Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactobacillus plantarum​

Vi khuẩn lactic là hệ vi sinh vật được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhưtrongchế biến và bảo quản thực phẩm cũng như sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi.Trong quá trình sinh trưởng và p

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Lê Trần Hồng Xuân

MSSV: 1951110191 Lớp: 10DSH01

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi Các

số liệu,kết quả trong đồán là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kìnghiên cứu nào khác

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2014

Lê Trần Hồng Xuân

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành được Đồ án tốt nghiệp của mình, em xin chân thành cám ơnthầy Phạm Minh Nhựt đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiếnthức trong suốt quá trình thực hiện Đồ án

Em chân thành cám ơn thầy, cô phụ trách Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinhhọc, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm – MôiTrường,Trường Đại Học Công Nghệ Tp HCM đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để emhoàn thành Đồ án tốt nghiệp của mình

Em xin cám ơn thầy, cô thuộc Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm –Môi Trường,Trường Đại Học Công Nghệ Tp HCM đã tận tình chỉ dạy và truyềnđạt cho em nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin cám ơn tất cả các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinhhọc đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình

Cuối cùng, con xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ và gia đình đã luôn ởbênh cạnh, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con mỗi khi gặp khó khăn trong suốt quátrình học tập

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2014

Lê Trần Hồng Xuân

MỤC LỤC

TRANG

MỤC LỤC i

DANH MỤC VIẾT TẮT v

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus plantarum 3

1.1.1 Đặt điểm chung của vi khuẩn L plantarum 3

1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của L plantarum 5

1.1.3 Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn của vikhuẩn L plantarum 6

1.2 Hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn L plantarum và cơ chế hoạt động 7

1.2.1 Acid hữu cơ 7

Hydrogen peroxide 8

1.2.2 Carbon dioxide 8

1.2.3 Bacteriocin 9

1.3 Giới thiệu về bacteriocin 9

1.3.1 Lịch sử phát hiện và nghiên cứu bacteriocin 9

1.3.2 Phân loại bacteriocin 10

1.3.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 13

1.4 Tổng quan về phương pháp vi gói 14

1.4.1 Khái niệm, đặc điểm, ưu và nhược điểm của phương pháp vi gói 14

1.4.1.1 Khái niệm vi gói 14

1.4.1.2 Đặc điểm vi gói 15

1.4.1.3 Ưu điểm của vi gói 16

1.4.1.4 Nhược điểm của phương pháp vi gói 16

1.4.2 Các phương pháp vi gói 16

1.4.2.1 Phương pháp sấy phun 17

1.4.2.2 Phương pháp nhỏ giọt 17

1.4.2.3 Phương pháp polymer hoá liên kết bề mặt 18

1.4.2.4 Phương pháp ngưng tụ polymer hoá 18

1.4.2.5 Phương pháp tách pha đông tụ 18

1.4.3 Vật liệu vi gói, đặc điểm của vật liệu vi gói 18

1.4.3.1 Gelatin 18

1.4.3.2 Alginate 21

1.4.3.3 Các hợp chất vi gói khác 23

1.5 Quorum sening và quá trình hình thành bacteriocin 25

1.5.1 Khái niệm về quorum sening 25

1.5.2 Vật chất liên lạc, dấu hiệu liên lạc và cơ chế tác động của quorum sening 26

1.5.3 Ứng dụng của hệ thống quorum sening 28

1.5.4 Vai trò của quorum sening trong quá trình hình thành bacteriocin 28

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 30

2.2 Vật liệu nghiên cứu 30

2.2.1 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 30

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị 30

2.2.3 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 30

2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy và phân lập 30

2.2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Phương pháp pha loãng mẫu 31

2.3.2 Phương pháp tăng sinh 31

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 32

2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 32

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 32

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 33

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 33

2.4 Bố trí thí nghiệm 34

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinhhợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum 34

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn gelatin và alginat đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum 35

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh huổng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L plantarum 36

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn chỉ thị đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L plantarum 36

2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L plantarum 37

2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L plantarum 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 38

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn gelatin – alginate đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 40

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 42

3.4 Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 ở các mật độ vi khuẩn chỉ thị khác nhau 44

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh hợp

chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 46

3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose 10% đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC VIẾT TẮT

LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic)

MRS OPTSC01 Môi trường MRS tối ưu

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1.Một số chủng Lactobacillus plantarum 3

Hình 1.2.Tế bào vi khuẩn L plantarum 3

Hình 1.3.Cấu trúc cơ bản của gelatin 20

Hình 1.4.Cấu tạo hoá học của alginate 22

Hình 1.5.Cấu trúc hoá học của Kappa – carrageenan 24

Hình 1.6.Cấu trúc hoá học của Chitosan 25

Hình 1.7.Cơ chế hoạt động của quorum sening 27

Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34

Hình 3.1.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L plantarum SC01 ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau 38

Hình 3.2.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch tế bào vi khuẩn L plantarum SC01 cố định ở các tỷ lệ phối trộn alginate – gelatin khác nhau 41

Hình 3.3.Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị ở các tỷ lệ cấy vi khuẩn L plantarum SC01 43

Hình 3.4.Kết quả đánh giá khả năng vi khuẩn L plantarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin 6 % ức chế vi khuẩn chỉ thị ở các mật độ khác nhau 44

Hình 3.5.Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy L plantarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin 6 % đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 46

Hình 3.6.Ảnh hưởng của thời gian bảo quản bằng lactose 10 % đến khả năng hình thành hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum SC01 khi được cố định trong hỗn hợp alginate 2,5 % - gelatin 6 %. 48

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Sản phẩm lên men truyền thống là một trong những sản phẩmphổ biến và lâuđời ở các dân tộc trên thế giới.Đó là một loại sản phẩm được sản xuất thủ công,mang sắc thái và bản sắc riêng của mỗi dân tộc, mỗi vùng miền.Nước ta cónguồnnông sản dồi dào làm tiền đề để sản xuất các sản phẩm lên men truyềnthống.Đặc biệt là các sản phẩm lên men chua.Ở nước ta, hệ vi khuẩn lactic hiện diệnrất phong phú về chủng loại

Vi khuẩn lactic là hệ vi sinh vật được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhưtrongchế biến và bảo quản thực phẩm cũng như sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi.Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic sản sinh ra môi trườngmột số hợp chất thứ cấp như acid hữu cơ, hydrogen peroxide, carbon dioxie,bacteriocin và các enzymee làm tăng hương vị, màu sắc và kết cấu cho sản phẩm.Ngoài việc tăng tính cảm quan cho sản phẩm, các hợp chất này còn có khả năngngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn có hại, giúp cho quá trình bảo quản thực phẩmtốt hơn

Năm 2013, Lê Ngọc Thuỳ Trang thực hiện nghiên cứu “Tuyển chọn và khảosát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn

lactic”, kết quả đã phân lập được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ

sữa chua lên men truyền thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất mạnh,đồng thời xác định được thành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự

sản sinh hợp chất kháng khuẩn của L plantarum SC01 Từ nghiên cứu này đã mở ra

những hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện cũng như đánh giá toàn diệnkhả năng sinh hợp chất kháng khuẩn từ chủng vi khuẩn này

Với ý nghĩa thực tiển và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum” Nghiên cứu này hy vọng sẽ làm

tiền đề cho các nghiên cứu tiếptheo trong việc tạo ra các chất bảo quản sinh họcđem lại hiệu quả bảo quản thực phẩm ngày càng cao Đề tài mang tính kế thừa và

được thực hiện tại được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học– Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn có

tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn Lactibacillus plantarum

SC01 có nguồn gốc từ sữa chua lên men truyền thống

3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất

kháng khuẩn của L plantarum

- Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn cơ chất vi gói đến khả năng sinh hợp

chất kháng khuẩn của L plantarum

- Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ vi khuẩn, mật độ vi khuẩn và thời gian nuôi cấy

đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của L plantarum

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng sinh hợp chất

kháng khuẩn của L plantarum

4 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh

hợp chất kháng khuẩn của L plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ

Trang(2013)

- Đánh giá khả năng đối kháng của L plantarum SC01 đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và

Listeria monocytogenes.

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Theo Bergey và ctv (1923 ) vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc:

Loài :Lactobacillus plantarum

Hình 1.1 Một số chủng Lactobacillus plantarum: Lactobacillus plantarum299V

(a), I kLactobacillus plantarum WCFS1 (b)

1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn L plantarum

L.plantarum thuộc nhóm vi khuẩn lactic, kỵ khí tuỳ nghi,Gram dương,

hình que Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trườngMRS – agar có hình dạng tròn,màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc chuỗi Tính chất đặctrưng của vi khuẩn này là có khả năng dị hoá arginine và sinh ra nitric oxide(NO), không có khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine

Vi khuẩn L.plantarum có khả năng lên men đường lactose, và hiện diện

trong nhiều môi trường khác nhau như thịt, sữa, nhiều loại rau quả lên men.Đây

là loài vi khuẩn chịu acid và có thể phát triển được trong môi trường có chứamuối mật, điều này giúp cho vi khuẩn tồn tại được trong dạ dày và ruột

củangười.L.plantarum phát triển được ở nhiệt độ từ 15-450C và trongmôi trường

có độ pH thấp (pH 3,2) Trong quá trình lên men, L.plantarumsử dụng nguồn

carbon làm nguồn năng lượng để sản xuất ra acid lactic, ethanol, acid acetic,carbon dioxide, các peptide kháng khuẩn và exopolysaccharide.Ngoài ra,

L.plantarum có hoạt tính tannase và có thể chuyển hoá acid phenolic.

Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn L plantarum

Về di truyền, bộ gene của L plantarumbao gồm 5 operon rRNA được

phân bố đều xung quanh nhiễm sắc thể (NST), 62 gene mã hoá tRNA, 3.052gene mã hoá protein, một số gene mã hoá cho enzyme phân giải pentose vàhexose, một số gene mã hoá phosphotransferase, mannose và fructose

nênL.plantarum được xem là vi khuẩncó genome tương đối lớn so với

Lactobacillus spp (Aldam, 2013).

Bộ nhiễm sắc thể của L.plantarum có chứa 3.308.274 cặp base, và có ba

plasmid là pWCFS101 chứa 1.917bp, pWCFS102 chứa 2.365 bp, pWCFS103

chứa 36.069 bp.Vì thế, L.plantarumcó thể thích ứng được với nhiều loại môi

trường khác nhau Số lượng gene mã hoá protein bề mặt lớn (khoảng 217protein) có thể hoạt động để nhận biết hoặc liên kết với các thành phần nhất địnhcủa môi trường, những gene này cho thấy sự tương đồng với protein để thể hiệnmột số chức năng như tăng khả năng tổng hợp chất nhầy và tăng độ bám dínhgian bào

1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của L plantarum

L plantarum thuộc nhóm vi khuẩn lactic do đó nhu cầu dinh dưỡng của

chúng cũng gần giống với nhu cầu dinh dưỡng của nhóm vi khuẩn lactic, chúngđòi hỏi trong môi trường phải có:

Nguồn carbon chủ yếu được dung để cung cấp năng lượng, xây dựng cấutrúc tế bào đồng thời tạo ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acidfumalic, acid pyruvic, acid acetic; ethanol và CO2 Vi khuẩn lactic có thể sử dụngnhiều dạng hydrat carbon từ monosaccharide (glucose, fructose, manose),disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột,dextrin) Nguồn cung cấp carbon quan trọng nhất cho khuẩn lactic là đườnglactose, vi khuẩn lactic sử dụng enzymee lactose để thuỷ phân đường lactosethành glucose và galactose

Nhu cầu về nguồn nitơ, phần lớn các vi khuẩn lactic không có khả năngsinh tổng hợp các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, vì vậy chúng rất cần cácnguồn nitơ có sẵn trong môi trường để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển.Các nguồn nitơ mà vi khuẩn latic có thể sử dụng như cao thịt, cao nấm men,trypton, pepton,… Các acid amin cũng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vikhuẩn lactic Nhu cầu và vai trò của acid amin đối với từng loài khác nhau làkhác nhau, nồng độ acid amin quá cao có thể gây ức chế, kìm hãm sự phát triểncủa vi khuẩn lactic

Đối với nhu cầu vitamin, vitamin vừa đóng vai trò là các coenzyme trongquá trình trao đổi chất của tế bào vừa điều hoà quá trình cân bằng năng lượngtrong cơ thể Tuy nhiên, đa số vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợpvitamin, do đó cần phải bổ sung vào môi trường các nguồn cơ chất có chứa nhiềuvitamin như dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước ngô hoặc dịch tự phân nấm men,…

Đối vớicác chất hữu cơ khác,vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơkhác cho sự phát triển như các base nitơ (adenine, guanine, thymine…) hay acidhữu cơ (acid oleic, acid linoleic, acid linolenic) Các chất này có tác dụng điềuhoà sinh trưởng và tăng khả năng tích tụ một số sản phẩm trao đổi chất

Các muối vô cơ, để đảm bảo cho sự sinh trường và phát triển, vi khuẩnlactic rất cần các muối vô cơ nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt,kali, natri, phospho, lưu huỳnh, v.v…

Bên cạnh đó cũng có vài điểm khác biệt về nhu cầu dinh dưỡng của vi

khuẩn Lactobacillus plantarum so với các vi khuẩn lactic khác như: có thể sử

dụng nhiều nguồn cacbon lên men khác nhau, có thể phát triển trong môi trường

không chứa catalase L.plantarum sử dụng mangan trong quá trình tăng trưởng

và có thể tích lũy cao ở gian bào Mangan giúp chúng chống lại độc tính của oxybằng cách giảm các gốc oxy có trong H2O2

1.1.3 Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn của

vi khuẩn L.plantarum

Vi khuẩn L.plantarum là vi khuẩn kị khí tuỳ nghi, có thể phát triển được

trong điều kiện môi trường có và không có sự hiện diện của oxi, sự oxi hoá cáchợp chất hữu cơ sẽcung cấp nguồn năng lượng cho hoạt động sống của vi khuẩn

L.plantarum có khả năng lên men đồng hình và lên men dị hình Acid lactic là

sản phẩm cuối cùng hoặc duy nhất của quá trình lên men glucosetheo con đườnglên men đồng hình

Trong trường hợp lên men đồng hình, acid pyruvic được tạo thành theocon đường Embden – Mayerhoff – Parnas (EMP) Sau đó acid pyruvic sẽ tạothành acid lactic dưới tác dụng của enzyme lactate dehydrogenase.Lượng acidlactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ acid pyruvic bị khử carbon

để tạo thành acid acetic, ethanol, CO2 và aceton.Lượng sản phẩm phụ tạo thànhphụ thuộc vào sự có mặt của oxy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).Các vi khuẩnlactic lên men đồng hình sử dụng con đường EMP tạo ra hai phân tử acid lactic

từ một phân tử glucose và thu được năng lượng gấp hai lần so với vi khuẩn lênmen dị hình (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010)

Quá trình lên men hexose đặc trưng được thực hiện bởi vi khuẩn lacticbằng con đường lên men đồng hình hoặc lên men dị hình tạo ra các sản phẩmacid lactic, acid acetic, ethanol và carbon dioxide với số lượng bằng nhau

Pentose được lên men bởi nhiều vi khuẩn lactic lên men đồng hình và dị hìnhbằng con đường chung là từ phosphoketolase của vi khuẩn lactic lên men đồnghình bằng xúc tác pentose Quá trình lên men pentose tạo ra lượng acid lactic vàacid acetic bằng nhau (Suskovic và ctv, 2010).

Nhiều acid hữu cơ như là acid lactic, acid acetic, acid propionic là nhữngsản phẩm cuối cùng trong quá trình lên men làm cho môi trường có tính acid dẫnđến ức chế các vi sinh vật gây bệnh và nhiều vi sinh vật hư hỏng Acid thể hiệnhoạt tính kháng khuẩn bằng cách can thiệp vào quá trình duy trì tính ổn định điệnthế màng tế bào, ức chế hoạt động vận chuyển các chất, làm giảm độ pH trong tếbào và ức chế một loạt các chức năng trao đổi chất khác Chúng cũng thể hiệnhoạt tính kháng khuẩn trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương cũng như cảnấm men và nấm mốc (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010)

1.2 Hợp chất kháng khuẩn từvi khuẩn L plantarum và cơ chế hoạt động

Vi khuẩnL plantarum được coi như là nguồn sản xuất các chất kháng

sinh, các sản phẩm được tạo ra qua quá trình trao đổi chất như là acid hữu cơ(acid lactic và acid acetic), acetaldehyde, các hợp chất kháng khuẩn khác có khốilượng phân tử thấp và bacteriocin (Suskovic và ctv, 2010)

1.2.1 Acid hữu cơ

Sản phẩm chính của quá trình lên men là các acid hữu cơ, tùy vào từngloại vi khuẩn và điều kiện môi trường mà sản phẩm acid được tạo ra là khác nhau(Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013)

Sản phẩm quan trọng và đặc trưng nhất của quá trình lên men lactic là acidlactic và acid acetic Số lượng và loại acid tạo ra trong quá trình lên men ảnhhưởng đến hoạt động của các vi sinh vật khác có trong đó Ví dụ, acid acetic cóthể kháng được nấm men mạnh hơn acid lactic, một vài nấm men trong quá trìnhoxy hoá có thể sử dụng acid hữu cơ như một nguồn carbon và là nguồn nănglượng do đó gây ra hư hỏng thông qua việc khử acid trong quá trình lên men, đặcbiệt là trong thực vật (Suskovic và ctv, 2010)

Tác dụng ức chế của các acid hữu cơ chủ yếu dựa vào sự chưa phân ly củaphân tử, các chất này sẽ khuếch tán qua màng tế bào, hướng tới các vùng tế bàochất có tính kiềm và cản trở các quá trình trao đổi chất cần thiết xảy ra Tác độngcủa acid lactic và acid acetic là làm giảm pH trong tế bào và làm giảm nănglượng điện thế màng (Suskovic và ctv, 2010), pH giảm giúp tiêu diệt các vi

khuẩn có hại như E Coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus auraus, v.v

Theo Đặng Phương Nga và công sự (2007), khi acid lactic đi qua màng sẽ phóng

ra proton H+ làm acid hoá nội bào, phá huỷ cơ chế vận chuyển qua màng dẫn đếnchết tế bào Ngoài ra, do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH

so với môi trường acid bên ngoài, H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vikhuẩn là pH nội bào giảm Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+

ra khỏi tế bào làm cho vi khuẩn bị mất năng lượng Bên cạnh đó, pH giảm cũnggây ức chế quá trình đường phân, tế bào vi khuẩn bị cạn kiệt năng lượng, đâycũng nguyên nhân làm cho tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt

1.2.2 Hydrogen peroxide

Hydrogen peroxide là sản phẩm phụ của quá trình lên men lactic, có khảnăng oxy hóa mạnh mẽ lớp màng lipid, khi tiếp xúc với tế bào vi khuẩn chúng sẽtiến hành oxy hoá mạnh mẽ tế bào và phá vỡ cấu trúc cơ bản của protein tế bào(Suskovic và ctv, 2010) Bên cạnh đó, hydrogen peroxide còn thể hiện hoạt tínhkháng khuẩn bằng cách oxy hoá các nhóm sulfhydryl từ đó gây biến tính một sốenzyme và peroxy lipid màng làm tăng tính thấm của màng.Hydrogen peroxidecòn là tiền thân cho việc sản xuất các gốc tự do như superoxide (O-) và hydroxyl(OH), các gốc này có khả năng gây tổn hại DNA của tế bào vi khuẩn

Ví dụ như trong nguyên liệu là sữa, thông qua quá trình oxy hoá các ionthiocyanate (SCN-) bởi hydrogen peroxide được sản xuất bởi các LAB, dưới tácdụng của enzyme lactoperoxidase sẽ tạo ra sản phẩm là một phức chấtlactoperoxidase Phức chất này oxy hoá các cơ chất đặc trưng trên màng tế bào

và làm rối loạn quá trình trao đổi chất và có thể làm chết vi khuẩn

1.2.3 Carbon dioxide

Carbon dioxideđược sản xuất thông qua con đường lên men dị hình, chokhả năng bảo quản thực phẩm cao gấp đôi so với các hợp chất kháng khuẩnkhác.Ngoại trừ hoạt động kháng khuẩn, carbon dioxide còn tạo ra môi trường kỵkhí bằng cách thay thế cho các phân tử oxi có mặt trong môi trường.Carbondioxide có khả năng ức chế sự tổng hợp enzyme decarboxylase và tích tụ tronglớp màng kép phospholipid dẫn đến sự rối loạn chức năng thẩm thấu, do đó cóthể kháng được nấm (Suskovic và ctv, 2010).

Carbon dioxide có khả năng ức chế nhiều loại sinh vật gây hư hỏng thựcphẩm, đặc biệt là vi khuẩn Gram âm Tác động ức chế từ carbon dioxide là khácnhau giữa các loài sinh vật Carbon dioxide ở mức 10% có thể làm giảm 50%tổng số lượng vi khuẩn và ở mức độ từ 20-50%, carbon dioxide có hoạt tínhkháng nấm mạnh (Ammor và ctv, 2006)

1.2.4 Bacteriocin

Được sản xuất bởi nhiều chủng vi khuẩn lactic, bacteriocin thể hiện hoạttính kháng khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình phát triển của các vi khuẩn gây

hư hỏng thực phẩm, ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật khác bằng cách

ức chế chúng hoặc liên kết với các receptor đặc biệt của tế bào Bacteriocin được

sử dụng như một tác nhân ức chế các vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng trongcác thực phẩm, duy trì giá trị dinh dưỡng và vitamin, cung cấp thực phẩm tươimới Trong công nghiệp chế biến đồ hộp, nisin được sử dụng nhằm giảm khảnăng chịu nhiệt của vi khuẩn, kìm hãm và ngăn ngừa quá trình thối rữa

1.3 Giới thiệu về bacteriocin

1.3.1 Lịch sự phát hiện và nghiên cứu bacteriocin

Bacteriocin đầu tiên được A Gratia phát hiện vào năm 1925 khi ông đangthực hiện các nghiên cứu để tìm cách tiêu diệt vi khuẩn Ông gọi phát hiện đầu

tiên của mình là colicinvì nó có khả năng tiêu diệt E Coli Thuật ngữ “colicin”

được đặt tên bởi Gratia và Fredericq (1946), còn “bacteriocin” được sử dụng bởiJacob và ctv (1953).Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là cácpeptide được tổng hợp ở ribosome của cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn

Gramdương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế sự phát triển của các loài

vi khuẩn khác nhau Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạttính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kiềm hãm chứ không giết chết visinh vật (Lê Thị Hồng Vân, 2008) Do vậy, nhiều năm về trước, người ta chỉ tậptrung sản xuất kháng sinh mà không chú trọng đến các chế phẩm bacteriocin.Nhiều năm trở lại đây, việc sử dụng thuốc kháng sinh đã gây ra nhiều hiện tượnglờn thuốc, sốc thuốc,v.v… gây hậu quả nghiêm trọng.Vì vậy, hiện nay các chếphẩm bacteriocin bắt đầu được quan tâm, chú trọng

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về bacteriocin và công dụng củachúng Việc nghiên cứu để tìm ra các gene mã hoá cho sự tổng hợp bacteriocinvẫn đang thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Gần đây, bacteriocinđược sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia.Hai chế phẩmbacteriocin đã có mặt trên thị trường là ALTA TM 2341, có chứa pediocin PA1

được sản xuất bởi Pediococcus acidilactici, và Microgard TM, một sản phẩm

thương mại của quá trình sữa lên men có chứa các chất chuyển hóa kháng sinh.Việc sử dụng kháng sinh có chứa các màng cố định bacteriocin đánh dấu cho sựphát triển của bao bì kháng sinh một kỹ thuật mới phát triển gần đây (Suskovic

và ctv, 2010).các

1.3.2 Phân loại bacteriocin

Theo Heng và ctv(2007) bacteriocin được chia làm bốn lớp chính:

- Lớp I: các lantibiotic hay các peptide kháng khuẩn của vi khuẩn cóchứa gene không biến đổi mã hoá cho acid amin lanthionine (Lan) hoặc 3-

methylanthionine (MeLan), cũng như các acid amin biến đổi cao khác bao gồmcác acid amin không bão hoà như acid amin 2,3-dehydroalanine (Dha) vàdehydrobutyrine (Dhb) Các lantibiotic được tổng hợp ở ribosome như là cácpeptide tiền thân sau đó phải trải qua một loạt các phản ứng biến đổi sau dịch

mã để sản xuất các acid amin Cho đến nay, các lantibiotic chỉ được sản xuất bởicác vi khuẩn Gram dương.Lantibiotic được phân loại dựa vào các cấu trúc liênkết vòng và các hoạt tính sinh học của chúng Chúng được chia làm ba loại, loại

A (kéo dài cấu trúc amphipathic), loại B (hình cầu nhỏ và nhiều cấu trúc nhỏ) vàloại C.

Dựa vào kích thước, vai trò, trình tự peptide dẫn đầu mà các lantibioticloại A được chia thành hai phân nhóm nhỏ là AI và AII (Heng và ctv, 2007).Trong các lantibioticthuộcnhóm AI thì nisin được chú ý hơn cả, quá trình tổnghợp nisin đòi hỏi sự tham gia phối hợp của ít nhất 11 loại gen với các chức năngkhác nhau Thí dụ như nisinA dùng để mã hoá các peptide tiền thân sau đó sẽđược thực thi bởi nisinB, nisinC cắt các liên kết hydro, nisinT là một ABC vậnchuyển, nisinP là một protein màng, v.v…

Các lantibiotic loại B hình cầu và có hình dạng nhỏ hơn các lantibiotic loại

A, điển hình cho nhóm này là Mersacidin, một peptide có 20 acid amin và có cáctính năng đặc biệt như ba dòng MeLan, một DHA và một lượng nhỏ S-[(Z)-2-aminovinyl]-(3S)-3-methyl-D-cysteine (AviMeCys)] Mersacidin không hìnhthành các lỗ trong màng tế bào vi khuẩn mà ức chế tổng hợp thành peptidoglycan(Heng và ctv, 2007) Ngoài ra còn có cinnamicin, một lantibiotic loại B chứa 19

acid amin được sản xuất bởi Streptomyces cinamoneus

- Lớp II: peptidebacteriocin hay các bacteriocin không chứalantibiotic Lớp này có số lượng lớn với hơn 50, có nguồn gốc rất đa dạng, từ

khoang miệng, đường tiêu hoá của người và động vật đến các loài có trong cácngành công nghiệp sản xuất sữa và thực phẩm Lớp II bao gồm các chất ức chếhoạt động như là peptide đơn hoặc các hoạt động phối hợp của hai hay nhiềupeptide Lớp này được chia thành lớp IIa (các bacteriocin giống pediocin), lớp IIb(bacteriocin đa phần) và lớp IIc (các bacteriocin dạng vòng)

Trong các bacteriocin thuộc nhóm II thì các bacteriocin lớp IIa chiếm một

số lượng tương đối lớn (khoảng hơn 20).Các bacteriocin giống pediocin này có

khả năng tiêu diệt Listeria monocytogenes, một tác nhân gây hư hỏng thực

phẩm.Đại diện cho lớp này là pediocin PA-1, một peptide gồm 44 acid amin

được sản xuất bởi LAB Pediococcus Pediocin PA-1 được sử dụng với tên

thương mại là Alta TM 2341, một sản phẩm dùng để bảo quản thực phẩm chống

lại vi khuẩn Listeria.

- Lớp III: các bacteriocin lớn và được chia thành hai nhóm riêngbiệt: một là enzyme bacteriolytic (hoặc bacteriolysin) (IIIA) tạo điều kiện choquá trình giết chết các chủng mẫn cảm với tế bào ly giải, hai là các protein khángkhuẩn không làm thủng màng tế bào (IIIb) Lớp IIIa lại được chia ra thành 2nhóm nhỏ:

Lysostaphin- bacteriolysin đầu tiên được tổng hợp như một tiền chấtprotein với 493 acid amin vàphải trải qua các quá trình biến đổi liên tiếp để tạothành phân tử lysostaphin hoàn chỉnh Lysostaphin có khả năng tiêu diệt các tụ

cầu khuẩn có ảnh hưởng xấu đến con người và động vật như Staphylococcus

epidermidis Chính vì lý do này mà trong những năm qua lysostaphin đã được

khuyến cáo sử dụng trong một loạt các ứng dụng trong lĩnh vực y tế và nôngnghiệp

Zoocin A và các bacteriolysins khác: trong 10 năm qua, nhiều công trìnhnghiên cứu đã được thực hiện để tìm cách sản xuất bacteriolysis từ vi khuẩn acid

lactic mà chủ yếu là từ Streptococcus và Enterococcus Zoocin A là enzyme bacteriolysin đầu tiên được sản xuất từ Streptococcus Ngoài zoocin A chỉ có 2

enzyme bacteriolysin khác được sản xuất từ vi khuẩn lactic đó là millericin B

được sản xuất từ Streptococcus milleri và enterolysin được sản xuất từ E.feacelis.

Và lớp IIIb là các bacteriocin không phải là bacteriolysin, trái ngược vớicác bacteriolysin, một số bacteriocin có khả năng tiêu diệt các tế bào vi khuẩn màkhông làm thủng màng tế bào Các bacteriocin thuộc lớp này tác động bằng cáchlàm tiêu hao năng lượng proton, dẫn đến không thể tổng hợp ATP để cung cấpnăng lượng cho tế bào, tế bào sẽ đói dần và chết Thuộc lớp này có một số

bacteriocin chủ yếu như helveticin J được sản xuất bởi Lactobacillic helveticus,

dysgalacticin và streptococcin A-M57 được sản xuất từ

Streptococcusdysgalactiae, v.v

- Lớp IV: các peptidevòng được ribosome tổng hợp sau quá trìnhphiên mã bằng cách hình thành liên kết hoá trị giữa acid amin đầu tiên và acid amincuối cùng của các peptide, cho đến nay lớp này chỉ gồm một số ít

bacteriocin Đại diện cho lớp này có enterocin AS-48 được sản xuất bởi

E.faecalis spp, enterocin cho phổ tác động rộng ở cả vi khuẩn Gram dương lẫn

vi khuẩn Gram âm; gassericin A and reutericin 6 là các peptide vòng được sản

xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus gasseri vàvi khuẩn Lactobacillus reuteri

1.3.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Cơ chế hoạt động của bacteriocin rất đa dạng như là làm biến đổi cácenzyme, ức chế sự sản sinh bào tử, xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton,làm giảm thế năng màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào từ đó tạo racác lỗ thủng dẫn đến tế bào bị phá vỡ.Tác động quan trọng nhất là tương tác giữabacteriocin với các anionic lipid dồi dào trong màng tế bào và từ đó hình thànhcác lỗ trong màng tế bào nhạy cảm.Tuy nhiên, bacteriocin được chia thành từnglớp nhỏ khác nhau tương ứng với cơ chế hoạt động khác nhau, như là:

Các lantibiotic được tìm thấy chỉ được sản xuất bởi các vi khuẩn Gram

dương Điển hình nhất là nisin được sản xuất bởi vi khuẩn Lactococcus lactic,

nisin được Rogers phát hiện ra vào năm 1928 và có một lịch sử dài nghiên cứu.Tác động kháng khuẩn của nisin được thể hiện bằng cách: nisin sẽ bám dính lêncác tế bào vi khuẩn, phá vỡ thành tế bào dẫn đến sự thất thoát các ion kali,magiera ngoài.Thông qua sự tương tác giữa màng tế bào với tiền thân là lớp lipid

II, nisin ức chế tổng hợp thành peptidoglycan dẫn đến làm suy giảm các thànhphần nội bào Nisin có tác dụng ức chế sự tổng hợp thành tế bào peptidoglycan

nên có chúng có thể tác động lên cả vi khuẩn Gram dương như Listeria,

Entercoccus, Sporothermodurans và Clostridium Khi sử dụng, nisin không có

tác dụng lên vi khuẩn Gram âm (nhưE Coli), nấm men và nấm mốc.

Cinnamicin là một lantabiotic có tác động ức chế phospholipase A2 (mộtenzyme tham gia vào quá trình tổng hợp prostaglandin và leukotriene có trong hệthống miễn dịch của người) thông qua việc cô lập chất nền

phosphatidylethanolamine Do hoạt động này mà cinnamicin được sử dụng nhưmột loại thuốc chống viêm và chống dị ứng.

Plantaricin C, một lantabiotic được thu nhận từ L.plantarum thể hiện hoạt

tính kháng khuẩn của mình thông qua lớp trung gian của lớp lipid II Trái ngược

với nisin, lớp lipid II không thấm được tế bào Leuconostoc lactic hoặc tạo lỗ

chân lông trong liposome dưới tác nhân phụ phosphocholine từ lớp lipid II Tuy nhiên, lantacirin C đã được chứng minh làmột chất ức chế mạnh mẽ trong sự tổng hợp lớp lipid II và phản ứng FemX (tức

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-là việc bổ sung Gly vào vị trí đầu của chuỗi bên pentape peptide II)

Hầu hết các bacteriocin thuộc lớp II đều làm tiêu tan lượng proton của các

tế bào bằng cách tạo thành các lỗ Hoạt động của bacteriocin lớp IIa phụ thuộcvào mannose permease của hệ thống phosphotransferase (PTS) Ví dụ nhưcơ chếtác động của pediocin PA-1 gồm 3 bước cơ bản như sau: đầu tiên pediocin PA-1

sẽ liên kết với màng tế bào chất, tiếp theo là sẽ chèn vào màng tế bào, sau khi đãchèn được vào trong, pediocin PA-1 hình thành phức có tính thấm với màng tếbào tạo nên động lực phá vỡ proton và làm chết tế bào vi khuẩn (Heng và ctv,2007)

Lysostaphin thể hiện tác động kháng khuẩn bằng cách mã hoá tổng hợpglycylglycine endopeptidase, chất này có thể tiêu diệt các tế bào nhạy cảm bằngcách phá vỡ các liên kết hydro giữa các pentaglycine crossbridges có trong thànhpeptidoglycan.Vì thế, lysostaphin có thể giết chết hầu hết các tụ cầu khuẩn như

Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis.

1.4 Tổng quan về phương pháp vi gói

1.4.1 Khái niệm, đặc điểm, ưu và nhược điểm của phương pháp vi gói.

1.4.1.1 Khái niệm vi gói.

Vi gói là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãihiện nay Vi gói là phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polymer cónguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginate, chitosan, cellulose,… hoặc có nguồn gốcnhân tạo như polyamide, polystyrene, polyacrylate, polyacrylamide, polyester,

polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG),… để bẫy, nhốt và bao góicác tế bào vi sinh vật sống trong các nang nhỏ Giúp tế bào cách ly với môi trườngxung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như tổn thất số lượng tế bào, bằng cáchnày các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường cực đoan như acid cao,

pH thấp, muối mật, sốc nhiệt,… Ngoài ra, vi gói còn giúp ổn định, tăng giá trị vềmặt cảm quan cho sản phẩm

Vi gói có nhiều loại: vi gói đơn nhân là phần nhân bên trong vi gói chỉ chứamột khối dung dịch hoặc chất rắn, vi gói đa nhân là bên trong vi gói có chứa nhiềunhân nhỏ (vi gói trong vi gói), vi gói nhiều lớp là vi gói được thiết kế với nhiều lớpbao khác nhau (Đỗ Quốc Cường,2007)

1.4.1.2 Đặc điểm vi gói.

Mỗi loại vật liệu vi gói và mỗi loại tế bào sống hoạt động ở các điều kiệnkhác nhau nên phải lựa chọn điều kiện để tạo thành vi gói như pH, nhiệt độ, thờigian, v.v…Vi gói không làm tổn hại đến tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào sống,cho phép cố định lượng tế bào lớn hơn các phương pháp cố định tế bào khác.Độ bền

cơ học của lớp màng vi gói là một đặc điểm quan trọng Nó phải có độ bền tươngđối để bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên lớp màng vi gói này lại không đượcquá vững chắc vì như thế sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cầnthiết

Kích thước hạt vi gói cũng là một đặc điểm cần chú ý Giữa kích thước hạt vigói, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau.Kích thước hạt vi gói càng lớn thì độ bền của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bàosống càng cao, nhưng khả năng phóng thích càng nhỏ Kích thước hạt vi gói càngnhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóngthích sẽ dễ dàng hơn

Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác như sự mài mòn của các hạt vi gói do

sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt vi gói (Đỗ QuốcCường, 2007)

1.4.1.3 Ưu điểm của vi gói.

Vi gói gói giúp bảo vệ tế bào sống, tạo ra mật độ vi sinh vật lớn, hạt vi góinhư tấm áo choàng bảo vệ các tế bào sống chống chịu điều kiện khắc nghiệt của môitrường cực đoan như acid, nhiệt độ, Có thể sử dụng các kỹ thuật tập hơp vi sinh vật

để thu được hoạt tính cao nhất.Vi gói có thể làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại,

từ đó giúp cho thời gian bảo quản chủng, giống tế bào vi sinh vật được lâu dài

Trong các ngành thực phẩm có các sản phẩm lên men như sản xuất bia, rượu,

… thì kỹ thuật vi gói là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sửdụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệuquả hơn (Đỗ Quốc Cường, 2007)

1.4.1.4 Nhược điểm của phương pháp vi gói.

Tế bào vi sinh vật sinh ra nhiều enzyme trong quá trình trao đổi chất, cónhững enzyme xúc tác cho những phản ứng không mong muốn có thể làm tổn hạiđến lớp vật liệu vi gói và cả chính tế bào Nếu kích thước vi gói quá lớn có thể làmgiảm giá trị cảm quan của sản phẩm.Đa số các vật liệu vi gói như gelatin, thạch, cácloại tinh bột,…đều là các nguồn dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hoá được.Điều này khá nghiêm trọng vì sinh vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạpnhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hoá lớp vi gói và làm cho lớp vi gói bị rách, thủng vànhư vậy hiệu quả lớp vi gói sẽ giảm xuống đáng kể Có bằng chứng cho thấy một sốchủng vi khuẩn có khả năng tiêu hoá, sử dụng vật liệu vi gói Vì vậy, mỗi chủng visinh vật ta phải nghiên cứu vật liệu vi gói phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó(Đỗ Quốc Cường,2007)

1.4.2 Các phương pháp vi gói

Có rất nhiều phương pháp để vi gói các thành phần thực phẩm, việcchọn phương pháp vi gói phải phù hợp với nguyên liệu vi gói hoặc ứng dụng củasản phẩm vi gói Ba bước cơ bản của kỹ thuật vi gói bao gồm: hình thành lớpxung quanh vật liệu, đảm bảo không xảy ra sự rò rỉ và các vật liệu không mong

muốn được loại ra ngoài (Wilson and Shah, 2007) Sau đây là một số phươngpháp vi gói được sử dụng phổ biến.

1.4.2.1 Phương pháp sấy phun

Sấy phun là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng đểvi gói do tínhkinh tế cao, và cũng là một trong những phương pháp vi gói được sử dụng lâuđời nhất Từ những năm 1930, phương pháp này đã được sử dụng để đóng góikẹo gum cao su.Các bước cơ bản trong kỹ thuật sấy phun bao gồm: xử lý phântán hoặc nhũ tương, đồng hoá phân tán và đưa khối chất vào buồng sấy (Wilson

và Shah, 2007)

Vật liệu vi gói các viên nang là hydrocolloid thực phẩm như là tinh bột,maltodextrin, gums (Wilson and Shah, 2007) Vật liệu nên có tính chất nhũ hoátốt, có độ nhớt thấp và có sự bảo vệ tốt đối với các thành phần vi gói bên trong.Chất vận chuyển được hydrat hoá trong nước, các chất cần vi gói sẽ được thêmvào và đồng hoá trong giai đoạn này Hỗn hợp này sau đó sẽ được đưa vào máysấy phun khác nhau, các máy này vận hành nhờ một bánh xe hoặc một vòi phun,nước sẽ bị bốc hơi do không khí nóng (100 – 1600C) sau đó các hạt nhỏ sẽ đượcđưa đến dưới cùng của máy sấy phun, nơi các hạt vi gói được thu thập (Wilson

và Shah, 2007)

1.4.2.2 Phương pháp nhỏ giọt.

Phương pháp nhỏ giọt ứng dụng nguyên lý cơ bản là khi một chất lỏng đểrơi tự do thì sẽ tạo thành giọt hình cầu do sức căng bề mặt của chất lỏng Phươngpháp nhỏ giọt được thực hiện theo nguyên tắc tạo giọt đồng thời và lồng vàonhau của dung dịch tế bào và dung dịch tạo vỏ vi gói Trong điều chế vi gói, sựnhỏ giọt không thể thực hiện bằng cách cho chảy tự nhiên nhờ vào trọng lực docác ống tạo giọt có đường kính rất nhỏ Sự tạo giọt trong vi gói phải được thựchiện bằng cách ép các chất lỏng qua các ống đồng tâm, ở quy mô nhỏ có thểdùng bơm tiêm để ép chất lỏng qua bộ phận tạo giọt Hệ thống còn có thể đượcgắn thêm một thiết bị siêu âm để ngắt giọt nên có thể điều chỉnh được kích thướccủa vi gói

1.4.2.3 Phương pháp polymer hoá liên kết bề mặt.

Nguyên tắc: Tạo một phản ứng polymer hoá ngay trên bề mặt tiểu phânphân tán Để thực hiện phản ứng polymer hoá, các monomer được hoà tan hoặcphản ứng trong dung dịch chứa tế bào tự do Các tế bào tự do dễ được bao bọcbởi màng polymer tại thời điểm polymer được hình thành, do đó phương phápnày còn được gọi là phương pháp polymer hoá insitu Sau khi thực hiện phản ứngpolymer hoá, các vi gói sẽ được tách ra khỏi môi trường lỏng bằng phương pháp

ly tâm, lọc hoặc bằng cách cất loại dung môi Kích thước hạt vi gói thực hiệnbằng phương pháp polymer hoá thường nhỏ hơn các phương pháp vi gói khác,thường kích thước hạt vi gói nằm trong khoảng 3 – 2000µm (Đỗ Quốc Cường,2007)

1.4.2.4 Phương pháp ngưng tụ polymer hoá.

Phương pháp ngưng tụ polymer hoá liên kết bề mặt được ứng dụng rấtnhiều để điều chế các vi gói Nguyên tắc của phương pháp này tương tự phươngpháp polymer hoá, nhưng sử dụng hai loại polymer, một phản ứng ngưng tụ đượcthực hiện để tạo thành một polymer mới có liên kết chéo và có phân tử lượng lớnhơn bao phân tiểu phân phân tán (các tế bào tự do) (Đỗ Quốc Cường, 2007)

1.4.2.5 Phương pháp tách pha đông tụ.

Phương pháp này thường được áp dụng đối với các dung dịch polymerthan nước, polymer được dùng phải có màng phim Nếu chỉ sử dụng một loạidung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ đơn giản, nếu sử dụngnhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ phức

1.4.3 Vật liệu vi gói, đặc điểm của vật liệu vi gói.

1.4.3.1 Gelatin

Gelatin là một chất trong hơi đục, không màu, dễ gãy (khi khô), có nguồngốc từ collagen thu được từ các sản phẩm khác nhau của động vật Nó thườngđược sử dụng như một chất gel trong dược phẩm, thực phẩm, nhiếp ảnh và sảnxuất mỹ phẩm

Có nhiều định nghĩa khác nhau về gelatin: gelatin là một polypeptide có

khối lượng phân tử lớn có nguồn gốc từ collagen- một thành phần protein chính

của mô liên kết – có nhiều trong xương, da, và nội tạng;gelatin cũng là từ để chỉ

những hợp chất protein có nguồn gốc từ collagen (Cao Thị Huỳnh Châu, 2007)

Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thuỷ phân Colagen bởi

nhiệt:

C102H149N31O38 + H2O -> C102H151N31O39

a Cấu tạo, nguồn gốc của gelatin

Thành phần hoá học của gelatin bao gồm: 85 – 90% protein, 0,5 – 2%

muối khoáng, 8 – 13% nước

Gelatin là một hỗn hợp của các peptid và protein được thu nhận từ sự thuỷ

phân collagen chiết xuất từ da, xương và các mô liên kết của động vật như da cá,

da và xương heo,…Collagen được biến tính ở nhiệt độ cao làm tháo cấu trúc

xoắn ba tạo thành các chuỗi tách rời, được làm lạnh và hấp thu nước mạnh để tạo

thành gelatin Gelatin có chứa 18 loại acid amin (không có tryptophan và

cysteine), có hàm lượng glycine, proline và hydroxyproline cao

22%

Hydroxylysine12%

19

polypeptide có chiều dài khác nhau, mỗi chuỗi có một đầu là nhóm amino cònmột đầu là nhóm cacboxyl.

Cấu trúc thường gặp của gelatin là Gly-X-Y (với X chủ yếu là nhómproline còn Y chủ yếu là nhóm hydroxyproline) Gelatin có cấu trúc cơ bản nhưsau: -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của gelatin

b Tính chất của gelatin.

Gelatin là chất rắn, vảy, bột hoặc hạt, không mùi không vị, trong suốt, cómàu từ trắng đến vàng nhạt.Gelatin không tan trong nước lạnh nhưng dễ tantrong nước ấm Khi tăng nhiệt độ lên trên 400C những hạt gelatin này sẽ hoà tanvào nước để tạo thành dung dịch Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hoà tan củagelatin là nhiệt độ, nồng độ và kích thước hạt Gelatin là nguyên liệu không độc,được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm và trong y học của tất cả cácnước

Độ nhớt là một trong những tính chất quan trọng để đánh giá chất lượngcủa gelatin thành phẩm, độ nhớt lý tưởng của gelatin phải đạt trong khoảng 25-45milipoise ở 600C.Tuy nhiên, nhiều nhà sản xuất quy định sử dụng gelatin có độnhớt trong khoảng 38 ± 2 miliposie.Gelatin thường chứa sắt với hàm lượng thayđổi phụ thuộc vào nguồn nước sử dụng trong quá trình sản xuất gelatin.Giới hạnsắt trong gelatin không quá 15 ppm

Khả năng tạo gel là một tính chất rất quan trọng của gelatin, độ bền củakhối gel được đặc trưng bởi độ Bloom Độ Bloom là khối lượng tính bằng gamcần thiết tác động lên bề mặt gel tạo bởi pitong có đường kính 13 mm để khối gellún xuống 4 mm, khối gel có hàm lượng gelatin là 6,67% , được tạo gel ở 100Ctrong 16-18 giờ Gelatin trên thị trường có độ Bloom từ 150-300 Bloom

Gelatin có thể hoạt động như một acid hoặc một kiềm tuỳ thuộc vào độ

pH Trong dung dịch acid gelatin tích điện dương còn trong dung dịch base nótích điện âm Điểm trung gian ở đó có sự tích điện bằng 0 được gọi là điểm đẳngđiện.Điểm đẳng điện có ảnh hưởng đến độ nhớt và độ bền gel từ đó ảnh hưởngđến khả năng ứng dụng của gelatin.Gelatin được biết đến như một trong nhữngmôi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật nên nó là môi trường thuận lợi cho

vi sinh vật phát triển nếu có hàm lượng ẩm cao Theo quy định thì một gramgelatin phải không được chứa nhiều hơn 100 vi sinh vật và tuyệt đối không được có

Samonella hay E Coli.

c Ưu và nhược điểm của chất gói là gelatin

Ưu điểm: Rẻ tiền, thao tác đơn giản, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào,không độc với vi khuẩn và cơ thể người, dễ dàng bị thuỷ giải trong môi trường

dạ dày – ruột để phóng thích tế bào,…

Nhược điểm: Gelatin dễ dàng đông lại khi nhiệt độ xuống dưới 400C nênphải luôn duy trì nhiệt độ này để gelatin ở dạng dung dịch, tuy nhiên nhiệt độ caokhi bổ sung tế bào để vi gói sẽ làm chết tế bào

1.4.3.2 Alginate

Alginate còn có tên gọi khác là acid alginic hay align, là một anionpolysaccharide có nhiều trong tảo nâu Trên thị trường alginate được bán ở dạngsợi dạng hạt hay dạng bột

a Cấu tạo, nguồn gốc của alginate

Alginate là một polysaccharide mạch thẳng, không phân nhánh, phân tửlượng trung bình khoảng 200.000 Dalton, được chiết xuất từ tảo nâu.Alginatethường được chiết bằng kiềm sau đó tủa bằng acid hay bằng muối calcium

Thành phần chính của alginate là acid alginic cấu tạo bởi các đơn vị acid

guluronic và acid mannuronic liên kết với nhau bởi dây nối α-(1→4)-L-guluronic(G) và ß-(1→4)-D-mannuronic (M) Alginate được sản xuất từ tảo nâuPhaeophyta, là thành phần chính của thành tế bào, trong tảo các acid chủ yếu ở

dạng muối hỗn hợp (Na, K, Mg, Ca)

Hình 1.4 Cấu tạo hoá học của alginate

Na-Khi hoà tan alginate vào nước chúng dễ tạo dung dịch nhớt, độ nhớt củadung dịch alginate phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: xuất xứ các loại tảo sử dụng

để chiết xuất, thông thường tảo ở vùng ôn đới có độ nhớt cao hơn tảo ở vùngnhiệt đới, trọng lượng phân tử của alginate càng cao thì độ nhớt của dung dịchcàng tăng.Nhiệt độ tăng 10C thì độ nhớt tăng lên 25%, khi tăng nhiệt độ rồi lại hạnhiệt độ thì độ nhớt của dung dịch alginate thấp hơn ban đầu.Quá trình bảo quảncũng ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch alginate, khi ở dạng bột alginate tiếp

tục bị thuỷ phân và sau một thời gian thì độ nhớt của nó giảm xuống đáng kể.Giátrị pH của dung dịch: ở pH 5,5, nhóm COO- sẽ nhận thêm ion H+ để tạo thànhnhóm –COOH làm cho lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi giảm xuống, chúng trởnên gần nhau hơn và dễ dàng tạo liên kết hydro làm tăng độ nhớt Khi pH > 11,alginate bị khử polymer hoá làm giảm độ nhớt do các liên kết glucoside sẽ bịthuỷ phân trong môi trường kiềm.

Khả năng tạo gel của dung dịch alginate có thể được mô tả như sau: khicho alginate kết hợp với cation hoá trị II và III, thường là Ca2+ sẽ thấy xuất hiệncác vùng nối giữa các mạch phân tử alginate và tạo gel Các gel này được hìnhthành ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ <1000C và tan chảy khi đun nóng Dungdịch alginate cũng tạo gel khi bị acid hoá, nhưng loại gel này mềm hơn so vớicalcium gel Trong quá trình hình thành gel cần có cơ chế liên kết giữa hai haynhiều chuỗi alginate Chuỗi phân tử alginate cấu tạo từ các đơn vị glucoronicacid có hình dạng tương tự như một hộp đựng trứng với các nếp và khe hở màion Ca2+có thể chui vào, định vị và liên kết, trong khi các ion Ca2+ giữa các phân

tử alginate lại với nhau thành các chuỗi alginate Cấu trúc giữa các mạchglucoronic acid tạo khoảng cách giữa các nhóm carboxyl và hydroxyl thích hợpvới một lượng lớn các liên kết của calcium

c Ưu, nhược điểm của chất gói là alginate

Ưu điểm: alginate có khả năng tạo màng rất tốt, các màng rất đàn hồi, bền,

dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào vi khuẩn, không độc với cơ thể, rẻ tiền, thựchiện dễ dàng, đơn giản, hình dạng vi gói đẹp và tương đối đồng đều, quy trình vigói có thể thực hiện ở nhiệt độ bình thường nên không làm tổn thương tế bào vigói,…

Nhược điểm: mẫn cảm với môi trường acid, có thể tạo vết nứt rạn làm mấttính ổn định cơ học trong môi trường acid, hạt vi gói thường chìm xuống gây khókhăn cho quá trình thu hồi sản phẩm,…

1.4.3.3 Các hợp chất vi gói khác

a Kappa-carrageenan và hỗn hợp của kappa – carrageenan

Hình 1.5 Cấu trúc hoá học của Kappa - carrageenan

Kappa – carrageenan là hỗn hợp các polysaccharide trung tính tương tựagar –agar được chiết tách từ các loại tảo lớn ở biển, hoà tan trong nước hoặctrong dung dịch muối, có khoảng 4-5%carragenin.Kappa-carrageenan làpolysaccharide có chứa galactose và galactose sulfate.Ở nhiệt độ cao (60-900C)mới thuỷ phân kappa – carrageenan có nồng độ 2-5% (Klein và Vorlop, 1985).Gel hoá kappa-carrageenan thực hiện việc thay đổi nhiệt độ, kappa – carrageenanđược ứng dụng trong cố định enzyme, cố định tế bào Nhiều nghiên cứu chothấy, kappa – carrageenan là nguyên liệu tốt để cố định tế bào vi sinh vật dùngtrong công nghiệp sản xuất nhiều chất khác nhau Nguyên tắc: bổ sung từ từ dungdịch tạo gel (potassium chloride, hoặc các cation khác như ammonium, calcium,aluminum) vào trong dung dịch muối kappa – carrageenan có chứa sẵn tế bào(hoặc enzyme) sẽ thu được chế phẩm bao gói tế bào Hỗn hợp kappa –carrageenan – locust bean tạo hiệu quả tốt hơn cho sản phẩm lên men lactic (sữachua) vì tính mẫn cảm với acid hữu cơ thấp hơn

b Chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin, là một polysaccharide mạch thẳngtích điện âm bởi các nhóm amin nhờ sự khử acetyl của chitin, chiết tách từ vỏ cácloài giáp xác, được cấu tạo từ các đơn vị D-glusosamine và 2-acetamino-2-deoxy-D-glucosamine Chitin là đơn vị thành phần cấu trúc vỏ của động vật giáp

xác như tôm nên nguồn tách chiết để sản xuất chitosan chủ yếu là từ vỏ, xác độngvật giáp xác, chế phẩm của ngành nghề chế biến sản xuất thuỷ sản.

Hình 1.6 Cấu trúc hoá học của chitosan

Màng chitosan tạo thành có tính kháng khuẩn, kháng nấm và hạn chế sựthất thoát Chitosan hoà tan trong nước ở pH<6 và giống như alginate, tạo cấutrúc gel bằng cách gel hoá kích thích ion Chitosan là polycation chứa các nhómamine, nên liên kết với các anion và polyanion như polyphosphate, [Fe(CN)6]+,[Fe(CN)6]3 acid polyaldehydrocarbonic Ngoài ra, chitosan còn được sử dụnglàm vỏ bọc chất gói gelatin Bởi vì không làm tăng khả năng sống của tế bàoprobiotic nên chitosan thường được sử dụng làm vỏ bọc

1.5 Quorum sening và quá trình hình thành bacteriocin

1.5.1 Khái niệm về quorum sening

Trong vòng ba thập kỷ trở lại đây, các nhà khoa học đã khám phá ra quátrình “quorum sening” như là một quá trình truyền thông tin ở thế giới vikhuẩn,đó là việc tổng hợp và dò tìm một loại phân tử tín hiệu (được gọi

làautoinducer)thực hiện điều hoà cho quá trình biểu hiện gen Quá trình này đượcchứng minh là có liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện gene mã hoá các yếu tố độc

lực ở một số loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản như Vibrio harveyi,

V.parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, E.ictaluri

(Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2012) Theo Phạm Minh Nhựt (2010) thì quorumsening là cơ chế thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào, phối hợp với sự biểu