Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Thu Huyền PHÂN LẬP VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH KERATINAZA VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZIM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS NGUYỄN ĐÌNH QUYẾN Hà Nội - Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 1.1 Cấu trúc tính chất keratin…………………………………………….4 1.1.1 Cấu trúc keratin……………………………………………………… 1.1.2 Tính chất keratin………………………………………………………7 1.1.3 Các nguồn keratin …………………………………………………………8 1.2 Tình hình khai thác sử dụng keratin nay…………………………….8 1.2.1 Tình hình khai thác sử dụng keratin giới………………………9 1.2.2 Tình hình khai thác sử dụng keratin Việt Nam………………………11 1.3 Sự phân huỷ keratin tự nhiên………………………………………….11 1.4 Các phƣơng pháp phân huỷ keratin…………………………………………13 1.4.1 Phƣơng pháp lý hoá……………………………………………………….13 1.4.2 Phƣơng pháp sinh học…………………………………………………….14 1.5 Đặc điểm enzim keratinaza vi sinh vật……………………………….14 1.6 Một số ứng dụng keratinaza…………………………………………….16 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………… 21 2.1 Vật liệu, hoá chất thiết bị…………………………………………… 21 2.1.1 Vật liệu…………………………………………………………………… 21 2.1.2 Hố chất……………………………………………………………………21 2.1.3 Thiết bị, máy móc thí nghiệm………………………………………………24 2.2 Phƣơng pháp…………………………………………………………………24 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất……… …… 24 2.2.2 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào khả sinh bào tử chủng sinh keratinaza …………………………………25 2.2.3 So sánh hoạt tính keratinaza chủng vi khuẩn sinh keratinaza…….26 2.2.4 Xác định số điều kiện tối ƣu hố mơi trƣờng nuôi cấy …………… 27 2.2.4.1 Xác định ảnh hƣởng lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy…… 27 2.2.4.2 Xác định ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu……….…… 28 2.2.4.3 Xác định ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu….…… 28 2.2.5 Xác định ảnh hƣởng pH, nhiệt độ số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza……………………………………………………………………… 28 2.2.5.1 Xác định hoạt tính keratinaza……………………………………………28 2.2.5.2 Xác định ảnh hƣởng pH ………… ……………………………… 29 2.2.5.3 Xác định ảnh hƣởng nhiệt độ ………….……………………………29 2.2.5.4 Xác định ảnh hƣởng số ion kim loại.………………………… 30 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….31 3.1 Sự phân rã lông gà đƣợc sử dụng làm nguồn cacbon nitơ để ni cấy vi khuẩn có hoạt tính keratinaza…………………………………….31 3.2 Một số đặc điểm chủng có hoạt tính keratinaza … ……………….32 3.3 Xác định chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza mạnh …………… 34 3.4 Một số điều kiện tối ƣu hố mơi trƣờng ni cấy………………………… 36 3.4.1 Ảnh hƣởng lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy……………… 36 3.4.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu……….……………… 37 3.4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu….……………… 38 3.5 Một số đặc tính keratinaza…………………………………………… 38 3.5.1 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính keratinaza………………………………38 3.5.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza…………………………40 3.5.3 Ảnh hƣởng số ion kim loại……………………………………….42 KẾT LUẬN………………………………………………………………………44 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………… 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… 46 MỞ ĐẦU Trong năm qua, proteaza nhóm enzim thuỷ phân đƣợc nghiên cứu nhiều ngành công nghiệp enzim Hiện nay, proteaza chiếm khoảng 60 65% thị trƣờng enzim công nghiệp giới; bao gồm 28% proteaza kiềm, 10% renin 21% loại proteaza khác (1) Proteaza kiềm đƣợc ứng dụng nhiều ngành: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, chăn nuôi, may mặc, thuộc da, xử lý môi trƣờng, thu hồi bạc từ phim, Keratinaza thuộc nhóm proteaza kiềm, hoạt động chất keratin, năm gần đƣợc quan tâm nghiên cứu tiềm ứng dụng chúng Keratin nhóm protein tự nhiên, thành phần cấu tạo nên loại lơng, tóc, móng, sừng,… Lơng gà trƣởng thành chiếm - 7% trọng lƣợng sống Trên giới, năm có tới 24 tỉ gà khoảng 8,4 triệu lông vũ đƣợc thải từ ngành công nghiệp gia cầm (31), mức tăng hàng năm lên tới khoảng 4.5% (18) Hàm lƣợng protein lông vũ cao, chiếm tới 90%, nên coi nguồn protein tiềm lớn khai thác làm thức ăn cho chăn nuôi nhiều ứng dụng khác Tuy nhiên, keratin lại loại protein bền nhờ có liên kết disulfua phân tử Vì vậy, chúng có tính ổn định học cao, có khả chống chịu tốt với tác động vật lý, hố học sinh học, khơng bị phân huỷ nƣớc proteaza thông thƣờng nhƣ: trypsin, papain pepsin Các nhà máy thuộc da, lơng thú lị giết mổ gia súc, gia cầm vứt bỏ lƣợng đáng kể vật liệu chứa keratin: lơng, len, sừng, móng,… Ở Việt Nam, phần nhỏ số chúng đƣợc sử dụng chủ yếu sản xuất số sản phẩm thủ cơng, may mặc; phần lớn cịn lại đƣợc loại bỏ xử lý đơn giản nhƣ đốt, chôn chất thành đống rác lớn chƣa có phƣơng pháp xử lý gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng Trên giới, trƣớc ngƣời ta áp dụng phƣơng pháp xử lý lông vũ cách thuỷ phân môi trƣờng kiềm nhiệt độ áp suất cao Tuy nhiên, phƣơng pháp không phá huỷ số axit amin ( nhƣ: metionin, lysin, histidin) mà tiêu thụ lƣợng lớn lƣợng Thuỷ phân lơng vũ nhờ vi sinh vật có hoạt tính keratinaza phƣơng pháp thay đƣợc lựa chọn đem lại hiệu cao, khắc phục đƣợc hạn chế phƣơng pháp cũ Ngoài ra, bên cạnh việc tạo nguồn protein bổ sung vào thức ăn chăn ni, xử lý đƣợc nguồn rác khó phân giải góp phần chống nhiễm mơi trƣờng keratinaza đƣợc phân lập từ vi sinh vật đóng vai trị quan trọng ứng dụng công nghệ sinh học khác nhƣ: loại bỏ lông ngành công nghiệp thuộc da , làm vật cản lơng vũ hệ thống nƣớc thải, phịng chống bệnh bò điên (21),… Tuy nhiên, hạn chế lớn ảnh hƣởng đến ổn định độ pH kiềm tính enzym có ổn định phạm vi pH rộng nhƣng thƣờng khơng ổn nhiệt Vì vậy, ngƣời ta mong muốn tìm kiếm protease với đặc tính lạ từ nhiều nguồn khác (34) Trong năm gần đây, nhà khoa học giới có nhiều nghiên cứu vi sinh vật có hoạt tính keratinaza, đặc điểm ứng dụng chúng, bƣớc đầu phục vụ cho phân huỷ lông vũ dùng làm thức ăn cho gia súc đem lại hiệu tốt (4, 10, 11, 14, 16, 23, 26, 27, 42) Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu lĩnh vực chƣa có nhiều việc ứng dụng chúng cịn hạn chế, hầu hết lơng vũ từ lò giết mổ đƣợc coi rác thải; với đó, việc xử lý rác thải chƣa đƣợc quan tâm nhiều Đề tài "Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza số đặc tính enzim" đƣợc thực nhằm: - Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ mẫu đất khác xác định đƣợc chủng có hoạt tính tốt - Một số điều kiện tối ƣu hàm lƣợng lông, nhiệt độ pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu cho nuôi chủng sinh keratinaza - Một số đặc tính enzim, nhƣ hoạt động tốt điều kiện nhiệt độ, pH có mặt ion Từ ứng dụng vào thực tiễn góp phần xử lý rác thải lơng vũ cách hiệu quả, tận dụng nguồn protein bị bỏ phí làm thức ăn bổ sung chăn ni mở rộng sang nhiều ứng dụng khác đƣợc tiếp tục nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA KERATIN 1.1.1 Cấu trúc keratin Trong lịch sử, thuật ngữ keratin dùng cho tất protein chiết xuất từ biến đổi da, chẳng hạn nhƣ lơng, sừng, móng vuốt móng guốc Sau đó, ngƣời ta nhận keratin thực hỗn hợp keratin, keratin liên quan đến protein protein khác, chẳng hạn nhƣ enzim Keratin sau đƣợc định nghĩa số protein hình thành sợi với đặc tính hóa lý cụ thể chiết xuất từ lớp hố sừng biểu bì, protein hình thành lơng, tóc đƣợc chiết xuất từ lớp biểu bì đƣợc nhóm lại ''prekeratin'' ''cytokeratin'' Nhƣ vậy, keratin nhóm protein có cấu trúc dạng sợi với đặc tính hố lý cụ thể, thành phần cấu tạo nên lơng, tóc, móng, sừng, biểu mơ tế bào động vật có xƣơng sống… Trọng lƣợng phân tử keratin động vật có vú từ 40 đến 70 kDa Trong số loại axit amin tạo nên phân tử keratin cystein phổ biến (có thể chiếm tới 24%), ngồi ra, keratin từ lơng gia cầm chứa hàm lƣợng cao axit amin nhƣ: glycin, alanin, serin valin Ngoài liên kết hydro nội phân tử liên phân tử, keratin có hàm lƣợng lớn lƣu huỳnh có chứa cystein, tạo cầu disunfua cho keratin Keratin đƣợc tạo tế bào sừng - tế bào sống tạo nên phần lớn lơng, tóc, móng, da,…Sau đó, tế bào chết bao phủ bên có tác dụng bảo vệ Các α-keratin -cuộn sợi protein (thƣờng có liên kết hiđro chuỗi ), sau tiếp tục xoắn vào dây siêu xoắn để tiếp tục cuộn β - keratin có β xoắn lại với nhau, sau đƣợc ổn định làm cứng cầu disunfua Keratin đƣợc phân loại cụ thể theo cấu trúc phân tử chúng, đặc điểm hóa lý , tế bào biểu mơ sản xuất loại biểu mơ có chứa tế bào sản xuất keratin Theo cấu tạo, keratin có loại chính: -keratin: Trong tóc, lơng cừu, sừng, móng tay, móng chân, móng guốc động vật có vú Cấu tạo sợi đơn protein liên kết với liên kết hiđro Xoắn alpha keratin chuỗi xoắn alpha đúng, có 3,5 dƣ lƣợng / lƣợt; xoắn alpha bình thƣờng có 3,6 dƣ lƣợng / lƣợt Điều quan trọng để tạo thành liên kết disunfua chặt chẽ Ngoài ra, khoảng cuối dƣ lƣợng thứ bảy axit amin lơxin, để chúng xếp giúp sợi liên kết lại với thông qua tƣơng tác kỵ nƣớc -keratin: Trong móng tay, móng vuốt lồi bị sát, họ vỏ testudines (ba ba, rùa), lơng, mỏ, móng vuốt lồi chim lơng nhím, đƣợc hình thành chủ yếu beta, cứng anpha beta đƣợc nối với cầu disulfua Hình 1.1 Cấu trúc keratin Các monome keratin lắp ráp lại thành bó để tạo thành sợi trung gian từ tạo thành mơ khơng khống hố bền vững gặp lồi bị sát, chim, lƣỡng cƣ động vật có vú Hình 1.2 Các dạng cấu trúc keratin a Cấu trúc miền phụ chuỗi keratin biểu bì hiển thị cuối vùng E1 E2 ngắn, glycin / serin vùng giàu V1 V2, khu vực tương đồng H1 H2 (Steinert 1993) b Cấu trúc miền phụ chuỗi a-keratin cứng (NB) axit (NA) khu vực miền N-thiết bị đầu cuối Miền thiết bị đầu cuối loại chuỗi đặc trưng motif proline-cysteine-X lặp lặp lại.Miền C-thiết bị đầu cuối loại dây chuyền II có chứa phân bố định kỳ dư lượng kỵ nước (Parry North,1998) c Mơ hình cấu trúc keratin cuộn cuộn dây dimer, chiều dài 45 nm.Các axit amin kỵ nước hai xoắn-khớp với mơ hình lồng vào thường xuyên (Cohlberg,1993) d Tổ chức microfibrils keratin, đầu hình cầu, (màu đen) Các thiết bị đầu cuối tương tác với phân đoạn sợi với tên miền C khác phân tử lân cận phản song song (Parry North,1998) 1.1.2 Tính chất keratin 34 Sidra Aftab, Samia Ahmed , Sadia Saeed , Sheikh Ajaz Rasool (2006) Screening, Isolation and Characterization of Alkaline Protease Producing Bacteria from Soil Pakistan Journal of Biological Sciences , , 2122 - 2126 35 Suntornsuk, W.; Suntornsuk, L (2003) Feather degradation by Bacillus sp FK 46 in submerged cultivation Bioresour Technol., 86, 239-243 36 Steinert, PM, Parry, DAD (1993 ) The conserved H1 domain of the type II keratin chain plays an essential role in the alignment of nearest neighbor molecules in mouse and human keratin 1/keratin 10 intermediate filaments at the two- to four-molecule level of structure J Biol Chem 2878–2887 37 Steinert, P M (1993) Structure, function, and dynamics of keratin intermediate filaments Journal of Investigative Dermatology, 100, 729–734 38 Takami, H.; Nogi, Y.; Horikoshi, K (1999) Reidentification of the keratinaseproducing facultatively alkaliphilic Bacillus sp no AH-101 as Bacillus halodurans Extremophiles, 3, 293-296 39 Takiuchi, I.; Higuchi, D.; Sei, Y.; Koga, M (1982) Isolation of an extracellular proteinase (keratinase) from Microsporum canis Sabouraudia, 20, 281-288 40 Wang J.J., Shih J.C.H.(1999) Fermentation production of keratinase from Bacillus licheniformis PWD-1 and a recombinant B subtilis FSB-29, J Ind Microbiol Biotechnol 22,608 41 Wawrzkiewicz, K.; Wolski, T.; Lobarzawski, J (1991) Screening the keratinolytic activity of dermatophytes in vitro Mycopathologia, 114, 1-8 42 Williams, C.M.; Lee, C.G.; Garlich, J.D.; Shih, J.C.H (1991) Evaluation of a bacterial feather fermentation product, feather lysate, as a feed protein Poultry Science, 70, 85-94 43 Wojciech Łaba, Anna Rodziewicz (2010) Keratinolytic Potential of FeatherDegrading Bacillus polymyxa and Bacillus cereus.Polish J of Environ Stud Vol 19, No (2010), 371-378 44 Yamamura, S., Morita, Y., Hasan, Q., Yokoyama, K., & Tamiya, E (2002) Keratin degradation: A cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp Biochemical and Biophysical Research Communications, 294, 1138–1143 45 Yu, R.J.; Harmon, S.R.; Grappel, S.F.; Blank, F (1971) Two cell-bound keratinases of Trichophyton mentagrophytes J Invest Dermatol., 55, 27-32 PHỤ LỤC Từ mẫu đất nghiên cứu phân lập đƣợc 13 chủng vi khuẩn dựa khác hình thái khuẩn lạc nhƣ sau: Chủng H1 (Kr1) H2 (Kr2) H3 (Kr3) H4 (Kr4) H5 H6 (Kr5) H7 (Kr6) H8 H9 H10 H11 H12 H13 PHỤ LỤC Keratin bảng đƣợc phân loại hai cột theo danh pháp đƣợc thành lập vào năm 2006 Tên gọi khác trƣớc đƣợc sử dụng đƣợc liệt kê cột I Keratin nhóm I * Keratin biểu mơ người Tên protein K9 K10 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K20 K23 K24 K25 K26 K27 K28 KRT28 Ka41, K25irs4, hIRSa2 * Keratin lơng, tóc người Tên protein K31 K32 K33a K33b K34 K35 K36 K37 K38 K39 K40 * Keratin khơng có người Tên protein K41 tinh tinh, KRT41 tinh tinh, khỉ đột, gorilla K42 chuột * Pseudogene keratin người Tên protein II Keratin nhóm II * Keratin biểu mơ người Tên protein K1 K2 K3 K4 K5 K6a K6b K7 K8 K71 K72 K73 K74 K75 K76 K77 K78 K79 K80 * Keratin lơng, tóc người Tên protein K81 K82 K83 K84 K85 K86 * Pseudogene keratin người Tên protein ... "Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza số đặc tính enzim" đƣợc thực nhằm: - Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ mẫu đất khác xác định đƣợc chủng có hoạt tính tốt - Một số điều... keratinaza? ??………………………………….31 3.2 Một số đặc điểm chủng có hoạt tính keratinaza … ……………….32 3.3 Xác định chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza mạnh …………… 34 3.4 Một số điều kiện tối ƣu hố mơi trƣờng... sinh hố chúng 3.3 XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT Từ chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza phân lập đƣợc, tiến hành mức độ hoạt động enzim cách sau: - Nuôi lắc môi trƣờng