Nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao tại huế

DANH MỤC BẢNGBảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic 13Bảng 1.2: Các bacteriocin phổ biến được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lưu Thị Thanh Huế

NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN

Lactobacillus plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – Năm 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lưu Thị Thanh Huế

NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus

plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Quỳnh Uyển

TS Mai Thị Đàm Linh

Hà Nội – Năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộViện

Vi sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướngdẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quátrình làm luận văn và hoàn thành luận văn theo đúng định hướng ban đầu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới :

TS Mai Thị Đàm Linh, PGS TS Bùi Thị Việt Hà, cán bộ tại Bộ môn Visinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiệnbước đầu cho tôi hoàn thành luận văn này

CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh cùng toàn thể cán bộ, sinh viên tạiViện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tìnhgiúp đỡ và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình

Đề tài “Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa định hướng ứng dụngtrong thực phẩm, dược phẩm và thức ăn chăn nuôi” - Bộ khoa học và Công nghệ đã

hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và các anhchị đồng học luôn ở bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi vượt qua những khó khăntrong học tập suốt 2 năm vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Lưu Thị Thanh Huế

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Vi khuẩn lactic (LAB) 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái 3

1.1.2 Quá trình lên men lactic 5

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic 6 1.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 8

1.2.1 Ứng dụng của vi khuẩn lactic nói chung 8

1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn L plantarum 9

1.3.Bacteriocin 10

1.3.1 Định nghĩa 10

1.3.2 Phân loại 10

1.3.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 11

1.3.4 Đặc điểm của bacteriocin ở các nhóm vi khuẩn 12

1.3.5 Các đặc tính của bacteriocin 13

1.3.6 Bacteriocin từ vi khuẩn lactic 14

1.3.7 Phương pháp tinh sạch bacteriocin 17

1.4 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic 19

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 19

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.1.1 Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 24

2.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định 24

2.1.3 Môi trường, hóa chất và thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 27 2.2.2 Một số tính chất của bacteriocin 28

2.2.3 Tinh sạch bacteriocin bằng hệ thống AKTA 29

2.2.4 Điện di SDS PAGEvà kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn 30

2.2.5 Khảo sát khả năng chịu muối mật và pH thấp 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L plantarum UL485 33

3.1.1 Tối ưu hóa thời gian nuôi cấy 33

3.1.2 Tối ưu hóa nhiệt độnuôi cấy 34

3.2 Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 36

3.2.1 Hoạt độ bacteriocin (AU/ml) 36

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin 37

3.2.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin 38

3.2.4 Ảnh hưởng của enzym trypsin đến hoạt tính bacteriocin 40

3.3 Sơ bộ tinh sạch bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng Lactobacillus plantarum UL485 41

3.3.1 Chương trình tinh sạch trên hệ thống AKTA 42

3.3.2 Kết quả của quá trình tinh sạch bacteriocintrên hệ thống AKTA 45

3.3.3 Kết quả điện di SDS PAGE và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn 46

3.4.Khảo sát khả năng chịu pH, muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 47

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng

hợp bởi vi khuẩn lactic 13Bảng 1.2: Các bacteriocin phổ biến được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic 14

Bảng 1.3: Một số bacteriocin sản xuất bởi L plantarum được phân lập từ các mẫu

thực phẩm khác nhau 15Bảng 1.4: Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

Lactobacillus plantarum 18Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn kiểm định 24Bảng 2.2: Thành phần của gel sử dụng trong điện di Trixin - SDS PAGE 30Bảng 2.3: Thành phần của gel sử dụng trong điện di Glyxin - SDS PAGE 31Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính bacteriocin của chủng vi

khuẩn L plantarum UL48534

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính bacteriocin của chủng vi

khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 35 Bảng 3.3: Hoạt độ AU của L plantarum UL485 với 5 chủng vi khuẩn kiểm định 36 Bảng 3.4: Tổng kết quá trình tinh sạch bacteriocin của chủng L plantarum UL485

bằng cột sắc ký trao đổi cation 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của bacteriocin 12Hình 2.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm 27Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu theo hệ số 2 28

Hình 3.1: Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L plantarum UL485 với

KĐ28 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau 33

Hình 3.2: Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L plantarumUL485 với

KĐ28 tại các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau 35Hình 3.3: Hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum UL485 ở 60oC, 100oC,

121oC 37Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của chủng

Lactobacillus plantarum UL485 38

Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của chủng

KĐ28 43

Hình 3.10: Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarumUL485

qua cột Hitrap SP FF 1 ml 44Hình 3.11: Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn rửa giải với

KĐ28 44Hình 3.12: Điện di Glyxin – SDS PAGE 18% 47Hình 3.13: Khả năng chịu pH thấp, muối mật của chủng vi khuẩn

Lactobacillus plantarum UL485 48

MỞ ĐẦU

Hiện nay, các loại chất phụ gia ngày càng được sử dụng phổ biến trong quátrình sản xuất, chế biến và bảo quản thực phẩm nhằm cải thiện hương vị, duy trì chấtlượng dinh dưỡng cũng như độ tươi của sản phẩm Tuy nhiên, hiện tượng lạm dụngquá mức các chất này đã làm gia tăng tình trạng ngộ độc thực phẩm và mang lạinhiều tác hại cho sức khỏe người tiêu dùng Bởi vậy, việc nghiên cứu các chất khángkhuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệuquả hơn, an toàn hơn Khác với những hóa chất phụ gia và kháng sinh, bacteriocin làchất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng hợp theo con đườngriboxom ở vi khuẩn, có hoạt tính kìm hãm, ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn.Bacteriocin đã được công nhận là an toàn, không gây dị ứng và không gây hại chosức khỏe con người do nó bị phân hủy bởi proteinaza, lipaza ở đường ruột Điểnhình là nisin, một chất bảo quản được bổ sung trong các loại rau, sữa, pho mát,thịt…do nó có khả năng ức chế các vi sinh vật làm hỏng thực phẩm Từ đó, có thểthấy rằng, việc ứng dụng các bacteriocin có nguồn gốc từ vi khuẩn và cácbacteriocin có nguồn gốc tự nhiên sẽ mang lại những lợi ích vô cùng to lớn cho cuộcsống của con người

Những năm gần đây, vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) đã đượcứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm vàmột số ngành chế biến khác vì chúng có khả năng sinh axit, tạo hương và ức chế sựphát triển của một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Trong đó,

nhóm vi khuẩn Lactobacillus plantarum được đánh giá là ứng cử viên tiềm năng

trong việc sinh tổng hợp bacteriocin có khả năng tiêu diệt các tác nhân gây bệnh

như Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum và Staphylococcus aureus.

Đã có nhiều công bố nghiên cứu sâu về bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum, bao gồm cả tinh sạch cũng như xácđịnhcác bacteriocin mới để ứng dụng

trong công nghệ thực phẩm nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản, chống lại sựphát triển của các tác nhân gây bệnh, điều trị một số bệnh và duy trì sức khỏe chocon người Tuy nhiên để có thể sử dụng bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa nhữngchủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp bacteriocin có phổ hoạt tính rộng hoặc có

hoạt độ cao để nghiên cứu sâu về bacteriocin đó nhằm tạo tiền đề cho việc thu nhận,ứng dụng trong thực tế.

Xuất phát từ thực tiễn đó cùng với xu hướng chú trọng việc ứng dụng các

bacteriocin trong đời sống, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao tại Huế” nhằm góp

phần khai thác tiềm năng ứng dụng của các bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB được phân lập từ các mẫu thực phẩm ở Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic (LAB)

Vi khuẩn lactic đã được phát hiện và nghiên cứu từ rất lâu Năm 1780, nhàhóa học Scheele (Thụy Điển) lần đầu tiên tách chiết được axit lactic từ sữa bò lênmen chua Sau đó, năm 1847, Blondeau đã công nhận axit lactic là sản phẩm cuốicùng của chuỗi phản ứng lên men Đến năm 1857, Louis Pasteur chứng minh rằngviệc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt gọi là vikhuẩn lactic Năm 1873, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và

đặt tên là Bacterium lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis) Từ đó đến nay,

nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập, định danh và ngành côngnghiệp lên men để sản xuất axit lactic (hình thành từ năm 1881) được phát triển, mởrộng[25,40,45]

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều điều kiện môi trường khácnhau, chẳng hạn như trong phân, rác, niêm mạc ruột và đặc biệt là trong các sảnphẩm lên men chua Ngày nay, vi khuẩn lactic ngày càng được ứng dụng trên quy

mô lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus, [33].

1.1.1 Đặc điểm hình thái

1.1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là tên gọi của một nhóm vi khuẩn thu nhận năng lượng nhờquá trình phân giải cacbonhydrat kị khívà sinh ra axit lactic Chúng được xếp chung

vào họ Lactobacteriaceae Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình

thái, bao gồm cả dạng que ngắn, que dài và hình cầu, song về mặt sinh lí chúng lạitương đối thống nhất với nhau ở các đặc điểm:

khuẩn thuộc chi Lactobacillus chiếm số lượng lớn nhất vàStreptococcus, Leuconostoc, Lactococcusđược ứng dụng nhiều nhất trong ngành công nghiệp thực

Tế bào hình oval xếp thành từng đôi, chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài Chúng cónhu cầu cao về mặt dinh dưỡng Quá trình lên men dị hình của chúng tạo thành axitlactic và các sản phẩm phụ như axit axetic, etanol, CO2 Bên cạnh đó, vi khuẩn

thuộc chi Leuconostoc còn có khả năng tạo hương thơm cho bơ, sữa chua do tạo

thành các chất như axetyl metyl cacbinol hay axetonin [53]

Là những trực khuẩn kị khí, lên men lactic dị hình; sản phẩm chính là axit lactic

và axit axetic cùng với một lượng nhỏ axit formic, etanol, axit sucxinic Không giống

với các vi khuẩn lên men lactic dị hình khác, chi Bifidiobacterium không sinh CO2.Chúng thuộc loại ưa ấm và có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 31oC - 41oC [53]

Tế bào không di động, có hình que dài hoặc ngắn, thường xếp thành hìnhchuỗi với kích thước dao động trong khoảng 0,5 – 1,2 x 1 - 10 m Hầu hết vi khuẩnthuộc chi này là dạng kỵ khí không bắt buộc, một số ít chủng kỵ khí nghiêm ngặt,

có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 50oC – 53oC nhưng nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ

30oC – 40oC Ngoài ra, chúng có thể sống ở điều kiện pH < 5 [53]

Lactobacillus gồm 25 loài, được chia thành 3 nhóm: lên men lactic đồng hình

bắt buộc, lên men lactic dị hình bắt buộc và lên men lactic dị hình tùy ý Các nhóm

vi khuẩn lactic này đều tạo ra axit lactic nhưng axit do từng nhóm tạo ra lại khác

nhau về cấu hình đồng phân Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công nghiệp

chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt, các chế phẩm probiotic [53]

1.1.1.2 Đặc điểm của Lactobacillus plantarum

Nằm trong chi vi khuẩn lactic có số lượng lớn nhất này, L plantarum là

một trong những loài phổ biến nhất và đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành

công nghệ thực phẩm L plantarum có dạng hình que, thường kết đôi hoặc chuỗi và sinh trường tốt trong điều kiện vi hiếu khí Tính chất đặc trưng của L plantarum là khả năng dị hóa arginin và sinh ra nitric oxit L plantarum không có khả năng phân

giải amino axit, ngoại trừ tyrosin và arginin Chúng có đến 6 con đường chuyển hóaarginin khác nhau và đều sinh ra nitric oxit (NO) Việc sinh ra NO giúp chúng ngăn

chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida abicans, Escherichia coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng [36] Loài vi khuẩn này có khả năng

chịu axit thấp, được xếp vào nhóm vi sinh vật an toàn và có mối quan hệ gần gũi với

loài Lactobacillus pentosus, Lactobacillus paraplantarum và gần đây nhất là Lactobacillus fabifermentans (mức độ tương đồng về trình tự rARN lên tới 99%)

[28] L plantarum có thể được tìm thấy trong các loại thực phẩm giàu tinh bột, các

loại ngũ cốc, thịt, sản phẩm từ sữa, rau, trái cây, đồ uống,…Nó tồn tại được trong dạdày, đường ruột của con người và các động vật có vú khác Một số nghiên cứu củaBrinques và cộng sự (2010), Prins và cộng sự (2010), Todorov (2008) cho rằng, khả

năng thích ứng với các điều kiện môi trường khác nhau của L plantarum là nhờ quá

trình lên men hỗn hợp hàng loạt cacbonhydrat[28]

L plantarum sở hữu bộ gene lớn nhất trong số các vi khuẩn lactic với nhiễm

sắc thể dạng vòng có chứa 3.308.274 cặp base, % GC của nhiễm sắc thể là 44,5%

và các plasmid có % GC thấp hơn L plantarumWCFS1 có ba plasmid là

pWCFS101, pWCFS102, và pWCFS103 với kích thước tương ứng là 1.917 bp,2.365 bp và 36.069 bp Trình tự gen trên nhiễm sắc thể có tính có tính đa dạng di

truyền giúp vi khuẩn L plantarum thích ứng với nhiều điều kiện môi trường khác

nhau[39]

1.1.2 Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường trong điều kiện kị khí với sảnphẩm là axit lactic tích lũy trong môi trường Quá trình này có thể tóm tắt theophương trình sau:

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau về cơ chế chuyển hóa glucozơ Một vàiloài vi khuẩn lactic trải qua quá trình đường phân trong điều kiện kị khí tạo axitlactic và nhóm này được gọi là lên men đồng hình Một số nhóm khác ngoài axitlactic còn tạo ra rượu, CO2 và nhóm này được gọi là lên men dị hình [19,21].

1.1.2.1 Lên men lactic đồng hình

Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP(Embden - Meyerhof – Parnas Pathway) và tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic(hơn 85%) Phương trình tóm tắt của quá trình lên men đồng hình như sau:

C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH +

2ATP GlucozơAxit lactic

Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis, L.casei, L delbrueckii,…[19,21].

1.1.2.2 Lên men lactic dị hình

Ngoài axit lactic (chiếm đến 50%), quá trình lên men lactic dị hình còn có cácsản phẩm phụ khác như etanol, axetat, CO2,… Phương trình tóm tắt của quá trình lênmen dị hình như sau:

C6H12O6CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal

GlucozơAxit lactic Etanol

Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thường gặp là L amylovorus, L reuteri, L manihotivorans, [19,21].

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic.

1.1.3.1 Cacbonhydrat

Cacbonhydrat là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng thiết yếu cho sự sinhtrưởng của vi khuẩn lactic Ngoài ra, cacbon cũng có thể được lấy từ protein, axitaminvà glyxerol Vi khuẩn lactic sử dụng được hầu hết các loại đường, song

glucozơ là nguồn cacbon thích hợp nhất và tùy từng loại LAB khác nhau mà nguồn

cacbon phù hợp được lựa chọn Chẳng hạn như L acidophilus sinh trưởng mạnh hơn khi thay thế glucozơ bằng mantozơ, salicin, raffinozơ hoặc melibiozơ; L fermentum sinh trưởng tốt nhất với nguồn cacbon là maltozơ; S thermophilus phát

triển mạnh trong môi trường có lactozơ,… [21]

1.1.3.2 Axit amin và peptit

Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng choquá trình phát triển sinh khối của vi khuẩn lactic Axit amin và peptit có thể thunhận qua các hoạt động của enzym proteaza hoặc sự phân giải protein Theo đó, cácpeptit sẽ được chuyển hóa thành các axit amin tự do và một số hợp chất khác Quátrình sinh trưởng của LAB phụ thuộc vào nguồn cung cấp nitơ hữu cơ do vi khuẩnnày ít có khả năng sinh tổng hợp axit amin từ nguồn nitơ vô cơ Nhu cầu axit amincủa LAB khác nhau tùy theo chủng, loài Ví dụ, chỉ có 3 axit amin cần thiết cho sự

phát triển của vi khuẩn L plantarum trong khi L acidophilus cần tới 14 axit amin

[21]

1.1.3.3 Vitamin

Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic có thể phân chia thành 3 nhóm: vitaminthiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không thiết yếu Sự sinh trưởng và phát triểncủa vi khuẩn lactic có thể giảm từ 34 – 67% nếu không có các nhóm vitamin nàytrong môi trường dinh dưỡng Trong đó, axit pantothenic (vitamin B5), axitriboflavin (vitamin B2) và axit nicotinic (vitamin B3 hay vitamin PP) là những loạivitamin rất cần thiết cho hầu hết các chủng LAB.Khi thiếu riboflavin, sự sinh trưởng

L plantarum bị ức chế hoàn toàn Một số vitamin (chẳng hạn như vitamin H,

vitamin C,…) có thể là yếu tố kích thích cho sự tăng trưởng của một số chủng LABnhưng lại không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của một số chủng LAB khác [21]

1.1.3.4 Khoáng chất

Các khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic là hỗn hợpchứa các ion như kali, natri, magiê, mangan, sắt, clo và photphat Trong đó, Mn2+

có tác động tích cực đến sự phát triển và quá trình sản sinh ra axit lactic Ngoài ra,

Mg2+ còn tham gia vào trung tâm hoạt động của một số enzym hoặc đóng vai tròhoạt hóa các enzym xúc tác trong quá trình lên men lactic, nhờ đó hỗ trợ vi khuẩn

sử dụng tốt hơn các loại đường Mg2+ là khoáng chất thiết yếu cho sự phát triển của

các vi khuẩn L casei, L lactis, L delbrueckii, L helveticus và L acidophilus.

Ngoài ra, nó đảm nhiệm chức năng là cofactor đối với nhiều enzym liên quan đếnquá trình vận chuyển và trao đổi chất như fructokinaza, photphoketolaza và axetatkinaza [21]

1.1.3.5 Nhiệt độ

Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng, trải dài từ 15oC –

40oC Trong đó, 24 – 30oC là khoảng nhiệt độ tối ưu nhất cho sự phát triển của LABcũng như quá trình lên men để tạo ra axit lactic Các loài có nhiệt độ phát triển tối

ưu trong khoảng 40oC – 45oC được gọi là vi khuẩn ưa nhiệt; các loài có nhiệt độphát triển tối ưu trong khoảng 20oC - 40oC được gọi là vi khuẩn ưa ấm Những loài

vi khuẩn lactic sống trong đường ruột của người và động vật hầu hết thuộc loại ưa ấm[50]

1.1.3.6 pH

Vi khuẩn lactic hoạt động trong dải pH rộng Khả năng điều chỉnh pH trong

tế bào chất là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng nhất giúp cho vi khuẩnnày có khả năng chịu axit thấp hơn so với nhiều loài vi khuẩn khác Đa số các vi

khuẩn lactic có dải pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilus); 6 – 6,5 (L plantarum); 5,5 - 6,5 (Pediococcus) và 6,3 - 6,5 (Leuconostoc)[50].

1.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

1.2.1 Ứng dụng của vi khuẩn lactic nói chung

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưcông nghiệp, nông nghiệp, chế biến bảo quản thực phẩm, y học,… để sản xuất cácchế phẩm sinh học phục vụ đời sống Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, vikhuẩn này được sử dụng để lên men các sản phẩm từ sữa, từ thịt và tạo ra các phụgia thực phẩm Đáng kể nhất hiện nay là việc ứng dụng vi khuẩn lactic trong sảnxuất các chế phẩm sinh học để phục vụ nông nghiệp, chống ô nhiễm và bảo vệ môitrường [36]

Trong quá trình lên men, ngoài axit lactic, vi khuẩn lactic còn sản sinh nhiềuhoạt chất có giá trị như chất thơm, vitamin, bacteriocin,… Do đó, chúng được sửdụng trong ủ chua thức ăn gia súc nhằm tăng hàm lượng dinh dưỡng và năng suất

trong chăn nuôi Một số chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều nhất là L.

plantarum, Leuconostoc mesenteroides [36].

1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn L plantarum

Rất nhiều ứng dụng gắn liền với L plantarum trong quá trình sản xuất các

chế phẩm probiotic đã được công bốtrên các tạp chí khoa học uy tín Hầu hết các

nghiên cứu đều cho rằng, vi khuẩn lactic nói chung và L plantarum nói riêng có vai

trò bảo vệ, tăng cường chức năng đường ruột và cải thiện các triệu chứng ruột kích

thích Ngoài ra, L plantarum còn tác động tích cực đến hệ vi sinh vật trong đường

ruột, quá trình chuyển hóa lipit và làm giảm hội chứng viêm[36].

Vi khuẩn L plantarum có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin hiện diện tự

nhiên trong nhiều nguồn thực phẩm khác nhau, do vậy nó góp phần cải thiện đặctính cảm quan và đóng một vai trò thiết yếu trong việc kéo dài thời hạn sử dụngthực phẩm Nhờ đó, những phương pháp xử lý vật lý sử dụng trong quá trình bảo

quản thực phẩm có khả năng được giảm thiểu Do vậy, L plantarum đáp ứng các

yêu cầu của người tiêu dùng trong việc sử dụng thực phẩm tươi sống và thực phẩmđóng gói chứa ít hàm lượng chất bảo quản Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng của

L plantarum được các nhà khoa học quan tâm nhờ khả năng bảo vệ bề mặt da và

điều trị nhiễm trùng vết thương gây ra do bỏng [36]

Một ứng dụng khác của L plantarum liên quan đến việc xử lý mùi phân của

heo, đặc biệt là ở các trang trại lớn Bình thường, chế độ ăn uống có thể giảm bớtmùi hôi này nhưng lại tốn kém và hạn chế khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng

Trong khi đó, việc bổ sung vi khuẩn L plantarum vào chế độ ăn của heo, có hoặc

không bổ sung insulinlàm giảm đáng kể mùi phân của heo mà không ảnh hưởng đếnquá trình tiêu hóa thức ăn [36]

Nhờ khả năng ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhầy, L plantarum làm giảm hoạt động của nội độc tố do E.coli tiết ra, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại các vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, L plantarum cũng hỗ trợ tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì, lúa mạch đen, men bia,… Do đó, những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng được cải thiện đáng kể L plantarum còn được chứng minh là có khả năng làm giảm cholesterol khi chúng hoạt động riêng lẻ hoặc kết hợp với Lactobacillus paracasei trong khẩu

phần ăn của chuột Bên cạnh vai trò là giống khởi động trong quá trình lên men

thực phẩm, vi khuẩn L plantarum và bacteriocin của nó cũng được ứng dụng rộng

rãi trong sản xuất các sản phẩm probiotic [18,36]

1.3.Bacteriocin

Công trình đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình của Gratia vàcộng sự vào năm 1925 Họ đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của colicin V

được sinh tổng hợp bởi E coli Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc

tính của colicin Đó là một chất có khả năng gây chết nhiều vi sinh vật, có phổ hoạtđộng hẹp và phổ hoạt động này bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sảnxuất Các loài vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu về khả năng sản sinh

bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp và Staphylococcus sp Số lượng

công bố nghiên cứu về bacteriocin trong những năm 1980 đã có sự gia tăng đáng kể

Từ thời điểm này những nghiên cứu về bacteriocin với định hướng như một chất

kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm đã bắt đầu phát triển [15].

1.3.1 Định nghĩa

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổnghợp theo con đường riboxom ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lạicác vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng Bacteriocin không gây dị ứng vàkhông gây hại cho sức khỏe con người (do nó bị phân hủy bởi proteinaza, lipaza ởđường ruột) [10]

1.3.2 Phân loại

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin đã được xác định Cácbacteriocin rất đa dạng về cấu trúc và chức năng Tuy nhiên, việc phân loạibacteriocin hiện vẫn chưa được rõ ràng và đang còn tranh cãi Các bacteriocinthường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau Trong đó, phương phápphân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là dựa trên trọng lượng phân tử, cấutrúc và một số đặc tính của bacteriocin Theo đó, bacteriocin được chia thành 4 lớp:lớp I, lớp II lớp III và lớp IV Bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu

và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai lớp còn lại [31]

1.3.2.1 Lớp I

Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptit nhỏ (< 5 kDa), bềnnhiệt và tác động lên cấu trúc màng Một bacteriocin tiêu biểu và được nghiên cứusâu của nhóm này là nisin Các lantibiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia, Ib dựatrên cấu trúc hóa học và phương thức hoạt động [31,47]

1.3.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin đóng vai trò như một hệ thống miễn dịch tự nhiên của vi khuẩn.Theo đó, các vi khuẩn Gram dương và Gram âm có thể sinh tổng hợp nhiều loạibacteriocin nhằm kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn khác

Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của bacteriocin [51]

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein hay peptit được tổnghợp theo con đường riboxom Khi được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn sản xuất,bacteriocin có thể kết hợp với các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào của các vikhuẩn nhạy cảm để tiêu diệt vi khuẩn Các bacteriocin có thể tạo thành các kênh làmthay đổi tính thấm của màng tế bào; nó cũng có thể đóng vai trò như một loạinucleazavới chức năng phân giải ADN, ARN hoặc tấn công vào lớp peptidoglycan

để làm suy yếu thành tế bào (Hình 1.1) [51]

1.3.4 Đặc điểm của bacteriocin ở các nhóm vi khuẩn

Bacteriocin được sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gramdương với những đặc điểm sau:

 Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: Gồm nhiều loại khác nhau về kích

thước, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có

phổ kháng khuẩn hẹp hoặc có hoạt độ yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [43]

 Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: Các bacteriocin này rất đa dạng.

Tuy nhiên, quá trình sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương không gây chết vi sinh vật chủ và quá trình này cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm [43]

1.3.5 Các đặc tính của bacteriocin

1.3.5.1 Tính chất hóa học

Bacteriocin có bản chất là protein, nhưng cũng có thể là hỗn hợp của proteinvới các chất khác Các enzym đặc trưng như proteinaza, lipaza,…được sử dụng đểkiểm tra bản chất protein Phân tích hóa học cho thấy, bacteriocin là loại protein đơngiản, có trọng lượng phân tử thấp Tuy nhiên, bacteriocin đã được tinh sạch từmột

số vi khuẩn như Staphylococcus, Clostridium và Lactobacillus cho thấy chúng là

những phân tửphức tạp (ngoài cấu trúc protein chúng còn có thêm nhóm chức lipithoặccacbonhydrat)[12,41]

1.3.5.2 Tính chất vật lý

Các đặc tính lý học về độ bền nhiệt, pH hoạt động và khả năng bị thủyphân bởi enzym của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic đượcthể hiện trong Bảng 1.1

Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp

bởi vi khuẩn lactic [22]

Bacteriocin Độ bền nhiệt pH hoạt động Enzym thủy phân bacteriocin

Megacin A-216 600C, 30 phút 2 – 7 Chymotrypsin, Pepsin, TrypsinClostosin A 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin,Chymotrypsin, Dnaza,

Pronaza P, RnazaClostosin B 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,

Pronaza P, RnazaClostosin C 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,

Pronaza P, RnazaClostosin D 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,

Pronaza P, RnazaBoticin E-S5 1000C, 10 phút 1,1 – 9,5 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,

Pepsin

Alkalinphotphataza,Photpholipaza C, D