Thiết kế vector baculovirus chứa gen m1 của virus h1n1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới

Tóm tắt luận văn VŨ THỊ THANH NHÀN THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS H1N1, BƢỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 Tóm tắt luận văn Vũ Thị Thanh Nhàn ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ THANH NHÀN THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS H1N1, BƢỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đinh Duy Kháng Hà Nội – Năm 2011 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan virus cúm .3 1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc virus cúm 1.1.2 Đặc điểm phân đoạn gen virus .4 1.1.3 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm tế bào vật chủ 1.1.4 Các kháng nguyên quan trọng virus cúm .8 1.4.1 Hemagglutinin (HA) 1.1.4 Neurominidase (NA) 10 1.1.4.3 Matrix protein ( M1) virus cúm 11 1.1.5 Tình hình dịch bệnh H1N1 14 1.2 Vaccine phòng chống cúm 15 1.2.1 Đại cƣơng vaccine 15 1.2.2 Tổng quan VLPs 18 1.3 Hệ thống biểu Baculovirus 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu 23 2.2.1 Vector tách dòng 23 2.2.2 Vector biểu tế bào côn trùng 24 2.2.3 Hóa chất sinh phẩm 25 2.2.4 Trang thiết bị: 25 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu: 26 2.3.1 Tách chiết RNA tổng số 26 2.3.2 Kiểm tra RNA quang phổ kế 26 2.3.3 Tổng hợp cDNA 27 2.3.4 Nhân gen M1 virus cúm A/H1N1 PCR 28 2.3.5 Điện di gel agarose 29 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 2.3.6 Tách dòng gen 30 2.3.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli 30 2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli 31 2.3.9 Kiểm tra DNA plasmid enzym giới hạn 32 2.3.10 Thu đoạn DNA từ gel agarose 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết tách chiết RNA tổng số 34 3.2 Thiết kế hộp gen M1 virus cúm A/H1N1 34 3.3 Tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2.1 35 3.3.1 Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1 36 3.3.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α 36 3.3.3 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli 37 3.3.4 Chọn lọc vector tái tổ hợp cắt với enzym giới hạn 38 3.4 Tinh plasmid tái tổ hợp 40 3.5 Kết xác đinh trình tự 41 3.6 Thiết kế vector biểu baculovirus mang hộp gen M1 44 3.6.1 Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 chuẩn bị vector pBluBac4.5/V5-HisTOPO 45 3.6.2 Thiết kế vector biểu pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1 .46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 Từ viết tắt Amp APS Bp DNA dNTP E.coli EDTA Ka Kb kDa, Da LB mRNA OD PCR RNA v/p v/v w/v X-Gal ĐẶT VẤN ĐỀ Những thập niên trƣớc, giới có thời gian sống yên ổn với bệnh loại virus gây nhờ thành vaccine, thuốc kháng sinh Nhƣng từ năm 1970 có nghiên cứu cảnh báo xuất vi siêu vi trùng gây đại dịch khả kháng vaccine thuốc Sau đó, từ năm Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 1980 đến cộng đồng y tế giới phải đƣơng đầu với nhiều dịch bệnh xảy nhƣ dịch AIDS dịch bệnh khác kể SARS, cúm gà H5N1, cúm lợn H1N1, dịch bò điên, Ebola v.v Theo dự đoán bệnh dịch tiếp tục phát triển hậu từ việc thay đổi khí hậu mơi trƣờng giới Bệnh cúm A/ H1N1 bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính virus cúm A/H1N1 thuộc họ Othomyxoviridae gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỳ, số quốc gia khác Ban đầu thấy nhiễm lợn nhƣng sau phát loại virus cịn nhiễm nhiều đối tƣợng động vật khác Virus đƣợc phân chia thành nhiều phân type khác dựa kháng nguyên HA NA có bề mặt hạt virus Nhóm virus cúm A có 17 loại kháng nguyên HA (từ H1 đến H17) loại kháng nguyên NA (từ N1 đến N9) [25] Sự tái tổ hợp hai loại kháng nguyên tạo nhiều phân type cúm khác độc tính khả gây bệnh Mặt khác, virus cúm A dễ dàng đột biến gen/ hệ gen (đặc biệt gen mã hóa NA HA) trao đổi gen kháng nguyên với trình xâm nhiễm, tồn lây truyền loài vật chủ để tạo biến thể [30] Các vaccine truyền thống mang lại kết hữu ích cho việc ngăn ngừa chống dịch bệnh, nhiên, việc sử dụng thuốc chế hoạt động biến đổi virus A/H1N1 tế bào vật chủ gây hạn chế tính hiệu vaccine Ngồi chi phí cho sản xuất vaccine cao thời gian tƣơng đối dài Do vấn đề cấp thiết cần phải phát triển công nghệ nhanh chóng tạo vaccine hệ nhằm đối phó với hiểm họa cho cộng đồng tƣơng lai VLPs (Virus like particles) vaccine hƣớng công nghệ sản xuất vaccine hệ có nhiều tính ƣu việt so với vaccine hệ trƣớc Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Từ yêu cầu cấp thiết từ thực tế, thực đề tài : “Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 virus H1N1, bước đầu tạo vaccine hệ mới” Đề tài đƣợc thực phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan virus cúm 1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc virus cúm Bệnh cúm bệnh loài chim động vật có vú siêu vi trùng dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây Họ Orthomyxoviridae đƣợc phát hiện, bao gồm nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm C nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác kháng nguyên bề mặt capsid: virus cúm A B Hemagglutinin, virus cúm C Hemagglutinin Esterase Fusion, Thogotovirus Glycoprotein Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hình khối đa diện, đơi có dạng hình sợi, đƣờng kính 80 – 120 nm, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.1 A) Kết phân tích thành phần hóa học cho thấy hạt virus có chứa khoảng 0,8 1,1% RNA; 70 – 75% protein; 20 – 24% lipid – 8% carbonhydrate [25] Hệ gen virus cúm A RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, bao gồm phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác virus gồm: HA, NA, M (M1 M2), NP, NS (NS1 NS2), PA, PB1, PB1 - F2 PB2 [7] Mỗi phân đoạn RNA virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn α đối xứng, dài 50 – 100 nm, đƣờng kính – 10 nm, đƣợc bao bọc nucleoprotein có chất lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1 B) Mỗi RNP kết hợp với protein enzym polymerase chịu trách nhiệm trình phiên mã chép RNA virus Các phân đoạn hệ gen virus cúm A nối với cầu nối peptide tạo dạng vòm giới hạn cuối phân đoạn tạo thành sợi RNA có tổng độ dài từ 10kb – 15 kb (tuỳ theo chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thơng tin di truyền có cấu trúc xoắn α bên vỏ virus [25] Bao bọc hạt virus lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đƣợc gắn protein màng virus, đóng vai trị bảo vệ vật chất di truyền RNA Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn virus Bề mặt vỏ đƣợc bao phủ glycoprotein phân bố dày đặc Mỗi glycoprotein có kích thƣớc dài khoảng 10 – 14 nm, đƣờng kính – nm Virus cúm có hai loại protein kháng ngun đóng vai trị quan trọng trình xâm nhiễm virus haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) Các phân tử HA NA phân bố không đồng (cứ – phân tử HA có phân tử NA) [25] Ngồi bề mặt vỏ cịn có protein M2 nằm xun qua màng lipit kép hoạt động nhƣ kênh vận chuyển ion Xen hạt virus vỏ lớp protein M1 (matrix) A B Hình 1.1: Virus cúm A/H1N1 chụp kính hiển vi (A) hình ảnh mô cấu trúc ribonucleoprotein (B) Virus cúm A/H1N1 tƣơng đối nhạy cảm với tác nhân vật lí hóa học Ngun nhân lớp vỏ ngồi có chất lớp lipid kép nên dễ bị phá hủy dung mơi hịa tan lipid, chất tẩy rửa chất sát trùng Các hạt virus tồn thích hợp khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn 100 o o o C 60 C 30 phút, bị bất hoạt C 30 ngày, tồn thể ngƣời – ngày 1.1.2 Đặc điểm phân đoạn gen virus Virus cúm có hệ gen RNA sợi đơn âm gồm phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ – theo thứ tự giảm dần kích thƣớc phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1.2) Trong hệ gen phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; có độ dài tƣơng đối ổn Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt: [1] Nội [2] Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1997), sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Phạm Việt Cƣờng, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008) Vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype tương đồng kháng ngun – miễn dịch – vaccine Tạp chí cơng nghệ sinh học 6(4).tr 529 – 560 [3] Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Vă Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Trần Bình (2004) Virus cúm A gia cầm mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người Tạp chí cơng nghệ sinh học, 2(1):1[4] Văn Thị Nhƣ Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Phƣớc Hải, Trƣơng Văn Dung, Trƣơng Nam Hải, Biểu gen HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Hemagglutinin (HA) virus cúm A/H5N1 Escherichia coli Tạp chí cơng nghệ sinh học, 2007; 5(3): 313-320 [5] Nội Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học sở, Nxb Đại học Quốc gia Hà [6] Tô Long Thành (2004) Bệnh cúm gia cầm người vấn đề phịng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XI, số 3, trang 76-83 [7] Phạm Văn Ty (2005) Virus học Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng anh: 49 Luận văn thạc sĩ sinh học [8] Vũ Thị Thanh Nhàn RNAon R, Ben-Yedidia T (2009) Preclinical efficacy of a virus-like particle-based vaccine against avian influenza H5N1 Future Microbiol 4:503-5 [9] Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology DNA potential drug targets Infect Disord Drug Targets 7(4): 282-93 Review [10] Bosch F X., M Orlich, H D Klenk, R Rott (1979), “The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogencity of influenza viruses”, Virolory, 95, pp 197-207 [11] Bosch FX, Garten W, Klenk HD, Rott R (1981) Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 DNA HA2 determines proteolytic cleavability DNA pathogenicity of avian influenza viruses Virology 113: 725-735 [12] Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Atmad A (2007) Influenza virus-like particles elicit broader immuno responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin Vaccine 25: 38713878 [13] Chackerian B (2007) Virus-like particles: flexible platforms for vaccine development Expert Rev Vaccines (3): 381-390 [14] Crawford AM, Miller LK (1998) Characterization of an early gene accelerating expression of late genes of the baculovirus Autographa carlifornia nuclear polyherosis virus J Virology 62: 2773-2781 [15] De Wit E, Fouchier RA (2008) Emerging influenza J Clin Virol 41(1): 1-6 Review [16] Eric Ka – wai Hui, Subrata Barman, Domimic Ho – Ping Tang, Bryan FRNAce DNA Debi P Nayak, YRKL sequence of Influenza virus M1 funtion as the domain motif DNA interracts with VPS28 DNA CDc42 [17] Fedson DS (2005) Preparing for pDNAemic vaccination: an international policy agenda for vaccine development J Public Health Policy 26: 4-29 50 Luận văn thạc sĩ sinh học [18] Vũ Thị Thanh Nhàn Galarza JM, Latham T, Cupo A (2005) Virus-like particle (VLP) vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge Viral Immunol 18: 244-251 [19] Grgacic EV, DNAerson DA (2006) Virus-like particles: passport to immune recognition Methods 40:60-5 [20] Joel R Haynes , Leslie Dokken , James A Wiley , DNArew G Cawthon , John Bigger, Allen G Harmsen, Charles Richardson (2009) Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge Vaccines 27: 530-541 [20] J S Malik Peiris, Menno D de Jong, DNA Yi Guan( 2007), Avian Influenza Virus: a Threat to Human Health, p 243-267, Vol 20, No [21] Kang SM, Pushko P, Bright RA, Smith G, Compans RW (2009) Influenza virus-like particles as pDNAemic vaccines Curr Top Microbiol Immunol 333:269-89 [22] Kozak M (1987) An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs Nucleic Acids Res 15:8125–8148 [23] Neirynck S, Deroo T, Saelens X, VanlDNAschoot P, Jou WM, Fiers W (1999) A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein Nat Med (10): 1157-1163 [24] Nicholson KG (2009) Influenza DNA vaccine development: a continued battle Expert Rev Vaccines 8: 373-374 [24] M.Uiprasertkul et al, Apoptosis DNA Pathogensis of Avian Influenza A (H5N1) Virus in Humans, Emerging Infectious Diseases, 13 (5):708-712 (2007) [25] Murphy B.P, Webster R.G ( 1996), Orthhomyxoviruses, In Flields BN, rd Knipe DM, Howley, fields virology, ed, Lippincott- Raven Publisher, Philadenphia, PA,pp 1397 - 1445 51 Luận văn thạc sĩ sinh học [26] Vũ Thị Thanh Nhàn Peter pushko, Terrence M Tumpey, Fang Bu, John knell, Robin Robinson, Gale Smith (2005) Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, DNA M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice Vaccines 23: 5751-5759 [27] Qiao C, Tian G, Jiang Y, Li Y, Shi J, Yu K, Chen H (2006) Vaccines developed for H5 highly pathogenic avian influenza in China Ann N Y Acad Sci 1081: 182-192 [28] Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong MD, Vijaykrishna D, Usman TB (2006) Evolution DNA adaptation of H5N1 influenza virus in avian DNA human hots Indonesia DNA Vietnam Virology 350: 68-258 [29] Song JM, Hossain J, Yoo DG, Lipatov AS, Davis CT, Quan FS, Chen LM, Hogan RJ, Donis RO, Compans RW, Kang SM (2010) Protective immunity against H5N1 influenza virus by a single dose vaccination with virus-like particles Virology 405:165-75 [30] Webster RG (1998) Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis 4: 436-441 [31] Wetherall NT, Trivedi T, Zeller J, Hodges-Savola C, McKimm- Breschkin JL, Zambon M, Hayden FG Evaluation of neuraminidase enzyme assays using different substrates to measure susceptibility of influenza virus clinical isolates to neuraminidase inhibitors: report of the neuraminidase inhibitor susceptibility network J Clin Microbiol 2003; 41: 742-750 [32] Wiley, D C., I A Wilson, DNA J J Skehel 1981 Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin DNA their involvement in antigenic variation Nature 289:373378 52 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết so sánh trình tự gen mã hóa protein M1 phân lập Việt Nam với trình tự công bố ngân hàng gen quốc tế Alignment DB:ID EM_VI:AY770077 EM_VI:AY684709 53 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn EM_VI:DQ997536 virus 8.4e197 EM_VI:AY950237 virus 8.4e197 EM_VI:AY950239 virus 8.4e197 EM_VI:AY950240 virus 8.4e197 EM_VI:DQ997258 virus 8.4e197 EM_VI:AY950241 virus 8.4e197 EM_VI:AY676045 virus 8.5e197 EM_VI:AY651415 virus (A/feral 8.5e197 EM_VI:AY575898 virus 8.6e197 EM_VI:AY651378 virus 2.8e196 10 11 12 (A/Ck/Indon 54 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 13 EM_VI:AY575901 virus 2.8e196 14 EM_VI:AY651407 virus 2.8e196 15 EM_VI:AY651414 virus 2.8e196 16 EM_VI:DQ320992 virus 2.8e196 17 EM_VI:AY651410 virus 2.8e196 EM_VI:AY585398 virus 3e196 EM_VI:AY651416 virus 3.2e196 EM_VI:AY950243 virus 5.4e196 EM_VI:DQ997171 virus 9.1e196 EM_VI:AB212057 virus(A/Hong 9.1e196 18 19 20 21 22 55 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 23 EM_VI:DQ997170 virus 9.1e196 24 EM_VI:AY737292 virus 9.1e196 25 EM_VI:DQ366333 virus 9.1e196 26 EM_VI:AY575900 virus 9.2e196 27 EM_VI:AY575894 virus 9.2e196 EM_VI:AY575893 virus 9.2e196 EM_VI:AY651403 virus 9.2e196 EM_VI:DQ094265 virus 9.2e196 EM_VI:AY651406 virus 9.2e196 EM_VI:DQ320987 virus 9.2e196 28 29 30 31 32 56 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 33 EM_VI:AY651376 virus 9.2e196 34 EM_VI:DQ492916 virus 9.2e196 35 EM_VI:DQ320998 virus 9.2e196 36 EM_VI:DQ492932 virus 9.2e196 37 EM_VI:DQ492920 virus 9.2e196 EM_VI:DQ492918 virus 9.2e196 EM_VI:AY575897 virus 9.2e196 EM_VI:DQ492933 virus 9.2e196 EM_VI:DQ492941 virus 9.2e196 EM_VI:AY651374 virus 9.2e196 38 39 40 41 42 57 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 43 EM_VI:DQ492921 virus 9.2e196 44 EM_VI:DQ492915 virus 9.2e196 45 EM_VI:DQ320985 virus 9.2e196 46 EM_VI:DQ320986 virus 9.3e196 47 EM_VI:AY651417 virus 9.3e196 EM_VI:DQ492907 virus 9.3e196 EM_VI:DQ492917 virus 9.3e196 EM_VI:DQ492908 virus 9.3e196 48 49 50 58 ... với vaccine hệ trƣớc Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Từ yêu cầu cấp thiết từ thực tế, thực đề tài : ? ?Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 virus H1N1, bước đầu tạo vaccine hệ mới? ??... ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ THANH NHÀN THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS H1N1, BƢỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30... Nhân gen M1 virus cúm A/H1N1 PCR cDNA virus cúm A/H1N1 đƣợc sử dụng làm khn để nhân dịng gen mã hóa protein M1 với cặp mồi đặc hiệu M1pBac-F M1pBac-R đƣợc thiết kế dựa trình tự gen M1 cơng bố Genbank,