạo điều kiện cho học đến thực ước mơ Con xin cám ơn ba mẹ nhiều Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa cơng bố cơng trình trước Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng năm 2014 Sinh viên thực Trần Đức Vinh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Trichoderma 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Lịch sử phát triển 1.1.3 Đặc điểm chung Trichoderma 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái 1.1.3.2 Đặc điểm sinh trƣởng 1.1.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất Trichoderma 1.1.4 Vai trò sinh thái 10 1.1.5 Tính ứng dụng Trichoderma giới Việt Nam 10 1.1.6 Ứng dụng Trichoderma nông nghiệp 12 1.1.6.1 Bảo vệ thực vật 12 1.1.6.2 Cải thiện suất trồng 12 1.1.6.3 Trong xử lí mơi trƣờng 13 1.1.6.4 Trong công nghiệp thực phẩm 13 1.1.6.5 Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi 14 1.2 Cơ chế kiểm soát sinh học Trichoderma spp 14 1.2.1 Cạnh tranh 14 1.2.2 Kí sinh 15 1.2.3 Bất hoạt enzyme nấm bệnh 16 1.2.4 Tăng khả kháng thực vật 16 1.3 Những nghiên cứu enzyme chitinase 17 1.3.1 Giới thiệu chitin 17 1.3.1.1 Cấu trúc tính chất chitin 17 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.2 Lịch sử phát chitin 18 1.3.1.3 Sự phân bố chitin tự nhiên 19 1.3.1.4 Điều chế chitin 20 1.3.2 Giới thiệu enzyme chitinase 20 1.3.2.1 Đặc điểm phân bố 20 1.3.2.2 Cơ chế hoạt động chitinase 22 1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase 23 1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu chitinase 25 1.3.2.5 Ứng dụng enzyme chitinase 26 1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến enzyme chitinase sinh tổng hợp enzyme chitinase từ vi sinh vật 28 1.3.2.7 Những nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum Việt Nam giới .30 1.4 Sơ lƣợc bệnh thán thƣ ớt tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp 32 1.4.1 Bệnh thán thư ớt 32 1.4.1.1 Triệu chứng 32 1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh 33 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 34 2.1 Thời gian địa điểm 34 2.1.1 Thời gian 34 2.1.2 Địa điểm 34 2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu 34 2.2.1 Thiết bị dụng cụ 34 2.2.1.1 Thiết bị 34 2.2.1.2 Dụng cụ 34 2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 35 2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu 35 2.2.3.1 Môi trƣờng PDA 35 2.2.3.2 Mơi trƣờng định tính sinh tổng hợp chitinase 36 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.3 Môi trƣờng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase 36 2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 38 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp enyme chitinase Trichoderma 38 2.3.1.1 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma môi trƣờng thạch PDA 38 2.3.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma môi trƣờng thạch 38 2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử buồng đếm hồng cầu .40 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase 41 2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase .42 2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase phương pháp DNS .42 2.3.6 Phương pháp tủa enzyme cồn 45 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 46 2.3.8 Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất chitin đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 46 2.3.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 48 2.3.10 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 49 2.3.11 Khảo sát ảnh hưởng nguồn đường hàm lượng đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 51 2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh Collectotrichum sp 52 2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu 53 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 3.1 Kết khả phân giải chitin Trichoderma harzianum môi trƣờng thạch có chất cảm ứng chitin 1% 53 3.2 Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 55 3.3 Ảnh hƣởng nguồn chất chitin đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 60 iii Đồ án tốt nghiệp 3.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 62 3.5 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng ban đầu đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 65 3.6 Ảnh hƣởng nguồn đƣờng bổ sung đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 67 3.7 Hiệu khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt chitinase thu từ Trichoderma harzianum 68 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1 Kết luận 72 4.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNS Dinitrosalicylic acid GlacNac N-acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton MT Môi trƣờng NSC Ngày sau cấy PDA Potato D-glucose agar v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG STT BẢ 3 3 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH STT HÌNH 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 2.1 3.1 10 3.2 11 3.3 vii Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for HOAT TINH by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count A B C D PHỤ LỤC K: HOẠT TÍNH BY CƠ CHẤT Summary Statistics for HOAT TINH CO CHAT CT DC FU LC VT Total Count 3 3 15 ANOVA Table for HOAT TINH by CO CHAT Source Between groups Within groups Total (Corr.) Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for HOAT TINH by CO CHAT Method: 95.0 percent LSD CO CHAT DC FU LC VT CT PHỤ LỤC L: HOAT TÍNH BY NGAY NUOI CAY Summary Statistics for Hoat tinh Ngay nuoi cay Count 3 Total 21 3 10 Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for Hoat tinh by Ngay nuoi cay Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Hoat tinh by Ngay nuoi cay Method: 95.0 percent LSD Ngay nuoi cay 11 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC M: HOAT TINH BY pH Summary Statistics for HOAT TINH pH Cou nt Tot al 12 Avera ge 1.536 67 2.056 67 1.398 67 1.000 67 1.498 17 ANOVA Table for HOAT TINH by pH Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for HOAT TINH by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count 12 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC N: HOAT TINH BY NGUON DUONG VA TY LE BO SUNG Summary Statistics for hoat tinh Nguon duong va ty le bo sung C G0.1 G0.2 G0.3 S0.1 S0.2 S0.3 Total Analysis of Variance for HOAT TINH - Type III Sums of Squares Source MAIN EFFECTS A:nguon duong B:ty le bo sung RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) All F-ratios are based on the residual mean square error 13 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for HOAT TINH by ty le bo sung Method: 95.0 percent LSD ty le bo sung 0.1% 0.3% 0.2% Multiple Range Tests for HOAT TINH by nguon duong Method: 95.0 percent LSD nguon duong S G Analysis of Variance for HOAT TINH - Type III Sums of Squares Source MAIN EFFECTS A:nguon duong B:ty le bo sung INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC O: Kết đếm bào tử đĩa cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường PDA sau ngày Môi N Nguồ Nguồn 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC P: Hiệu khống chế nấm gây bệnh thán thư ớt chitinase thu từ Trichoderma harzianum ngày sau cấy ngày sau cấy 16 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Q: Kết thí nghiệm ảnh hưởng enzyme chitinase đến bệnh thán thư Nghiệm thức Đối chứng Thí nghiệm 17 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC R: Ngày Summary Statistics for dk to nam bi phan giai mau tn Count doi chung enzyme Total ANOVA Table for dk to nam bi phan giai by mau tn Source Between groups Within groups Total (Corr.) 18 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for dk to nam bi phan giai by mau tn Method: 95.0 percent LSD mau tn Count doi chung enzyme Ngày Summary Statistics for dk mau tn Count doi chung enzyme Total ANOVA Table for dk by mau tn Source Between groups Within groups Total (Corr.) 19 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for dk by mau tn Method: 95.0 percent LSD mau tn doi chung enzyme Ngày Summary Statistics for dk5 mau tn5 Count doi chung enzyme Total 20 Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for dk5 by mau tn5 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for dk5 by mau tn5 Method: 95.0 percent LSD mau tn5 Count doi chung enzyme Ngày Summary Statistics for dk mau tn Count doi chung enzyme Total Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for dk by mau tn Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for dk by mau tn Method: 95.0 percent LSD mau tn doi chung enzyme 22 ... dụng enzyme chitinase, đƣợc sinh từ số vi sinh vật định Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên định thực đề tài ? ?Xác định số điều kiện nuôi cấy tối ƣu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận enzyme. .. nghiên cứu Tìm đƣợc điều kiện ni cấy tối ƣu để thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum Nội dung nghiên cứu Định tính khả sinh tổng hợp chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Khảo sát... “Regulation of chitinaes synthesis in Trichoderma harzianum? ?? tác giả Cirano J Ulhoa John F Peberdy, nhận định điều kiện nuôi cấy chủng Trichoderma harzianum 39,1 để thu nhận chitinase tốt 28 C, pH= 31