Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus penta e, d18s51, d21s11, TH01 và d3s1358 phục vụ giám định

́ ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN - Bùi Nguyên Hải NGHIÊN CƢƢ́U XÂY DƢNGC̣ THANG ALEN CHỈTHI C̣ HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨ KHOA HOCC̣ Hà Nội, năm 2012 ́ ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN - Bùi Nguyên Hải NGHIÊN CƢƢ́U XÂY DƢNGC̣ THANG ALEN CHỈTHI C̣ HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH Chuyên ngành: Di truyền hocC̣ Mã số: 60.42.70 LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨ KHOA HOCC̣ ̃ NGƢỜI HƢỚNG DÂN KHOA HOCC̣: PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội, năm 2012 BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ/ chữ viết tắt ADN APS LD bp dNTP dATP dTTP dGTP dCTP FL M50 OD PCR PBS RFLP STR Taq TBE TE TEMED VNTR w/v Nghĩa tiếng Anh Acid Deoxyribonucleic Amonium persulfate Allelic ladder Base pair Deoxynucleoside triphosphate Deoxyadenine triphosphate Deoxythymidine triphosphate Deoxyguanine triphosphate Deoxycytozine triphosphate Fluorescein Marker 50bp Optical density Polymerase chain reaction Phosphate buffer saline Restriction fragment length polymophism Short Tandem Repeat Thermus aquaticus Tris-Boric acid-EDTA Tris-EDTA N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine Variable number of tandem repeat Weight/volume Nghĩa tiếng Việt Thang alen chỉthi chuẩṇ Cặp bazơ nitơ Chất nḥm huỳnh quang Fluorescein Thang kích thƣớc ADN 50bp Mật độ quang Phản ứng chuỗi trùng hợp Đa hình theo chiều dài đoạn bị cắt enzyme giới hạn Các đoạn lặp lại ngắn Các đoạn lặp nối tiếp có số lƣợng khác Khối lƣợng/ thể tích Mở đầu Chƣơng Tổng quan tài liệu 1.1 Phƣơn 1.1.1 Cơ sở 1.1.2 Các kỹ 1.1.2.1 Kỹ thu 1.1.2.2 Các kỹ 1.2 Đại cƣ cá thể 1.2.3 Các lo 1.2.4 Các lo 1.3 Các ph 1.3.1 Phươn 1.3.2 Phươn 1.3.3 Phươn 1.3.4 Phươn 1.4 Đại cƣ tớch A 1.4.1 Khỏi n 1.4.2 Ứng d 1.5 Tình h 1.5.1 Tỡnh h 1.5.2 Tỡnh h CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyê 2.1.1 Đối tƣ 2.1.2 Thiết b 2.1.3 Mồi ch 2.1.4 Hoỏ ch 2.2 Phƣơn 2.2.1 Phƣơn 2.2.2 Phƣơn 2.2.3 Phƣơn 2.2.4 Kỹ thu 2.2.5 Phƣơn 2.2.5.1 Phát băng ADN Ethidium bromide 2.2.5.2 Phát h 2.2.6 Phƣơn 2.2.7 Thu th CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết qu 3.2 Kết qu 3.3 Kết qu 3.4 Kết qu 3.5 Kết qu 3.6 Kết qu CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết lu 4.2 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC (Bảng và Hỡnh ảnh) Kiến nghị MỞ ĐẦU Những năm cuối kỷ XX đã chứng kiến phát triển nhanh chóng kỹ thuật di truyền kể từ James Watson và Francis Cric phát cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN (năm 1953), và Kary Mullis phát minh phƣơng pháp nhân bội ADN từ một lƣợng ADN nhỏ ban đầu ống nghiệm (năm 1985) Những thành tựu này nhanh chóng đƣợc ứng dụng rộng rãi nghiên cứu về y, sinh học và khoa học hình nhằm mục đích xác định đặc trƣng cá thể ngƣời Có thể kể đến ứng dụng để phân biệt cá thể đƣợc tiến hành Anh vào năm 1985 với công trình nghiên cứu Alec Jeffreys và cợng nghiên cứu đoạn gen mã hóa protein Myoglobin máu ngƣời Họ đã phát đoạn gen có mợt trình tự bao gồm bazơ nitơ đƣợc lặp lại một số lần, điều đáng ý là đoạn lặp này cá thể khác có số lƣợng đoạn lặp khác Jeffreys coi là một đặc điểm quan trọng để phân biệt khác cá thể Với phát triển kỹ thuật gen, nhiều đoạn lặp lại đa hình khác lần lƣợt đƣợc phát sau Từ việc phát đoạn đa hình có trình tự lặp lại phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn (RFLP) đến phƣơng pháp lai đầu dò (ADN probe), đoạn lặp lại ngẫu nhiên có đợ dài đơn vị lặp lại trung bình (VNTR) đoạn có đơn vị lặp lại ngắn, chỉ từ 2-4 đôi bazơ nitơ (STR) kết hợp kỹ thuật PCR, phƣơng pháp nhận dạng và phân biệt cá thể đã phát triển lên một tầm cao Cũng từ đây, giám định tƣ pháp về gen đời Giám định gen đã khắc phục đƣợc hạn chế phƣơng pháp huyết học trƣớc đây, giúp nhà điều tra truy nguyên đƣợc đến cá thể ngƣời, xác định đƣợc quan hệ huyết thống cha-con, mẹ-con, xác định đƣợc hài cốt, xây dựng sở liệu và tàng thƣ gen tội phạm Nghiên cứu tìm kiếm trình tự gen đa hình để phân biệt cá thể ngƣời đồng thời nghiên cứu chế tạo bộ KIT phục vụ cho mục đích này đƣợc nhiều cơng ty Cơng nghệ sinh học để ý tiềm ứng dụng lớn Ngay từ năm 90 kỷ trƣớc, hai hãng sản xuất chế phẩm sinh học là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã cho xuất xƣởng nhiều bộ KIT khác nhau, bộ KIT đơn locus, locus, locus, 12 locus và 16 locus đã lần lƣợt đời Mỗi bợ KIT phân tích ADN có kèm thang alen chuẩn, mợt thành phần quan trọng thiếu Thang alen là một hỗn hợp bao gồm tất alen xuất mợt quần thể ngƣời định Sự có mặt thang alen cho phép xác định đƣợc xác kiểu gen mẫu phân tích Bất kỳ mợt thí nghiệm phân tích xác định cá thể ngƣời nào đều cần sử dụng thang alen Tuy nhiên, bộ KIT đƣợc thƣơng mại hóa hãng kể có giá thành cao, thủ tục nhập đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi Việt Nam Do đó, để chủ đợng về cơng nghệ, đồng thời phục vụ cho thí nghiệm phân tích gen ngƣời Việt Nam nói chung, lĩnh vực khoa học hình nói riêng, tiến tới triển khai rợng cơng nghệ phân tích gen tới phịng thí nghiệm địa phƣơng chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng thang alen thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 phục vụ giám định Mục tiêu đề tài là chế tạo đƣợc thang alen chỉ thị gắn huỳnh quang cho 05 locus gen đa hỡnh STR nờu trờn dạng đơn lẻ và dạng phức hợp để cú thể sử dụng phõn tớch trờn thiết bị scan gel huỳnh quang phục vụ công tác giám định cá thể CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phƣơng pháp xác định cá thể dựa thị ADN 1.1.1 Cơ sở khoa học phân tích ADN xác định cá thể Với nghiên cứu nhà khoa học, ngƣời đã phát chất di truyền nằm cấu trúc phân tử ADN ADN (axit deoxyribonucleic)là một chuỗi nucleotide gồm loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytozin (C) và Timin (T) xếp nhau, khác trình tự loại nucleotide phân tử ADN 23 đơi nhiễm sắc thể có tế bào cá thể là sở cho giám định gen để xác định cá thể Hình Cấu trúc phân tử ADN Trong trình tìm kiếm sở nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, nhà khoa học đã phát nhiều công cụ hữu hiệu cho phép xác định khác với mục đích phân biệt cá thể ngƣời này với cá thể ngƣời khác Một phƣơng pháp là dựa dạng đa hình trình tự phân tử ADN [21] Trình tự nucleotide sợi kép ADN có hai dạng đa hình [1, 2, 23]:  Đa hình theo trình tự: gốc nucleotide ngẫu nhiên đoạn ADN khơng theo mợt trình tự nào: Ví dụ: cá thể thứ locus A ta có trình tự: cá thể thứ hai: Nhƣ vị trí số và vị trí số dãy thứ đã đƣợc thay A C và T G  Đa hình theo chiều dài: Mợt số gốc nucleotide đƣợc lặp lặp lại nhiều lần chiều dài đoạn ADN Ví dụ: Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT-  đoạn lặp ATAT Cá thể thứ hai  ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT - đoạn lặp ATAT Trong trình hình thành và phát triển loài và cá thể, biến - đổi trình tự nucleotide sợi kép ADN đã xảy ra, mà ngƣời đã ghi nhận đƣợc nhiều biến đổi Khái niệm alen đƣợc thống để chỉ trạng thái khác gen locus Nhƣ vậy, với gen hay locus, ngƣời đã ghi nhận đƣợc nhiều alen khác Chính khác trình tự nucleotide alen locus phân tử ADN nhiễm sắc thể là sở cho giám định gen hình để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống 49 Sử dụng mẫu đã lựa chọn để chế tạo thang alen locus D21S11, thu đƣợc thang alen bao gồm alen từ 29 đến 34 Kết cho thấy thang alen thu đƣợc có chất lƣợng tốt, alen đồng đều, khơng có chênh lệch tỷ lệ Locus TH01 K562 9.3 11 LD 22 15 10 Hình 23 Kết chế tạo thang alen locus TH01 LD: Thang alen đơn đƣợc chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 3,22,7,15: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang 5-11: Các alen thu đƣợc sau khảo sát Thang alen locus TH01 thu đƣợc bao gồm alen từ đến 11, bao gồm một alen lẻ 9.3 Các băng ADN (các alen) thang sau chế tạo có tƣơng đồng cao cho thấy tỷ lệ trộn mẫu phù hợp Locus D3S1358 12 18 LD 18 K562 19 17 16 15 16 14 13 Hình 24 Kết chế tạo thang alen locus D3S1358 LD: Thang alen đơn đƣợc chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 6,12,18,4: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang 13-19: Các alen thu đƣợc sau khảo sát 50 Thang alen locus D3S1358 thu đƣợc bao gồm alen từ 13 đến 19 Tỷ lệ trợn mẫu q trình chế tạo thang phù hợp nên thang alen thu đƣợc có băng (các alen) đồng đều, sử dụng cho nghiên cứu 3.6 Kết quả chế tạo thang alen dạng phức hợp 05 locus Sau chế tạo đƣợc thang alen đơn, pha loãng sản phẩm PCR thang alen đơn và trộn với để tạo thành khuôn ban đầu để thực phản ứng PCR nhân bội đồng thời 05 locus Nồng độ pha loãng thang alen đơn thực đồng thời cho 05 thang alen đơn là 1/5000 Để nhân bội đƣợc thang alen phức hợp 05 locus một phản ứng, sử dụng kết tối ƣu thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt đƣợc thực đề tài cấp Nhà nƣớc Các thang alen đƣợc trộn theo tỷ lệ khuôn D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E là 1: 1: 1: 1: Kết chế tạo thang alen phức nhƣ sau: LD K562 LD Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 25 Kết chế tạo thang alen phức 05 locus LD: Thang alen phức hợp 05 locus hoàn chỉnh 51 K562: Mẫu chuẩn Thang alen phức hợp sau nhân bội đƣợc điện di mẫu sản phẩm nhân bội sử dụng khuôn ADN chuẩn K562 và một số mẫu khuôn khác Kết cho thấy, thang alen sử dụng để định danh đƣợc kiểu gen mẫu Bên cạnh đó, theo tỷ lệ trợn mẫu D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E là 1: 1: 1: 1: 1, nhận thấy thang alen thành phần chƣa có tƣơng đồng Hình ảnh cho thấy, thang alen D21S11 đậm nhất, sau đến thang alen D18S51, thang alen Penta E và D3S1358 tƣơng đƣơng thang TH01 cho hình ảnh mờ so với thang alen cịn lại Do đó, chúng tơi điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn (thang alen đơn) D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E ban đầu từ 1: 1: 1: 1: thành 2: 4: 1: 2: sử dụng cho phản ứng PCR, thu đƣợc kết điện di nhƣ sau: LD LD K562 Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 26 Kết điều chỉnh tỷ lệ trợn khuôn chế tạo thang alen phức 05 locus LD: Thang alen phức chế tạo đƣợc sau điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn K562: MÉu chuÈn 52 Sau điều chỉnh lại tỷ lệ trộn thang alen đơn làm khuôn nhân bội tạo thang alen phức 05 locus, thu đƣợc thang alen phức rõ nét, có tƣơng đồng locus và sử dụng đƣợc phân tích xác định kiểu gen mẫu khn ADN khác Tiến hành nhân bội thang alen nhiều cấp theo phƣơng pháp đã trình bày, chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ sau: LD LD LD 1/1000 1/5000 K562 LD 1/10000 Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 27 Kết chế tạo thang alen phức 05 locus hệ LD: Thang alen phức hệ I LD 1/1000, 1/5000, 1/10000: Thang alen phức hệ I, II, III 53 Từ kết trên, sử dụng nồng độ pha loãng khuôn ADN khác (1000, 5000 và 10.000 lần) để tiến hành PCR tạo thang hệ I, II, BI đều cho kết giống nhau, khơng có khác biệt Do đó, từ nồng đợ này tiếp tục pha loãng để nhân bội thang alen Trƣờng hợp thang alen thời gian bảo quản lâu dài có ảnh hƣởng đến chất lƣợng, sử dụng bợ KIT Wizard®SV Gel and PCR clean-up System hãng Promega để tinh lại sản phẩm PCR và sử dụng làm khuôn cho nhân bội tiếp Thử nghiệm dùng thang alen đã chế tạo để phân tích kiểu gen mợt số mẫu cá thể ngƣời, chúng tơi thu đƣợc hình ảnh phân tích nhƣ sau: 101 LD LD LD LD LD LD Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 28 Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích LD: Thang alen phức đƣợc chế tạo nghiên cứu K562: Mẫu chuẩn - Giếng 101-116: Các mẫu nhân bội 05 locus 54 117 LD LD LD LD Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 29 Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích LD: Thang alen phức đƣợc chế tạo nghiên cứu K562: Mẫu chuẩn - Giếng 117-126: Các mẫu nhân bội 05 locus Với kết khảo sát thử nghiệm nhƣ trên, thang alen phức 05 locus D3S1358 – TH01 – D21S11 – D1851 – Penta E đã đƣợc chế tạo hoàn toàn sử dụng để phân tích xác định đƣợc kiểu gen mẫu cá thể ngƣời Thang alen sử dụng đƣợc nghiên cứu và ứng dụng phân tích cá thể nhƣ lĩnh vực khoa học hình và giải nhu cầu dân sinh nhƣ xác định huyết thống 55 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã chế tạo thành công thang alen chỉ thị huỳnh quang cho locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 sử dụng hệ thống scan huỳnh quang  Thang alen locus Penta E gồm 13 alen: alen số 5, từ alen số đến alen số 20  Thang alen locus D18S51 gồm 10 alen: từ alen số 12 đến alen số 21  Thang alen locus D21S11 gồm 11 alen: từ alen số 29 đến alen số 34  Thang alen locus TH01 gồm alen: từ alen số đến alen số 11 (có alen số 9.3)  Thang alen locus D18S51 gồm alen: từ alen số 13 đến alen số 19 4.2 Đã chế tạo thành công thang alen chỉ thị huỳnh quang phƣ́c hơpC̣ 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 sử dụng hệ thống scan huỳnh quang So với thang alen đơn lẻ, thang alen phức hợp cho phép xác định đƣợc kiểu gen cá thể ngƣời lúc 05 locus, nâng cao hiệu phân tích giám định Kiến nghị Trên sở kết nghiên cứu và xác định đƣợc điểm cịn chƣa giải đƣợc, chúng tơi kiến nghị: Giải trình tự mợt số alen locus để kiểm tra tính xác định tƣƣ̀ng alen Tiếp tục nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang khác: Từ 10 locus trở lên để nâng cao đợ xác , phuc vu C̣tốt cho công tác giám định gen 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nghiêm Xuân Dũng, (2004), “Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ADN nhận dạng cá thể ngƣời“, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học kỹ thuật cấp Nhà nước, KC 04.05 Nghiêm Xuân Dũng, (2007), “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển kỹ thuật phân tích ADN phục vụ chuẩn đốn hình sự’’, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học kỹ thuật cấp Nhà nước, KC 04.31 Nghiêm Xuân Dũng, Lê Đức Đào, Trần Minh Đôn, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Lƣơng Thị Yến, Trần Công Tƣớc, Trần Thị Quỳnh Hoa, Phạm Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Lợi, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, (2000), “Tạo dòng phân tử hai allen dị hợp tử THO1 A và THO1 B’’, Hội nghị sinh học Quốc gia, trang 35-38 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đơn, Lƣơng Thị Yến, Lê Bích Trâm, Ngơ Thị Kim, Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, (2003), “Bƣớc đầu nghiên cứu đặc trƣng cá thể ngƣời qua locus PENTA E, D18S51 kỹ thuật PCR’’, Tạp chí Di truyền ứng dụng số 2, trang 25-29 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, (2003), “Bƣớc đầu khảo sát tần số phân bố alen gen D21S11’’, Tạp chí nghiên cứu Y học Số 3, trang 81-85 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, Lê Đức Đào, (2003), “Nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen hệ nhóm máu ABO cá thể’’, Tạp chí nghiên cứu Y học Tập 23, Số 3, trang 74-80 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, (2003), “Tối ƣu điều kiện PCR sử dụng phức hợp mồi locus 57 PENTA E, D18S51 và D18S51’’, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, trang 1173-1176 Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đơn, Lƣơng Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, (2004), “ứng dụng kỹ thuật PCR khảo sát sơ bộ tần suất phân bố alen locus D18S51 ngƣời Việt Nam’’, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Số 1, trang 41-45 Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, (2001), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục 10 Trần Minh Đôn, Nghiêm Xuân Dũng, Lƣơng Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, (2003), “Nghiên cứu chế tạo và ứng dụng thang alen chỉ thị locus D18S51”, Báo cáo Khoa học Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, trang 1170-1172 11 Bùi Diệu Hồng, Hà Quốc Khanh, Đinh Thị Nga, (2003), “Tần suất gen D3S1358, vWA, FGA ngƣời Việt ứng dụng giám định gen”, Tạp chí nghiên cứu y học, trang 86-89 12 Hồ Quang Huy, Vũ Triệu An, Văn Đình Hoa, Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lƣơng Thị Yến, (2004), “Tần suất alen STR PENTA E, D18S51, D18S51 và D21S11 107 ngƣời Mƣờng Việt Nam”, Tạp chí Y-Dược học quân sự, trang 280-283 13 Ngô Thu Hƣờng, Nguyễn Văn Mùi, (2001), “Bƣớc đầu khảo sát một số locus gen cặp mồi đơn để xác định huyết thống ngƣời’’, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Số 2, trang 45-50 14 Hà Quốc Khanh, Đinh Thị Nga, Bùi Diệu Hồng và cộng sự, (2003), “Tần suất gen D8S1179, D21S11, D18S51 ngƣời Việt ứng dụng giám định gen hình sự’’, Báo cáo khoa học Hội nghị Cơng nghệ sinh học toàn quốc năm 2003, trang 1102-1105 15 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng, (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 58 16 Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung, (2005), Giáo trình Cơng nghệ ADN tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 17 Lê Đình Lƣơng, (2001) “Nghiên cứu tính đặc trƣng cá thể và tần số phân bố alen ba locus VNTR (D1S80, YNZ22, APOB) Việt Nam kỹ tht PCR’’ T¹p chÝ Di trun häc vµ øng dơng, sè 4, trang 40-44 TIẾNG ANH 18 ABI Prism STR Primer Set Protocol, 1995, The Perkin Elmer Corporation 19 Budowle B., Adams D.E., and Allen R.C., Fragment Length Polymophisms for Forensic Science Applications, Methods in Nucleic Acid Research, 181-202 20 Budowle B, Safantila A, Hochmeister MN ADN Corney C T, (1994), The application of STR to Forensic Science, The PCR, pp 244-256 21 Butler MJ, (2001), Forensic DNA typing, Academic Press 22 Butler MJ, (2001), Forensic DNA Typing, Biology ADN Technology behind STR Markers 23 Butler MJ, (2006), Genetics ADN Genomics of Core STR loci used in human identity testing, J Forensic Sci, 51 (Mar 2006 issue) 24 Butler MJ, (2007), Mini-review: Short Tandem Repeat typing technologies used in human identity testing Biotechniques, Vol.43, No.4, Sii-Sv 25 Butler MJ, (2011), Advanced topics in Forensic DNA typing: Methodology 59 26 Edwards, A Civitello, H A Hammond, and C T Caskey, (1994), “DNA typing and genetic mapping with trimetic and tetrameric tandem repeats”, Am J Hum Genet 49, pp 746-756 27 Kimpton C, Fisher D., Watson S., Adams M., Urquahard A., Lygo, Gill P, (1994) “Evaluation of an automated DNA profiling system employing mutiplex amplification of four tetrameric STR loci”, Int J Leg Med 106: pp 302-321 28 Marie Phillips, (2002), “DNA fingerprints ADN their statistical analysis in human population” ICOTS6, The University of Melbourne, Australia 29 Maxam A M and Gilbert W., In: Grossman L., Moldave K.(eds), Methods in enzymology, Vol.65 Academic Press, New York, 499-599 30 Promega, (1999), Technical Manual, Geneprint Fluorescent STR systems Promega, (2003), Life Science Catalog 31 Ray A Wickenheiser, (2002), “Trace DNA: A review, discussion of theory ADN application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact” Journal of Forensic Sciences, ASTM International 32 Sambrook, K J Fristsch, E.F Maniatis, T., (1989) Molecular cloning 1, 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press USA 33 Schum et al, (2000), “Allelic ladders for Short Tandem Repeat loci”, United States Patent, No: 6156512 34 Shimada I, Brinkmann B, Nguyen QT, Hohoff C, (2002), “Allele frequency data for 16 STR loci in the Vietnamese population”, International Journal of legal Medicine 35 Southern,E.M., (1975) “Detection of specific sequences among DNA fragments seperated by electrophoresis”, J Molecular Biology 98, pp 503-517 60 36 Westermeier R., (1997) Electrophoresis in practice VCH, A Willey Company 37 Wyman A L and White P H (1980) “A highly polymorphic locus in human DNA”, Proc Natl Acad Sci USA 77, pp 6750-6754 38 Yamamoto Y, Inagaki S, Yoshitome K, Okamoto O, Shigeta Y, Doi Y, Takata T, Ishikawa T, Imabayashi K, Miyaishi S ADN Ishizu H, (2001), “Japanese population data on fifteen short tandem repeat (STR) loci D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, PENTA E, PENTA E, D18S51, D21S11, D18S51, D16S539, CSF1PO, PENTA D, VWA, D8S1179, TPOX, FGA”, The 7th Indo-Pacific Congress on Legal Medicine ADN Forensic Sciences 39 ZHOU XiaGuang, REN LuFeng, Li YunTao, ZHANG Mei, YU YuDe & YU Jun (2010), “The next-generation sequencing technology: A technology review ADN future perspective”, Science China- Life Sciences, Jannuary 2010, Vol.53, No., pp 44-57 61 PHỤ LỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH TRONG LUẬN VĂN Danh mục Bảng Số bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng 10 Danh mục Hình ảnh Số hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình 10Kết điện di sản phẩm PCR locus Penta E mợt số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 11Kết điện di sản phẩm PCR locus Penta E mợt số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 12Kết điện di sản phẩm PCR locus D18S51 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 13Kết điện di sản phẩm PCR locus D18S51 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 14Kết điện di sản phẩm PCR locus D21S11 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 15Kết điện di sản phẩm PCR locus D21S11 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 16Kết điện di sản phẩm PCR locus TH01 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 17Kết điện di sản phẩm PCR locus TH01 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 18Kết điện di sản phẩm PCR locus D3S1358 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 19Kết điện di sản phẩm PCR locus D3S1358 một số mẫu khảo sát gel poly acrylamide Hình 20Kết chế tạo thang alen locus Penta E Hình 21Kết chế tạo thang alen locus D18S51 Hình 22Kết chế tạo thang alen locus D21S11 Hình 23Kết chế tạo thang alen locus TH01 Hình 24Kết chế tạo thang alen locus D3S1358 Hình 25Kết chế tạo thang alen phức 05 locus Hình 26Kết điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn chế tạo thang alen phức 05 locus Hình 27Kết chế tạo thang alen phức 05 locus hệ Hình 28Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích Hình 29Kết thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích ... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng thang alen thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 phục vụ giám định Mục tiêu đề tài là chế tạo đƣợc thang alen chỉ thị. .. mẫu nghiên cứu Nhân bội và kiểm tra sản phẩm PCR để thu nhận mẫu sử dụng cho chế tạo thang alen 20 Chế tạo thang alen đơn cho locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 Chế tạo thang alen. .. mix cho locus nhiều locus phản ứng) - Thang chỉ thị alen (allelic ladder) bao gồm toàn bợ alen locus cần phân tích Thang alen chỉ thị để định danh alen điện di Trình tự mồi và thang chỉ thị