Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ p lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm

Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung ́ ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ TRƯỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TỰNHIÊN - TRẦN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH THUỐC KHÁNG SINH HỌ β – LACTAM TRONG CÁC MẪU SINH HỌC VÀ DƯỢC PHẨM LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣ Hà Nội - 2011 Chun ngành Hố Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương Tổng quan 1.1 Giới thiệu chung chất kháng sinh 1.1.1 Lịch sử đời 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đánh giá tác dụng 1.2 Kháng sinh β – Lactam 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Cấu trúc phân loại 1.2.3 Tính chất vật lý hóa học 1.2.4 Tác dụng 1.2.5 Điều chế 1.2.6 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh Việt Nam giới 1.3 Các phương pháp định lượng β – Lactam 11 1.3.1 Các phương pháp quang học 11 1.3.2 Các phương pháp điện hóa 12 1.3.3 Các phương pháp điện di mao quản 12 1.3.4 Sắc kí mỏng 13 1.3.5 Sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 14 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 17 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu 17 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP- HPLC 18 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phương pháp HPLC 18 Chuyên ngành Hoá Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung 2.2.2 Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC 20 2.2.3 Detector huỳnh quang 22 2.2.4 Một số đại lượng đặc trưng HPLC 23 2.2.5 Phân tích định lượng HPLC 25 2.3 Kỹ thuật dẫn xuất hóa β- Lactam với thuốc thử NBD-F 26 2.4 Dụng cụ hóa chất 28 2.4.1 Máy móc dụng cụ 28 2.4.2 Hóa chất 28 Chương 3: Kết thảo luận 30 3.1 Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất β- Lactam thuốc thử NBD-F 30 3.1.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa 30 3.1.2 Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất hóa 33 3.2 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 36 3.2.1 Chọn thể tích vịng mẫu (sample loop) 36 3.2.2 Chọn bước sóng detector 37 3.3 Chọn pha tĩnh 37 3.4 Chọn pha động 38 3.4.1 pH dung dịch đệm 38 3.4.2 Tỉ lệ thành phần pha động 40 3.4.3 Nồng độ đệm acetat pha động 44 3.4.4 Tốc độ pha động 47 3.5 Đánh giá phương pháp phân tích 50 3.5.1.Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 50 3.5.2.Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 54 3.5.3 Độ phép đo 55 3.5.4 Độ lặp lại phép đo 57 3.6 Phân tích mẫu thực 58 3.6.1 Phân tích mẫu dược phẩm 58 Chun ngành Hố Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung 3.6.2 Phân tích mẫu sinh học 63 3.7 Kết số phương pháp khác xác định kháng sinh loại 68 3.8 Hướng phát triển đề tài 70 KẾT LUẬN 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 79 Chun ngành Hố Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung DANH MỤC BẢNG STT Tên Bảng 1.1 Phân loại cấu trúc s Bảng 1.2 Phân loại cấu trúc s Bảng 1.3 Hằng số axit kháng Bảng 3.1 Sự phụ thuộc Spíc vào Bảng 3.2 Sự phụ thuộc Spíc vào t Bảng 3.3 Sự phụ thuộc thời gian pha động Bảng 3.4 Sự phụ thuộc k’ vào pH ph Bảng 3.5 Sự phụ thuộc thời gian hữu đệm Bảng 3.6 Sự phụ thuộc thời gian MeOH 10 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc k’ vào tỉ 11 Bảng 3.8 Thời gian lưu chất phụ 12 Bảng 3.9 Diện tích píc chất phân tích 13 14 15 16 17 18 Bảng 3.10 Thời gian lưu chấ độ pha động Bảng 3.11 Diện tích pic chất độ pha động Bảng 3.12 Sự phụ thuộc Spic vào Bảng 3.13 Các giá trị Ftính, Fbảng kháng sinh β - Lactam Bảng 3.14 Giới hạn phát giớ chuẩn kháng sinh β - Lactam Bảng 3.15 Độ đung phép đo ́́ Chun ngành Hố Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung 19 Bảng 3.16 Độ đung phép đo 20 Bảng 3.17 Độ đung phép đo 21 Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại ph 22 Bảng 3.19 Thông tin mẫu thuốc phân 23 24 ́́ ́́ Bảng 3.20 Kết độ thu hồi xác đị thêm chuẩn mẫu thuốc Bảng 3.21 Kết tính nồng độ Cx v với kết in nhãn thuốc 25 Bảng 3.22 Hiệu suất thu hồi mẫu 26 Bảng 3.23 Hiệu suất thu hồi mẫu Chuyên ngành Hoá Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội ngày phát triển vấn đề sức khỏe người ngày quan tâm, đặc biệt sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe người Trong y học đại, β - Lactam thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh người, thú y từ chúng giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 loại kháng sinh dùng nhiều Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, thương hàn, điều trị hiệu nhiều bệnh gây vi khuẩn Nhưng, liều lượng cách dùng kháng sinh không dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ việc chữa trị khó khăn Ngồi ra, cịn gây lãng phí cho người bệnh có bệnh vi rút không chữa kháng sinh dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán bệnh ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh Đối với người cao tuổi , lươngg̣ dư kháng sinh nư ớc tiểu nhiều, gây bệnh thận Đồng thời, lươngg̣ dư thải môi trường se gây lên hâụ quảvơ nghiêm trongg̣ Vì vậy, kiểm sốt phân tích thuốc kháng sinh người bệnh biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu sử dụng chúng Có nhiều phương pháp tách khác Trong đó, phương pháp tách sắc ký phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời gian phân tích ngắn Tách xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang mẫu sinh học dược phẩm hướng nghiên cứu mới, với ưu điểm ngày áp dụng nhiều phịng thí nghiệm phân tích mẫu dịch vụ Trên sở đó, chúng tơi chọn đề tài là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β - Lactam mẫu sinh học dƣợc phẩm ” Chun ngành Hố Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Kháng sinh β - Lactam 1.1.1 Định nghĩa Là kháng sinh mà phân tử chứa vịng β-Lactam Gồm nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem hai nhóm sử dụng phổ biến lớn penicillin cephalosporin Các penicillin thu từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA) Các cephalosporin tự nhiên phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ kháng sinh thiên nhiên [1] 1.1.2 Cấu trúc phân loại * Các penicillin Các penicillin có cấu trúc gồm vòng: vòng thiazolidin, vòng βLactam R C O N H O COOM Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức penicillin chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay R gốc khác nhau, cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có penicilin có độ bền, dược động học phổ kháng khuẩn khác Với M gốc cation thường là: K, Na, H Nhóm kháng sinh penicillin chia thành nhóm với hoạt tính khác [1] Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686 31 Jae-Hoon Song and ANSORP members (2004), “Macrolide resistance and genotypic characterization of Streptococcus pneumoniae in Asian countries: a study of the Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP)”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy; 53, 457-463 32 J.M Cha, S Yang, K.H Carlson (2006), ,"Trace determination of β- lactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57 33 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y (1998), “Multiresidue liquid chromatographic method for determining resideues of mono and dibasic penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC International,81(6), 1113-1120 34 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y (1998), “ Improvement in the Multiresidue liquid chromatographic analysis of residues of mono and dibasic penicillins in bovine muscle tissues”, Journal of AOAC International,81(6), 1267-1272 35 Kazuoiwaki, Norio Okumuru and Mitsuru Yamazaki and noriyuki Nimura and Toshio Kinoshita (1990), “Precolumn derivatization technique for high-performance liquid chromatographic determination of penicillins with fluorescence detection”, Journal of Chromatography, 504(1), 359-367 36 Kimai and Y Watanabe (1981), “Fluorimetric determination of secondary amino acids by 7-Chloro-4-nitrobenzyl-2-oxa-1,3-diazole”, Analytica chimica Acta, 130, 377-383 37 L.Nozal,L.Arce1,A.R´ıos2,M.Valcárcel(2004),"Development of ascreening method for analytical control of antibiotic residues by micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of AnalyticaChimicaActa, 523(2004), 21–28 38 M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C Cruces-Blanco, M del Olmo Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental aqueous samples using off-line and on-line preconcentration in capillary Chun ngành Hố Phân tích 82 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung electrophoresis", Journal of Chromatography A, 185(2), pp 273-280 39 Michael R Jacobs (2003), “The Alexander Project 1998-2000: susceptibility of pathogens isolated from community-acquired respitatory tract infection to commonly used antimicrobial agenta”, Journal of antimicrobial Chemotherap, 52, 229-246 40 Masaaki Kai, Hiromi Kinoshita, Mikio Morizono(2003), “Chromatographic determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means of fluorescence, chemiluminescence and massspectrometry”, Journal of Mass Spectrometry, 39(3), 329 – 340 41 Merk (1996), The Merck Index, 12th edition 42 Nigel J.K Simpson (2000), Solid-phase extraction, Marcel Dekker, New York 43 “ Osama Al-Dirbasi, Naotaka Kuroda, Kenichiro Nakashimab (1998), Characterzation of the Fluorescence properties of - fluoro-7-nitro benzo-2oxa-1,3-diazole”, Analytica Chimica Acta, 365, 169-176 44 Pradyot Patnaik (1989), Dean’s Analytical Chemistry Handbook, McGraw-Hill Companies, New york 45 R Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago Press, 23, 757-762 46 Richard P Wenzel, M.D Michael B Edmond, M.D, M.P.H (2000), " Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine, 343, 1961-1963 47 Rolando Gonzalez-Henandez, Nuevas-Pez Lauro, Soto-Mulet Laritza, LopezLopez Miguel, Hoogmartens Joseph (2001), “ Reversed phase high performance liquid chromatographic determination of cefixime in bulk drugs”, Journal of liquid Chromatography and related technologies, 24(15), 2315-2324 Chuyên ngành Hố Phân tích 83 Luận văn Thạc sĩ 48 Trần Thị Dung Toshimasa Toyoka, Yoshihico Watanabe and Kzuhiro Imai (1983), “Reaction of biological important with 7-Chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazole”, Analytica Chimica Acta, 149, 305-312 49 Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line solid phase extraction", Analytica Chimica Acta, 592(2), 187–192 50 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, 119(12), 2595-2601 Chun ngành Hố Phân tích 84 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung PHỤ LỤC Sắc đồ sắc ký chất chuẩn kháng sinh β – Lactam với NBD-F mV Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0.0 2.5 (b) CEF (a) CEP mV 550 500 Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 90 450 80 400 70 350 60 300 50 250 40 200 150 30 100 20 50 10 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10 12 15 (c) AMP Chun ngành Hố Phân tích 85 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Sắc đồ sắc ký β- lactam với NBD-F mẫu thuốc mV Detector A:Ex:470nm,Em:530nm mV Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 30 120 90 110 25 80 100 90 70 20 80 60 70 15 10 60 50 50 40 40 30 30 20 10 0 -5 0.0 (b) CEF (a) CEP mV 550 Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 500 450 80 400 70 350 60 300 50 250 40 200 150 30 100 20 50 10 0 0.0 2.5 (c) AMP 5.0 7.5 10 12 15 Chun ngành Hố Phân tích 86 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Sắc đồ sắc ký chất với NBD-F mẫu nước tiểu mV mV Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 17 15 Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 90 80 12.5 70 70 60 50 10.0 60 7.5 50 40 40 5.0 40 30 30 30 2.5 20 20 20 0.0 10 10 10 0 0.0 (a) 2.5 5.0 7.5 10 12 15 0.0 2.5 5.0 7.5 10 12 15 (b) Mâũ nước tiểu sau uống thuốc Mẫu nước tiểu Blank CEP mV Detector A:Ex:470nm,Em:530nm mV 400 Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 20.0 17.5 350 15 70 300 12 250 60 60 200 50 50 10.0 40 40 150 7.5 30 30 100 5.0 20 20 2.5 50 10 10 0.0 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 (c) Mâũ nước tiểu sau uống CEF 0.0 2.5 5.0 7.5 10 12 15 (d) Mâũ nước tiểu sau uống AMP Chuyên ngành Hố Phân tích 87 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Sắc đồ sắc ký AMP với NBD-F mẫu máu mV Detector A:Ex:470nm,Em:530nm 40 35 30 25 20 15 10 0.0 2.5 (a) Mẫu máu Blank Độ lặp lại 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0.0 Chuyên ngành Hoá Phân tích 88 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung S(mAu.s) S (mAu.s) Đồ thị chất chuẩn kháng sinh với NBD-F qua điểm (b) CEF S(mAu.s) (a) CEP (c) AMP Chun ngành Hố Phân tích 89 ... khả ? ?p dụng phương ph? ?p - Phân tích mẫu dược phẩm (mẫu thuốc) - Phân tích mẫu sinh học (mẫu nước tiểu mẫu máu) - So sánh với số phương ph? ?p khác 2.2 Phƣơng ph? ?p nghiên cứu – Phƣơng ph? ?p RP-HPLC... nhiều sinh mạng 1.2 Các phƣơng ph? ?p phân tích định lƣợng β -lactam 1.2.1 Phương ph? ?p quang học Phương ph? ?p đo quang phương ph? ?p phân tích dựa tính chất quang học chất cần phân tích tính h? ?p thụ... tơi chọn đề tài là: ? ?Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β - Lactam mẫu sinh học dƣợc phẩm ” Chun ngành Hố Phân tích Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Kháng sinh