Kiểm tra độ tinh sạch đoạn gene 16s rdna trong xác định loài bằng phương pháp dgge​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KIỂM TRA ĐỘ TINH SẠCH ĐOẠN GENE 16S rDNA TRONG XÁC ĐỊNH LỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP DGGE Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Hồng Quốc Khánh CN Ngơ Đức Duy : Hà Sinh viên thực Trầm Xuân Lớp: MSSV: 0851110305 08DSH6 TP Hồ Chí Minh, 2012 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nhóm vi sinh vật 1.2 Các phương pháp ly trích thu nhận DNA genomic 1.2.1 Phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số vi sinh vật môi trường tự nhiên 1.2.2 Phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch nuôi cấy 1.3 Các ứng dụng phương pháp PCR 1.3.1 Ứng dụng phương pháp PCR xác định trình tự nucleic acid 1.3.2 Ứng dụng phương pháp PCR q trình xác định lồi vi sinh vật .7 1.3.3 Ứng dụng phương pháp PCR phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng 1.3.4 Ứng dụng phương pháp PCR q trình thúc đẩy nhanh cơng nghệ giải trình tự 1.3.5 Ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán sàng lọc bệnh di truyền 10 1.4 Phương pháp DGGE ứng dụng 10 1.5 Định danh nhóm vi khuẩn 12 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.1 Định danh phương pháp truyền thống 12 1.5.2 Định danh nhóm vi khuẩn sinh học phân tử 14 1.6 Xây dựng phát sinh loài chủng loài 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 2.1 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu thí nghiệm 20 2.3 Thiết bị dụng cụ 22 2.4 Quy trình kiểm tra độ tinh đoạn gene 16S rDNA chủng vi khuẩn 23 2.4.1 Quy trình ly trích thu nhận DNA genomic nhiệt 24 2.4.2 Quy trình kiểm tra xuất DNA genomic mẫu sau ly trích 26 2.4.3 Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA nhóm vi khuẩn phương pháp PCR 27 2.4.4 Tinh sản phẩm PCR QIAGEN Kit 28 2.4.5 Quy trình Applied Biosystems 30 2.4.6 Xác định thành phần chủng vi khuẩn phương pháp DGGE 32 2.5 Sử dụng phần mềm tin sinh học 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 37 3.1 Kết tăng sinh kiểm tra hình thái tế bào chủng vi khuẩn 37 3.2 Kết ly trích DNA genomic nhiệt chủng vi khuẩn 42 3.3 Kết khuếch đại đoạn gene 16S rDNA phương pháp PCR 42 3.4 Kết tinh đoạn gene 16S rDNA QIAGEN Kit .43 3.5 Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA chủng vi khuẩn .44 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.6 Kết xây dựng phát sinh chủng loài 54 3.7 Kết khuếch đại vùng V3 cho phương pháp DGGE 56 3.8 Kết kiểm tra nồng độ DNA máy BEKMAN 57 3.9 Kết vùng V3 gel polyacrylamide chủng vi khuẩn phương pháp DGGE 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CTAB Cetyl – trimetyl – ammomiumbromide DNA Deoxyribonucleic acid DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid EtBr Ethidium bromide PCR Polymerase chain reaction SDS Sodium dodecyl sulfate RNA Ribonucleic acid TAE Tris – Acetic – EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris – EDTA UV Ultra Violet iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn 20 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl 27 Bảng 2.3: Thành phần Big – Dye Reaction mồi xuôi 27F 30 Bảng 2.4: Thành phần Big – Dye Reaction mồi ngược 1492R 30 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA DGGE 32 Bảng 2.6: Nồng độ pha gel polyacrylamide 34 Bảng 2.7: Tỷ lệ phối trộn gel polyacrylamide vào hai xilanh 34 Bảng 3.1: Kết quan sát hình thái học chủng vi khuẩn 37 Bảng 3.2: Kết soi kính hiển vi 100X chủng vi khuẩn .39 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình kiểm tra độ tinh đoạn gene 16S rDNA chủng vi khuẩn 23 Sơ đồ 2.2: Quy trình ly trích thu nhận DNA genomic nhiệt 25 Sơ đồ 3.3: Kiểm tra DNA genomics sau ly trích 26 Sơ đồ 3.4: Quy trình tinh DNA sau chạy PCR 29 Sơ đồ 3.5: Quy trình Applied Biosystems 31 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Hệ thống thiết bị chạy DGGE 36 Hình 3.1: Kết tăng sinh chủng vi khuẩn Đó chủng A, B, C, D, E, F, G, H K 41 Hình 3.2: Kết thu nhận DNA genomic chủng vi khuẩn gel agarose 1% 42 Hình 3.3: Kết thu nhận đoạn gene 16S rDNA chạy PCR gel agarose 1% 43 Hình 3.4: Kết tinh đoạn gene 16S rDNA QIAGEN Kit gel agarose 1% 44 Hình 3.5a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng A 45 Hình 3.5b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) chủng A 45 Hình 3.6a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng B 46 Hình 3.6b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) chủng B 46 Hình 3.7a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng C 47 Hình 3.7b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) chủng C vii 47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng D 48 Hình 3.8b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) chủng D 48 Hình 3.9a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng E 49 Hình 3.9b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) chủng E 49 Hình 3.10a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng F 50 Hình 3.10b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) chủng F 50 Hình 3.11a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng G 51 Hình 3.11b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) chủng G 51 Hình 3.12a: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng H 52 Hình 3.12b: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) chủng H 52 Hình 3.13a : Kết giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) chủng K 53 Hình 3.13b : Kết giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) chủng K viii 53 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.14: Kết xây dựng phát sinh loài chủng khảo sát (chủng E, F, G, H, K) so với liệu ngân hàng gene 55 Hình 3.15: Kết khuếch đại vùng V3 đoạn gene 16S rDNA chủng vi khuẩn gel agarose 1% 56 Hình 3.16: Kết chạy DGGE vùng V3 gel acrylamide biến tính .57 ix ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 539 Sbjct 948 Query 599 Sbjct 1008 Query 659 Sbjct 1068 Query 719 Sbjct 1128  Burkholderia lata Query 63 Sbjct 313 ACCC ||| Query 123 CAAGCAGCCGCAGCATGTGGTTTTATTATCTCAAGCAACGCGCAGAAACCTTA Sbjct 371 CAAGCGGTGGATGCATGTGGTATTATTATCTCATGCACCGCGAAAAAACCTTA | | | ACCG 175 | ||||| | ||||| ||| | ||| |||| | |||| ||| 418  Clostridium thermoamylolyticum Query CGAT |||| Sbjct 227 CGAT Query 61 TCCT |||| Sbjct 287 TCCT Query 121 CCGC |||| Sbjct 347 CCGC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 181 ACGG |||| Sbjct 404 ACGG Query 241 GCGA |||| Sbjct Query 464 GCGA 301 ATGTG-AAAAGCTTGGCTGCACCCGAAGGGTATGCATCTGAAATCTAAATAGCTTGAGTC | 359 |||| || |||| || ||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||| Sbjct 522 ATGTGAAAAACCTGGGCTGCAACCGAAGGGTATGCATCTGAAATCTAAATAGCTTGAGTC 578 Query 360 AAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATA 419 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 579 AAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATA 638 Query 420 CCGTTGCCGAAATCGCCTTTCTGGACTTGAACTGTAGCTGAGGTGGGAAAGCGTGGGGAG 479 | || ||||| || || ||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||||| Sbjct 639 CCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGACTTGAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG 698 Query 480 CAACCAGG-TTAGGATACCTTGTTATTCCAGAGCGGTAAACGATGGATATTAGTTGTGGG 538 | |||| ||| |||||| || || |||| || |||||||||| ||| ||| |||||| Sbjct 699 CAAACAGGATTAGGATACCCTGGTAGTCCAGCGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTGGG 756 Query 539 TTA-GTATAATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC 597 | Sbjct 757 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGGAATAATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC 816 Query 598 AAGG Sbjct 817 AAGG Query 658 TAAT |||| |||| Sbjct 874 TAAT  Clostridium sporogenes Query 16 Sbjct 264 CTGA |||| CTGA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 75 AACACCCTGACACCACCACGCCGCGTGTGATGATG-ACGTGTTTTGATAGTGAAGCCCTG Sbjct 323 AACACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGTGGTGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCCCTG | |||||||| | | |||||||||| | ||||| | || || 133 ||| || |||||||| 380 Query 134 TGTT | || Sbjct Query 381 TGTT 193 CA-CA-CC-CGGTAATATACATATGTGGAGAGCGTTCTCCGATATTTACTGGGCGTAAAG | || || |||| | |||| || |||| ||||||| |||| 249 |||||||||||||||| Sbjct 436 CAGCAGCCGCGGTAATATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGAGATTTACTGGGCGTAAAG 491 Query 250 GGAGTATGTAGGC-GATATTTTAAATGTCAAATGTAATCTCCCGGGGCTAAACTGGGGGC 308 | Sbjct 492 || |||||| ||| ||||| || | || |||| |||||| ||| |||||||| GGAGTGCGTAGGCGGATAGTTTAAGTGGGATGTGAAATCTCCCGGGCTTAACCTGGGGGC 548 Query 309 TCGCT Sbjct 549 TCGCA Query 368 GAGCG Sbjct 603 TAGCG Query 426 GGACTCTATCTGTAGAC-CT-AGAAATCAAAAACCTgggggggCACACCGGTTTAGATAC | || | | ||| || || | | ||| | | ||| 483 ||| || || |||||||| Sbjct 658 GGACTGTAACTGTAGACGCTGAGGCATCGAAAGCGTGGGGTAGCAAACAGGATTAGATAC 712 Query 484 CCGTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCTCTG 543 | Sbjct 713 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCTCTG 771 Query 544 TGCC Sbjct 772 TGCC Query 604 AAGG |||| |||| Sbjct 832 AAGG 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Clostridium botulinum Query 60 Sbjct 9780 Query 120 Sbjct 9840 Query 180 Sbjct 9900 Query 239 Sbjct 9957 Query 299 Sbjct 10017 Query 359 Sbjct 10077 Query 419 Sbjct 10137 Query 479 Sbjct 10197 Query 539 Sbjct 10257 Query 599 Sbjct 10317 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 659 Sbjct 10377 Query 719 Sbjct 10437  Clostridium thermopalmarium Query 172 ACACCCATGGACACAACC-GTCTTCTTATCCCCGAGAAGGGCTTTCTCCCTATTTAAGGA ||| |||| | ||| ||| |||||| | |||| 230 ||||||||| || || | ||| | Sbjct 1008 ACAACCATGGACACCACCTGTCTTCCTAGCCCCGAGAAGGGCTTCCTCCCTATTTACGAG 957 Query 231 TATTGCAGGAGATGTCAAGTCTATGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTAGAAATAAAACCAC 290 | Sbjct 956 | |||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||| | ||| ||||||| TAATTCAGGAGATGTCAAGTCTAGGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAAATTAAACCAC Query 899 291 AT ||| Sbjct 898 GT Query 351 AC || Sbjct 839 AC Query 411 AC ||| Sbjct 780 AC Query 471 TC ||| Sbjct 724 Query 531 TC GT ||| Sbjct 664 GT Query 591 AC Sbjct 604 ||| 12 AC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 651 AC || Sbjct 545 AC Query 711 AC || Sbjct 485 AC Query 770 CA || Sbjct Query 428 830 CGGCTTTTGCTGCCTCAGAGTTTATCCCCATATTGCCGCCAT-TTCCCGCAGTGGCTGCC | || ||||| |||| |||| 374 CGGCGTTTGCTGCGTCAGGGTTTCTCCCCATATTGCCGCAATATTCCCGCACTGGCTGCC Query 889 TCCCG-AGAAGAGGTCTG-ACGGGTTCTCAGTTTCCAACGTGACCGA Sbjct 321 || ||| |||| || | 888 |||||| | || || || ||||| || || ||||| Sbjct | CA 322 933 |||||||| |||| ||| |||| TCCCGTAGAAGAGGTCTGGACCGTGTCTCAGTTTCCAATGTGGCCGA 279  Clostridium crotonatovorans Query 232 ATTGCAGGAGATGTCAAGTCTATGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTAGAAATAAAACCACA | Sbjct 946 291 |||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||| | ||| |||||||| ATTGCAGGAGATGTCAAGTCTAGGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAAATTAAACCACA 890 Query 292 TGCT Sbjct 889 TGCT |||| Query 352 CTCC |||| Sbjct 830 CTCC Query 411 ACAC |||| Sbjct 774 ACAC Query 471 TCCC |||| Sbjct 718 TCCC 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 531 GTTC |||| Sbjct 658 GTTC Query 591 ACTC |||| Sbjct 598 ACTC Query 651 ACTT |||| Sbjct 539 ACTT Query 711 ACGT |||| Sbjct 479 ACGT Query 770 CAAT || | Sbjct 422 CAAT Query 830 CGGC | || ||||| |||| |||| |||||| | || || || ||||| || || ||||| Sbjct 368 CGGCGTTTGCTGCGTCAGGGTTTCTCCCCATATTGCCGCAATATTCCCGCACTGGCTGCC Query 889 TCCCG-AGAAGAGGTCTG-ACGGGTTCTCAGTTTCCAACGTGACCGA | Sbjct 315  || ||| |||| || | 316 933 |||||||| |||| ||| |||| TCCCGTAGAAGAGGTCTGGACCGTGTCTCAGTTTCCAATGTGGCCGA 273 Clostridium thermobutyricum Query CG || Sbjct 294 CG Query 61 AT || Sbjct 352 AT Query 121 TT | Sbjct 403 |||| ||||| ||| || |||| |||| ||||| |||||||||||||||| || GTCTTGCGGATTGTAAAGCTCATGTTCTTTAGGGCACGATAATGACGGTACCTAAGGCAG 14 457 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 181 GA || Sbjct Query 241 ATCTCGGATTTAACTGGTGCGTAAAGAGTATGTAGGTGGATATTTAAGTCAGATGTGAAT | GTCTCGGATTTAACTGGTGTGTAAAGAGTATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGATGTGAAA 570 Query 301 TTCGGCGGGGCTTAACAATTGGCGCGGCTTTTGATACTGGATCTGTAGAGTGCGGGAGAG 360 571 361 GA ||||||| ||||| | |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| 514 Sbjct GA 300 Sbjct | 458 | ||||||||| | ||||| || ||||||||||||| | ||||||| ||||||| TTCGGCCGGGCTTAACACTGGGCGCTGCATTTGATACTGGATATCTAGAGTGTGGGAGAG 627 Query || Sbjct 628 GA Query 420 G| Sbjct 686 GC Query 477 CT | Sbjct 744 Query 537 CCACCTTCGGTGCTGCAGCAAACGCAATAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA Sbjct 804 CCACCCTCGGTGCCGCAGCAAACGCAATAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA | 596 ||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Query 597 Sbjct 864 Query 657 Sbjct 924 Query 717 Sbjct 984 Query 775 Sbjct 1040 15 863 CA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 835 Sbjct 1095 Query 895 Sbjct 1150  Ilyobacter delafieldii Query 232 ATTGCAGGAGATGTCAAGTCTATGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTAGAAATAAAACCACA | Sbjct 967 291 |||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||| | ||| |||||||| ATTGCAGGAGATGTCAAGTCTAGGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAAATTAAACCACA Query 911 292 TGCTC ||||| Sbjct 910 TGCTC Query 352 CTCCC Sbjct 851 CTCCC Query 412 CACAT ||||| ||| Sbjct 794 CACCT Query 472 CCCCA ||||| Sbjct 738 CCCCA Query 532 TTCTT Sbjct 678 TTCTT Query 592 CTCTA ||||| |||| Sbjct 618 CTCTA Query 652 CTTAA ||||| Sbjct 559 CTTAA 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 712 CGTATAACC-CGTGCTGCTGGCACGTAGATAGCCGTGGTCTTCCTCTTCTGGTACCCGAC Sbjct 499 CGTATTACCGCGTGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGTCTTCCTCCTTTGGTACCCGTC | 770 ||| || ||||||||||||||| ||||||||| ||||||| | ||||||| | | 443 Query 771 AATT | || Sbjct Query 442 AATT 831 GGCTTTTGCTGCCTCAGAGTTTATCCCCATATTGCCGCCAT-TTCCCGCAGTGGCTGCCT | || ||||| |||| |||| |||||| | || || || ||||| || || |||||| Sbjct 388 GGCGTTTGCTGCGTCAGGGTTTCTCCCCATATTGCCGCAATATTCCCGCACTGGCTGCCT Query 890 CCCG-AGAAGAGGTCTG-ACGGGTTCTCAGTTTCCAACGTGACCGA |||| || Sbjct 335 ||| |||| || | 889 336 933 |||||||| |||| ||| |||| CCCGTAGAAGAGGTCTGGACCGTGTCTCAGTTTCCAATGTGGCCGA 294  Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum Query CGATG ||||| Sbjct 251 CGATG Query 61 TCCTA ||||| Sbjct 311 TCCTA Query 121 CCGCG ||||| Sbjct 371 CCGCG Query 181 ACGGT ||||| Sbjct 431 ACGGT Query 241 GCGAG Sbjct 491 ||||| Query 301 GCGAG ATGTGAAAAGCTTGG-CTGCACCCGAAGGGTATGCATCT ||||| Sbjct 549 17 ATGTG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 360 AAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATA 419 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 606 AAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATA 665 Query 420 CCGTTGCCGAAATCGCCTTTCTGGACTTGAACTGTAGCTGAGGTGGGAAAGCGTGGGGAG 479 | || ||||| || || ||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||||| Sbjct 666 CCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGACTTGAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG 725 Query 480 CAACCAGG-TTAGGATACCTTGTTATTCCAGAGCGGTAAACGATGGATATTAGTTGTGGG 538 | Sbjct 726 |||| |||| ||||| || || |||| || |||||||||||||| ||| |||||| CAAACAGGATTAGGATACCCTGGTAGTCCACAGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTGGG Query 783 539 TTAG |||| Sbjct 784 TTAG Query 599 AGGT |||| Sbjct 844 AGGT Query 659 AATT |||| Sbjct 901 AATT  Thermohydrogenium kirishiense Query CGAT |||| Sbjct 269 CGAT Query 61 TCCT |||| Sbjct 329 TCCT Query 121 CCGC |||| Sbjct 389 CCGC Query 181 ACGG |||| Sbjct 449 18 ACGG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 241 GCGA |||| Sbjct Query 509 GCGA 301 ATGT |||| Sbjct 567 ATGT Query 360 AAGG |||| Sbjct Query 624 AAGG 420 CCGTTGCCGAAATCGCCTTTCTGGACTTGAACTGTAGCTGAGGTGGGAAAGCGTGGGGAG | || ||||| || || ||||||||||||||| 479 ||||||||| |||||||||||||| Sbjct 684 CCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGACTTGAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG 743 Query 480 CAACCAGG-TTAGGATACCTTGTTATTCCAGAGCGGTAAACGATGGATATTAGTTGTGGG 538 | Sbjct 744 |||| |||| ||||| || || |||| || |||||||||||||| ||| |||||| CAAACAGGATTAGGATACCCTGGTAGTCCACAGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTGGG Query 801 539 TTAG |||| Sbjct 802 TTAG Query 599 AGGT |||| Sbjct 862 AGGT Query 659 AATT |||| Sbjct 919 AATT 19 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phụ lục C: Quy trình ly trích thu nhận DNA tổng số từ dịch vi khuẩn nuôi cấy theo phương pháp CTAB Dịch khuẩn nuôi cấy 24 Ly tâm thu sinh khối 10.000 rpm 10 phút Bổ sung 600CTAB nóng, vortex, ủ 60 C 60 phút Biến tính lần 500 μl phenol:chloroform, lắc đều, thu dịch Ly tâm 13.000 rpm phút Biến tính lần 500 μl phenol:choloroform, lắc Ly tâm 13.000 rpm phút, thu dịch Biến tính lần 500 μl phenol:choloroform, lắc Ly tâm 13.000 rpm phút, thu dịch Tủa DNA 500 μl cồn tuyệt đối lạnh Ly tâm lạnh 13.000 rpm 20 phút, C Rửa tủa DNA 500 μl cồn 80% lạnh Ly tâm lạnh 13.000 rpm 20 phút, C Làm khô ethanol mẫu hòa tan tủa 20 μl dung dịch TE 0,1X, 20 μl RNase (1mg/ml) Thu nhận DNA gene vi khuẩn 20 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phụ lục D: Quy trình ly trích thu nhận DNA tổng số LaMontagne cộng báo cáo (LaMontagne cộng Năm 2002) Mẫu sau tiền xử lý thêm 1,5 ml dung dịch Lysozyme; 0,5 ml Lysis buffer; 0,5 đệm phosphate, ủ 30 phút 37 C Thêm 0,5 ml choloroform/isoamyl alcohol (24:1,v/v), đồng hỗn hợp 10 phút Ly tâm 12.000 rpm phút, thu dịch Thêm 0,5 ml nước khử ion, ly tâm 6.000 rpm phút, tiếp tục ly tâm 12.000 rpm phút Tủa DNA với 0,6 thể tích Isopropanol nhiệt độ phịng Ly tâm 16.000 rpm 10 phút Rửa tủa DNA lần 0,7ml ethanol 70% Để bay ethanol phục hồi DNA 600 μl đệm TE 21 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phụ luc E: Kết giải trình tự đoạn gene 16S rDNA 22 ... phương pháp PCR  Giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA chủng vi khuẩn  Xác định chủng vi khuẩn vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA phương pháp DGGE  Kiểm tra nồng độ DNA độ tinh đoạn gene 16S rDNA. .. đại đoạn gene 16S rDNA chủng vi khuẩn phương pháp PCR  Tinh đoạn gene 16S rDNA QIAGEN Kit  Giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA quy trình Applied Biosystems  Khuếch đại vùng V3 đoạn gene 16S rDNA. .. V thuộc đoạn gene 16S rDNA phương pháp DGGE, điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel acrylamide biến tính  Kiểm tra nồng độ DNA tiến hành chạy DGGE kết tinh đoạn gene 16S rDNA xác Phương pháp nghiên