Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống gừng trâu (zingiber officinale (willd ) roscoe)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN PHƢƠNG QUÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO GIỐNG GỪNG TRÂU (ZINGIBER OFFICIALE (WILLD.) ROSCOE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 12/2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN PHƢƠNG QUÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO GIỐNG GỪNG TRÂU (ZINGIBER OFFICIALE (WILLD.) ROSCOE) Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Khả Tƣờng TS Lê Quỳnh Mai Hà Nội - 12/2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ bắt đầu làm luận văn đến nay, em nhận quan tâm, bảo, giúp đỡ thầy cơ, gia đình bạn bè xung quanh Với lịng biết ơn vơ sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành từ đáy long đến quý Thầy Cô Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội dùng tri thức tâm huyết để truyền đạt cho chúng em vốn kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn GS TSKH Lê Khả Tường TS Lê Quỳnh Mai tận tâm bảo hướng dẫn em qua buổi học, buổi nói chuyện, thảo luận đề tài nghiên cứu Nhờ có lời hướng dẫn, dạy bảo đó, luận văn em hoàn thành cách suất sắc Một lần nữa, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Luận văn hoàn thành Trung tâm tài nguyên Thực vật Để đạt kết này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới ban lãnh đạoTrung tâm tài nguyên Thực vật, phòng ngân hàng gen invitro đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến cô Phạm Thị Kim Hạnh trực tiếp tận tình bảo, dìu dắt, giúp đỡ em Nhờ bảo hường dẫn quý suốt q trình triển khai, nghiên cứu hồn thành đề tài cách tốt Em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu đồng nghiệp Trường Đại học Hùng Vương nơi em học tập công tác tạo điều kiện tốt để em tập trung học tập hoàn thành tốt luận văn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Đặc điểm hình thái, thành phần dinh dƣỡng gừng .3 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Thành phần hóa sinh, dinh dƣỡng gừng 1.1.3 Đặc điểm giống gừng G10 1.2 Công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào 1.2.1 Ƣu điểm - Nhƣợc điểm công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào 1.2.2 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào 1.2.3 Kỹ thuật ni cấy ngồi vƣờn ƣơm 1.3 Những nghiên cứu nuôi cấy mô gừng 10 1.3.1 Những nghiên cứu giới 10 1.3.2 Những nghiên cứu nƣớc 14 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phƣơng pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học 17 2.2.2 Phƣơng pháp khử trùng mẫu 18 2.2.3 Phƣơng pháp nuôi cấy lớp tế bào mỏng từ lát cắt tế bào .18 2.2.4 Phƣơng pháp ni trồng ngồi vƣờn 18 2.2.5 Môi trƣờng nuôi cấy in vitro 18 2.2.6 Bố trí thí ngiệm 19 2.2.7 Thu thập số liệu 21 2.2.8 Phân tích xử lý số liệu 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết điều tra, đánh giá đặc điểm sinh học giống gừng G10 .24 3.2 Nghiên cứu quy trình nhân giống vơ tính in vitro cho giống gừng G10 25 3.2.1 Thiết lập hệ nuôi cấy vô trùng 25 3.2.2 Nghiên cƣƣ́u môi trƣờng nuôi cấy tạo chồi callus từ lát cắt mô non .27 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả nhân tạo chồi callus 29 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả nhân nhanh chồi đƣợc tạo thành từ lát cắt mô non 32 3.2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đên phát triển hoàn chỉnh in vitro 34 3.3 Nghiên cứu quy trình ni trồng vƣờn ƣơm cho giống gừng G10 37 3.3.1 Nghiên cứu huấn luyện trƣớc đƣa vƣờn ƣơm 37 3.3.2 Ảnh hƣởng giá thể đến vƣờn ƣơm 38 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng phân bón đến vƣờn ƣơm 40 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng ánh sáng đến vƣờn ƣơm 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D BAP CT CV% CĐAS DTL ĐHST HSN NAA KI LSD 0,05 MS MT PSHT PVP TGST DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lƣợng gừng số nƣớc giới 11 Bảng 2.1 Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng, phát triển 17 Bảng 2.2 Thành phần môi trƣờng MS 19 Bảng 3.1 Đặc điểm nông sinh học số giống gừng đƣợc trồng trung tâm tài nguyên Thực vật 24 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến sinh trƣởng mẫu chồi 25 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả phát sinh hình thái mẫu lát cắt mô non (sau tuần) 27 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng chất điều hóa sinh trƣởng đến khả nhân callus hình thái callus sau giai đoạn nhân 29 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng casein hydrolysate đến q trình phát sinh phơi tái sinh callus 31 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng VTM B1 đến khả nhân sức sống chồi 33 Bảng3.7 Ảnh hƣởng NAA đến sinh trƣởng phát triển in vitro 34 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng trạng thái môi trƣờng đến sinh trƣởng gừng G10 (sau 15 ngày) 36 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng thời gian tập huấn gừng G10 trƣớc đƣa vƣờn ƣơm 37 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng loại giá thể đến tỷ lệ sống giống gừng G10 vƣờn ƣơm (sau tháng) 39 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng phân bón đến vƣờn ƣơm 40 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng đến sinh trƣởng gừng G10 ngồi vƣờn ƣơm 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái phận Gừng (Zingiber officinale)[36] .4 Hình 3.1 Mẫu ni cấy sau khử trùng 26 Hình 3.2 Mẫu cát lát đƣợc nuôi cấy môi trƣờng 28 Hình 3.3 Hệ số nhân callus tƣơng ứng với hàm lƣợng NAA bổ sung mơi trƣờng ni cấy 30 Hình 3.4 Mẫu môi trƣờng nhân nhanh callus 30 Hình 3.5 Mẫu ni cấy mơi trƣờng bổ sung 1,5g/l casein hydrolysate sau 1,5 tháng 32 Hình 3.6 Chồi đƣợc nuôi cấy môi trƣờng bổ sung vitamin B1 34 Hình 3.7 Cây gừng G10 in vitro mơi trƣờng rễ sau tháng 35 Hình 3.8 Cây rễ môi trƣờng lỏng sau 15 ngày ni cấy 37 Hình 3.9 Cây cƣờng độ ánh sáng 5000lux sau tuần 43 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Gừng (Zingiber officinale Rosc) dƣợc liệu truyền thống Việt Nam nhƣ nhiều nƣớc nhiệt đới cận nhiệt đới với mục đích chủ yếu làm gia vị, thực phấm dƣợc liệu Tại nƣớc phƣơng Tây, gừng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho việc sản xuất bánh nƣớng, bánh ngọt, mứt tết… Bia gừng rƣợu gừng đƣợc sử dụng rộng rãi làm đồ uống hay thực phẩm chức Đặc biệt, gừng đƣợc sử dụng nhƣ loại dƣợc liệu truyền thống hỗ trợ điều trị bệnh tiêu hóa, thần kinh, tim mạch xƣơng khớp [2] Để cung cấp nguyên liệu cho nhà máy chế biến, gừng đƣợc sản xuất nhiều nƣớc giới nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Jamaica, Đài Loan… Theo kết thống kê chƣa đầy đủ, sản lƣợng tiêu thụ gừng giới đạt khoảng 2,5 triệu tấn/năm [42] Trong đứng đầu Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Vƣơng quốc Anh, Hoa Kỳ, Ả Rập Saudi, Nepal Thái Lan với sản lƣợng khoảng 1,7 triệu tấn/năm, tƣơng ứng với 70% sản lƣợng gừng toàn cầu[42] Gừng trồng có hoa nhƣng lại khơng có khả hình thành hạt việc nhân giống phát triển hệ đƣợc thực đƣờng sinh sản vơ tính từ củ gừng Với phƣơng pháp nhân giống truyền thống từ việc phân chia hom từ nguồn củ sống đồng ruộng có nhiều nhƣợc điểm nhƣ nguy lây nhiễm bệnh cao, hom giống không đồng tuổi sinh lý, tiêu tốn nhiều số lƣợng củ giống Từ làm tăng giá thành sản xuất tăng chi phí đầu tƣ Các giống gừng suất cao chƣa đƣợc chọn lọc Các yếu tố làm cản trở việc gừng thành hàng hóa xuất gừng nƣớc ta Trong việc nhân nhanh giống gừng công nghệ nuôi cấy mô tế bào có ƣu điểm ni cấy in vitro bệnh từ đầu, tạo đồng chất lƣợng tuổi sinh lý với số lƣợng lớn kết hợp với khâu chọn giống tốt, công nghệ vƣờn ƣơm biện pháp phòng trừ tổng hợp tạo đƣợc ngành công nghệ sản xuất gừng chất lƣợng cao Kỹ thuật nhân giống gừng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thành công nhiều nƣớc châu Á nhƣ Malayxia, Indonesia Ấn độ Nhân dịng vơ tính gừng thơng qua nhân nhanh chồi đỉnh đƣợc công bố Hosoki & Sagawa(1977), Balachandran(1990), Rout & Das(1997) Nhờ phƣơng pháp tăng nhanh diện tích sản xuất giống gừng có chất lƣợng cao, bệnh đồng thời nhân giống ni cấy mơ giảm mức đầu tƣ giống tiết kiệm đến 40% chi phí giống ban đầu [3] Tuy nƣớc ta tốc độ phát triển nhanh gừng nên công nghệ nuôi cấy mơ gừng thơng thƣờng chƣa có đủ khả đáp ứng đƣợc nhu cầu khối lƣợng giống cho địa phƣơng Nuôi cấy in vitro với công nghệ nuôi cấy lát mỏng phát sinh callus môi trƣờng phù hợp, sau thời gian ngắn tạo khối lƣợng lớn callus để tái sinh thành hồn chỉnh giải pháp có khả sản xuất hàng loạt giống đạt tốc độ nhanh nhằm khắc phục hạn chế nêu nuôi cấy mô truyền thống Kết hợp với nhu cầu thị trƣờng, giống gừng trâu (G10) đƣợc chọn lọc có chất lƣợng tốt phát triển mạnh Trung Quốc giống gừng có tiềm phát triển lớn Việt Nam[18] Trên sở chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống gừng trâu (Zingiber officinale (Willd.) Roscoe)” Phòng nuôi cấy mô thuộc Ngân hàng gen trồng quốc gia - Trung tâm Tài nguyên Thực Vật - Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT NL * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.665437 REGRESSION SLOPE=-0.24728E-01 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = PLOT OF LS RESIDUALS AGAINST FITTED VALUES BOX PLOT OF STUDENTIZED RESIDUALS FROM LPLT= -1.364 NO.