Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới thuộc khu vực bắc trường sơn, việt nam

Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên Tr-ơng Văn Hạnh Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét tính kháng thuốc sốt rét Plasmodium falciparum số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trờng Sơn, Việt Nam Luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội - 2013 Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên Tr-ơng Văn Hạnh Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét tính kháng thuốc sốt rét Plasmodium falciparum số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trờng Sơn, Việt Nam Chuyên ngành: Di truyền học Mà sè: 62 42 70 01 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh học Ng-ời h-ớng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Đình Đạt PGS.TS Hồ Đình Trung Hà Nội - 2013 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân Các số liệu, kết luận án trung thực ch-a đ-ợc công bố công trình tài liệu Tác giả Tr-ơng Văn Hạnh Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Đình Đạt, PGS.TS Hồ Đình Trung đà tận tình h-ớng dẫn, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi vô biết ơn cố PGS.TS Nguyễn Đức Mạnh, Thầy đà h-ớng dẫn giúp đỡ năm đầu học tập nghiên cứu sinh thực đề tài nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn LÃnh đạo Viện Sốt rét-KST-CTTƯ đà tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ vật chất, thời gian tinh thần trình thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền, thầy cô Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học, thầy cô Ban giám hiệu Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên đà tận tình giúp đỡ trình học tập Tr-ờng Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Khoa Sinh học Phân tử cán Khoa/Phòng Viện Sốt rét-KST-CTTƯ, cán Trung tâm phòng chống sốt rét tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế đà giúp đỡ, ủng hộ động viên trình học tập thực đề tài phòng thí nghiệm nh- địa điểm nghiên cứu Cảm ơn gia đình thân yêu bạn bè đà động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tr-ơng Văn Hạnh Mục Lục Mở Đầu Ch-¬ng 1- Tỉng quan tµi liƯu 1.1 BÖnh sèt rÐt 1.2 Các loài ký sinh trïng g©y bƯnh sèt rÐt ë ng-êi 1.2.1 Thành phần loài ký sinh trùng g©y bƯnh sèt rÐt ë ng-êi 1.2.2 Chu kú ph¸t triĨn cđa ký sinh trïng sèt rÐt 1.3 Muỗi trun bƯnh sèt rÐt 1.4 T×nh h×nh sèt rét giới Việt Nam 1.4.1 Tình hình sốt rét thÕ giíi 1.4.2 Tình hình sốt rét Việt Nam 10 1.4.3 Đặc điểm điều kiện tự nhiên, kinh tế xà hội tình hình sốt rét tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 12 1.5 Mét sè kü tht sư dơng chẩn đoán, phân biệt loài KSTSR 15 1.5.1 Kỹ tht xÐt nghiƯm lam m¸u nhm giemsa 15 1.5.2 Kỹ thuật chẩn đoán nhanh que thö (Rapid diagnostic test) 16 1.5.3 Kü thuËt PCR chẩn đoán, phân biệt bốn loài ký sinh trùng sèt rÐt 16 1.6 Nghiên cứu tính đa hình di trun cđa ký sinh trïng sèt rÐt 19 1.6.1 Đa hình di truyền P falciparum 19 1.6.2 Đa hình di trun cđa P vivax 25 1.7 Ký sinh trïng sèt rÐt kh¸ng thuèc 28 1.7.1 Định nghĩa phân loại ký sinh trïng sèt rÐt kh¸ng thuèc .28 1.7.2 Một số loại thuốc sử dụng điều trị bệnh sốt rét 29 1.7.3 Tình hình KSTSR kháng thuốc giới Việt Nam .31 1.7.4 Cơ chế tác động thuốc sốt rét KSTSR .35 1.7.5 §ét biÕn gen ë P falciparum liên quan đến kháng thuốc sốt rét 38 i 1.7.6 Một số kết nghiên cứu phân tích đột biến gen P falciparum kháng thuốc sốt rÐt 41 Ch-¬ng - Đối t-ợng, vật liệu Và ph-ơng pháp nghiên cứu 43 2.1 Đối t-ợng nghiên cứu 43 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 43 2.2.1 Địa điểm nghiên cøu 43 2.2.2 Thêi gian nghiªn cøu 43 2.3 VËt liƯu nghiªn cøu 43 2.3.1 Dơng vµ hãa chÊt cho kü tht xét nghiệm lam máu 43 2.3.2 Thiết bị hãa chÊt t¸ch chiÕt ADN 43 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất để tiến hành phản ứng PCR 44 2.3.4 Thiết bị, dụng cụ hóa chất cho điện di phân tÝch kÕt qu¶ PCR 45 2.4 Ph-ơng pháp nghiên cøu 45 2.4.1 ThiÕt kÕ nghiªn cøu 45 2.4.2 MÉu nghiªn cøu 45 2.4.3 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 47 2.4.4 C¸ch đánh giá kết 58 2.4.5 C«ng thức tính số phân tích số liệu nghiên cứu 60 Ch-ơng - Kết th¶o LuËn 62 3.1 Thành phần, cấu loài KSTSR tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam 62 3.1.1 Kết xác định thành phần, cấu loài KSTSR kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 62 3.1.2 Kết xác định thành phần, cÊu loµi KSTSR b»ng kü thuËt PCR 64 ii 3.2 Tính đa hình di truyền quần thể P falciparum khu vực Bắc Tr-êng S¬n, ViƯt Nam 71 3.2.1 TÝnh ®a h×nh di trun cđa P falciparum theo locus msp1 .71 3.2.2 Tính đa hình di truyền P falciparum theo locus msp2 79 3.2.3 Tính đa hình di truyền P falciparum theo locus glurp .86 3.3 Tính đa hình di trun cđa P vivax ë khu vùc B¾c Tr-êng s¬n, ViƯt Nam 89 3.3.1 Tính đa hình di truyền P vivax theo locus Pvcs 89 3.3.2 Tính đa hình di truyÒn theo locus Pvmsp1 93 3.4 Đặc điểm KSTSR kháng thuốc tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn Việt Nam 97 3.4.1 Tỷ lệ đột biến P falciparum kháng thuốc pyrimethamin 97 3.4.2 Tỷ lệ đột biến P falciparum kháng thuốc sulfadoxin 101 3.4.3 Tû lƯ ®ét biÕn cđa P falciparum kháng thuốc chloroquin 106 KếT LUậN Và KIếN NGHÞ 112 KÕt luËn 112 KiÕn nghÞ 113 Danh mục công trình khoa học liên quan đến Nội dung luận án 114 Tài liệu tham khảo 115 Phô lôc 138 iii Danh mục bảng Bảng 1.1 Tình hình sốt rét khu vực Tây Thái Bình D-ơng năm 2008 11 Bảng 1.2 Tình hình sốt rét theo khu vực Việt Nam năm 2006 2010 12 Bảng 1.3 Tình hình sốt rét khu vực Bắc Tr-ờng Sơn năm 2008 2011 15 Bảng 1.4 Thành phần tên số thuốc sốt rét 30 B¶ng 1.5 Thêi gian KSTSR P falciparum kháng với loại thuốc sốt rét 33 Bảng 1.6 Đột biến điểm gen dhfr P falciparum liên quan đến kháng pyrimethamin 38 B¶ng 1.7 Mối liên quan đột biến điểm gen dhfr đáp ứng với pyrimethamin in vitro số chủng, phân lập chuẩn 39 Bảng 1.8 Đột biến điểm gen dhps P falciparum liên quan đến kháng sulfadoxin 40 B¶ng 1.9 Mối liên quan đột biến điểm gen dhps đáp ứng với sulfadoxin in vitro số chủng, phân lập chuẩn 40 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi nhân kiểu gen P falciparum 50 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi xác định kiểu gen nhạy đột biến vị trí đột biến gen dhfr 54 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi xác định kiểu gen nhạy đột biến vị trí ®ét biÕn trªn gen dhps 56 B¶ng 3.1 Tû lệ ng-ời dân mắc sốt rét tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế kỹ thuật xÐt nghiƯm lam m¸u nhm giemsa 62 B¶ng 3.2 Kết xác định tỷ lệ nhiễm đơn, nhiễm phối hợp loài KSTSR kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa 63 Bảng 3.3 Cơ cấu loài KSTSR khu vực Bắc Tr-ờng Sơn kü tht xÐt nghiƯm lam m¸u nhm giemsa 64 B¶ng 3.4 Tỷ lệ phát bệnh nhân nhiễm đơn, nhiễm phối hợp loài KSTSR theo kỹ thuật PCR 65 Bảng 3.5 So sánh tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn nhiễm phối hợp khu iv 142 Viriyakosol S., Siripoon N., Petcharapirat C., Jarra W., Thai Thong S., Brown K.N., and Snounou G (1995), “ Genotyping of Plasmodium falciparum isolates by the polymerase chain raction and potential uses in 135 epidemiological studies” , Bulletin of the World Heath Organization 73(1), pp 85-95 143 Wallace P (1987), “ In: Chemotherapy and drug resitance in malaria” , Academic Press, London, UK, pp 829-844 144 Walliker, D., Carter, R & Sanderson, A (1975), “ Genetic studies on Plasmodium chabaudi: recombination between enzyme markers” , Parasitology 70, pp 19-24 145 Wang P., Darren R., Brooks, Paul F.G., Sims, Hyde J.E (1995), “ A mutation-specific PCR system to detect sequence variation in the DHPS gene of P falciparum” , Mol Biochem Parasitol 71, pp 115-125 146 Wang P., Read M., Sims P.F., Hyde J.E (1997), “ Sulfadoxine resistance in the human malaria parasite Plasmodium falciparum is determined by mutations in dihydropteroate synthetase and an additional factor associated with folate utilization” , Mol Microbiol 23, pp 979-986 147 Wernsdorfer W.H., and McGregor I (1988), “ The apparent transfer of pyrimethamine resistance from the B1 strain of P gallinaceum in the chicken” , In Malaria principles and Practice of Malariology 2, pp 1573 148 WHO (2001), “ Antimalarial drug combination therapy Report of a WHO technical consultation” , Geneva, World Health Organization 149 WHO (2006), “ Guidelines for the treatment of malaria” , Geneva, World Health Organization 150 WHO (2009a), “ Methods for surveillance of antimalarial drug efficacy” , Geneva, World Health Organization 151 WHO (2010), “ Global report on antimalarial drug efficacy and drug resistance: 2000-2010” , Geneva, World Health Organization 152 WHO (2011), “ World malaria report” , Geneva, World Health Organization 136 153 Wilkerson R (2009), “ Mosquito Classification” , Walter Reed Biosystematics Units online catalog, 91 pages 154 Zakeri S., Mehrizi A.A., Mamaghani S., Noorizadeh S., Snounou G., Djadid N.D (2006), “ Population structure analysis of Plasmodium vivax in areas of Iran with different malaria endemicity” , Am J Trop Med Hyg 74 pp 394-400 137 Phô lôc - Phụ lục 1: Kết xác định thành phần, cấu loài KSTSR tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam Phụ lục 2: Một số hình ảnh hoạt động nghiên cứu sinh thực địa Phụ lục 3: Một số hình ảnh hoạt động nghiên cứu sinh phßng thÝ nghiƯm 138 Phơ lơc KÕt xác định thành phần, cấu loài KSTSR tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam Kí hiệu TT mÉu cã 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 KSTSR KÕt qu¶ phân tích mẫ TT Kết phân tích mÉu th 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 KÝ hiệu TT mẫu có KSTSR Kết phân tích mÉu thu th 72 73 74 75 76 77 77 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 KÕt phân tích mẫu thu th TT Kết phân tích m 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 124 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 TT Kết phân tích mẫu 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 KÝ hiÖu TT mÉu cã KSTSR Kết phân tích m 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 Kết phân tích mẫu TT Kết phân tích mẫu 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 phụ lục 2: sinh cảnh hoạt động điểm nghiên cứu Cảnh ng-ời dân Quảng Trị qua lại vùng biên giới với n-ớc bạn Lào Nghiên cứu sinh đồng nghiệp khám bệnh thu thập mẫu Quảng Trị năm 2008 Nghiên cứu sinh đồng nghiệp khám bệnh thu thập mẫu Thừa Thiên Huế năm 2011 Mẫu máu bệnh nhân đ-ợc để khô tự nhiên thực địa tr-ớc đ-a vào bảo quản phụ lục : số hoạt động phòng thí nghiệm Nghiên cứu sinh chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR Nghiên cứu sinh thực kỹ thuật điện di buồng điện di Nghiên cứu sinh thực kỹ thuật PCR buồng PCR1 Nghiên cứu sinh phân tích kết hệ thống chụp ảnh kỹ thuật số Nghiên cứu sinh tham gia khóa tập huấn kỹ thuật xác đột biến kháng thuốc phân tích kiểu gen KSTSR úc Băngkod, Thái Lan ... Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét tính kháng thuốc sốt rét Plasmodium falciparum số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trờng Sơn, Việt Nam Chuyên ngành: Di truyền học Mà số: ... tài: Nghiên cứu tính đa hình di truyền ký sinh trùng sốt rét tính kháng thuốc sốt rét Plasmodium falciparum số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam Mục tiêu đề tài: Xác định... hình sốt rét, mức độ đa hình di truyền quần thể KSTSR cung cấp số liệu thực trạng KSTSR kháng thuốc số tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam tiến hành đề tài: Nghiên cứu tính đa hình di