Nghiên cứu đặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Dƣơng Văn Hợp PGS TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2014 ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Dƣơng Văn Hợp PGS TS Bùi Thị Việt Hà tận tình giúp đỡ, dìu dắt hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lê Thị Hoàng Yến, Ths Nguyễn Anh Tuấn toàn thể cán Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hƣớng dẫn bảo cho suốt thời gian qua Cuối tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời thân giúp đỡ động viên tơi nhiều Với lịng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báo nói Hà Nội, tháng 06 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Hồng Nhung iii MỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CHITIN VÀ CH 1.1.1 Chit 1.1.2 Chito 1.2.SẢN XUẤT CHITIN, CHITOSAN VÀ OL 1.2.1 Sản xuất chitin, chitosan oligo chitosan đƣờng hoá học 1.2.2 Sản xuất chitin, chitosan oligo chitosan đƣờng sinh học 1.3.VAI TRÕ CỦA CHITIN/CHITIN OLIGOS 1.3.1 Đối với nông nghiệp 1.3.2 Đối với môi trƣờng 1.3.3 Ứng dụng y học 1.3.4 Tron 1.3.5 Tron 1.4.KHÁI QUÁT VỀ CHITINASE 1.4.1 Định 1.4.2 Những nguồn sản sinh chitinase 1.4.3 Phân 1.4.4 Cơ chế tác động loại enzyme chitinase 1.4.5 Các đặc tính enzyme chitinase 1.5.VAI TRÕ CỦA CHITINASE 1.5.1 Tron iv 1.5.2 Trong Y học 1.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI 1.6.1 Trên giới 1.6.2 Trong nƣớc Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.3 MÔI TRƢỜNG 2.3.1 Môi trƣờng PDA (Potato Dextro Agar) nuôi cấy giữ giống (g/l) 2.3.2 Môi trƣờng LCA (Low Carbon Agar) để phân loại hình thái học (g/l) 2.3.3 Môi trƣờng LB (Luria-Bertani)-agar (g/l) 2.3.4 Môi trƣờng lên men dịch thể (g/l) nghiên cứu chitinase 2.3.5 Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme chitinase đĩa thạch 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Phƣơng pháp sàng lọc sơ hoạt tính chitinase chủng nấm sợi 2.4.2 Phƣơng pháp nuôi cấy nấm sợi sinh tổng hợp chitinase 2.4.3 Phƣơng pháp định tính enzyme chitinase 2.4.4 Phƣơng pháp định lƣợng chitinase [58 2.4.5 Phƣơng pháp sắc ký mỏng (TLC- Thin layer chromatography) 2.4.6 Phƣơng pháp xác định khả kháng vi sinh vật 2.4.7 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tổng hợp chitinase nấm sợi 2.4.8 Tinh sơ enzyme chitinase 2.4.9 Điện di SDS v 2.4.10 Xác định hoạt tính chitinase Semi-Native PAGE 33 2.4.11 Xác định số đặc tính enzyme chitinase tinh 34 2.4.12 Phân loại chủng nấm sợi nghiên cứu 35 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHITIN CAO 40 3.2 KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA 44 CHỦNG NẤM SỢI ĐÃ TUYỂN CHỌN 41 3.3 ĐỊNH LƢỢNG CHITINASE 10 CHỦNG NẤM SỢI TUYỂN CHỌN .42 3.4 NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHỦNG VN10-1103 .43 3.4.1 Đặc điểm hình thái 43 3.4.2 Phân loại dựa phƣơng pháp sinh học phân tử 44 3.5 LỰA CHỌN MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA CHỦNG VN10-1103 45 3.5.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy 45 3.5.2 Lựa chọn pH môi trƣờng 46 3.5.3 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 47 3.5.4 Lựa chọn nguồn carbon 49 3.5.5 Nồng độ nguồn carbon phù hợp 50 3.5.6 Lựa chọn nguồn nitơ 51 3.5.7 Ảnh hƣởng nồng độ nitơ 52 3.5.8 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 53 3.6 TINH SẠCH SƠ BỘ CHITINASE 54 3.7 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TINH SẠCH 56 vi 3.7.1 pH tối ƣu cho hoạt động enzyme 56 3.7.2 Nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng enzyme 57 3.7.3 Độ bền nhiệt enzyme 58 3.7.4 Độ bền pH enzyme 59 3.7.5 Ảnh hƣởng ion kim loại 60 3.7.6 Khả phân giải chất enzyme 62 3.7.7 Khả kháng vi sinh vật chế phẩm 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Tài liệu Tiếng Việt 65 Tài liệu tiếng Anh 65 PHỤ LỤC - - vii DANH MỤC VIẾT TẮT T n ầy Viết tắt Axit deoxyribonucleic riboxom ADNr Cacboxymethyl cellulose CMC Đối chứng ĐC Môi trƣờng MT1 Internal Transcripbed Spacer ITS Môi trƣờng MT2 Môi trƣờng MT3 Môi trƣờng MT4 Môi trƣờng MT5 Môi trƣờng MT6 N–acetyl- D- glucosamine GlcNAc Optical Density OD Polymerase Chain Reaction PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Sodium dodecyl sulfat viii SDS DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình Cấu trúc phân tử chitin Hình Cấu trúc phân tử chitosan .4 Hình Cơ chế hoạt động hệ enzyme chitinase Trichoderma 14 Hình Đồ thị chuẩn biểu diễn độ hấp thụ N-acetyl glucosamin bước sóng 500nm 27 Hình Quy trình tinh enzyme chitinase sinh tổng hợp chủng nấm sợi lựa chọn 32 Hình n ng phân giải chất chitin c c chủng nấm sợi 42 Hình Hình ảnh khuẩn lạc (A) bào tử (B) chủng VN10-1103 44 Hình Sản phẩmPCR ITS –D1D2 ADNr chủng VN10-1103 gel agarose) 44 Hình Cây phát sinh chủng loại chủng VN10-1103 c c lồi có mối quan hệ họ hàng gần, xây dựa vào phân tích trình tự gen ADNr dựa vào trình tự đoạn ITS D1D2 45 Hình 10 Hoạt tính chitinase chủng VN10-1103 nuôi cấy c c pH môi trường kh c 47 Hình 11 Hoạt tính chitinase chủng VN10-1103 nuôi cấy c c nhiệt độ kh c 48 Hình 12 n ng sinh chitinase chủng VN10-1103 c c nguồn carbon khác 49 Hình 13 n ng sinh chitinase chủng VN10-1103 nuôi cấy c c nồng độ colloidal chitin khác 51 Hình 14 n ng sinh tổng hợp chitinase chủng VN10-1103 nuôi cấy c c nồng độ cao nấm men kh c 53 Hình 15 n ng sinh tổng hợp chitinase chủng VN10-1103 c c thời gian nuôi cấy 53 Hình 16 Biểu đồ biểu thị c c phân đoạn tinh chitinase VN10-1103 55 ix Hình 17 Sản phẩm điện di SDS-PAGE (A) Semi-native PAGE (B) chitinase VN10-1103 Hình 18 Ảnh hưởngcủa pH lên hoạt tính chitinase B.bassiana VN10-1103 Hình 19 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt động chitinase từ B.bassiana VN101103 Hình 20 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền enzyme chitinase từ B.bassiana VN10-1103 Hình 21 Ảnh hưởng pH lên độ bền chitinase B bassiana VN10-1103 Hình 22 Ảnh hưởng c c ion kim loại lên hoạt tính chitinase chủng VN101103 Hình 23 n ng phân cắ chủng VN10-1103 Hình 24 n ng kh ng F phẩm chủng VN10-1103 x 46 Mukhtar, H and Ikram-Ul-Haq (2008), Production of alkaline protease by Bacillus subtilis and its application as a depilating agent in leather processing”, Pakistan Journal of Botany, 40 (4), pp 1673-1679 47 Muzzarelli Raa, M.C (2009), Chitin and chitosan hydrogels”, Handbook of Hydrocolloids, pp 849-888 48 Natsir, H., A.R Patong, M.T Suhartono, and A Ahmad (2013), Isolation and purification of thermostable chitinase from Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a from Sulili Hot Spring in South Sulawesi, Indonesia”, International Journal of Pharma and Bio Sciences,4(3), pp 1252-1259 49 Orikoshi, H., S Nakayama, et al (2005), Roles of four chitinases (chia, chib, chic, and chid) in the chitin degradation system of marine bacterium Alteromonas sp strain O-7”, Application Environment Microbiology,71 (4), pp 1811-1815 50 Pankaj, P., A Deepti, B Tushar, and P Shridhar (2005), Chitinase production by Beauveria felina RD 101: optimization of parameters under solid substrate fermentation conditions”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21 (1), pp 93-95 51 Park, S.H., J.-H Lee, and H.K Lee (2000),Purification and Characterization of Chitinase from a Marine Bacterium, Vibrio sp 98CJ11027”, The Journal of Microbiology, 38 (4), pp 224-229 52 Pinnamaneni, R., K P., and S.R K.R.S (2010), Cloning and Expression of Bbchit1 gene of Beauveria bassiana ”, The Open Entomology Journal, 4, pp 30-35 53 Priya.C.S, Jagannathan.N, and Kalaichelvan.P.T (2011), Production of chitinase by Streptomyces hygroscopicus VMCH2 by optimisation of cultural conditions”, International Journal of Pharma and Bio Sciences,2(2), pp 210-219 54 Punja, Z.K and Y.-Y Zhang (1993), Plant Chitinases and Their Roles in Resistance to Fungal Diseases”, 25 (4), pp 526-540 70 55 Rinaudo, M (2006), Chitin and chitosan: Properties and applications”, Progress in Polymer Science, 31 (7), pp 603-632 56 Shahidi, F., J.K.V Arachchi, and Y.-J Jeon (1999), Food applications of chitin and chitosans”, Trends in Food Science & Technology, 10 (2), pp 3751 57 Sharaf, E.F., A.E.-A.Q El-Sarrany, and M El-Deeb (2012 ), Biorecycling of shrimp shell by Trichoderma viride for production of antifungal chitinase”, African Journal of Microbiology Research,6(21), pp 4538-4545 58 Svedese, V.M., P.V Tiago, J.D.P Bezerra, L.M Paiva, E.Á.D.L.A Lima, and A.L.F Porto (2013), Pathogenicity of Beauveria bassiana and production of cuticle-degrading enzymes in the presence of Diatraea saccharalis cuticle”, African Journal of Biotechnology,12 (46), pp 6491-6497 59 Taechowisan, T., J.F Peberdy, and S Lumyong1 (2003), Chitinase production by endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and its antagonism against phytopathogenic fungi”, Annals of Microbiology, 53 (4), ap 447-461 60 V., S.P and C M (1998), Utilization of prawn waste for chitinase production by the marine fungus Beauveria bassiana by solid state fermentation”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 14 (5), ap 655-660 61 Wang, S., T Liang, B Lin, C Wang, P Wu, and J Liu (2010), Purification and characterization of chitinase from a new species strain Pseudomonas sp TKU008.” Journal of Microbiology and Biotechnology, 20 (6), pp 10011005 62 Wang, S.L and W.T Chang (1997), Purification and characterization of two bifunctional chitinases/lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell powder medium”, Applied and Environment Microbiology, 63 (2), pp 380-386 71 63 White, T J., T Bruns, S Lee, and J W Taylor (1990), Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics”, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, pp 315-322 64 Xia, W., P Liu, J Zhang, and J Chen (2010), Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides”, Food Hydrocolloids, pp 1-10 65 Zeki, N.H and S.N Muslim (2010), Purification, characterization and antifungal activity of chitinase from Serratia marcescens isolated from Fresh Vegetables ”, Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science, 23 (1), pp 7-23 66 Zeng, D., J Wu, and J.F Kennedy (2008), Application of a chitosan flocculant to water treatment”, Carbohydrate Polymers, 71 (1), pp 135-139 72 PHỤ LỤC Trình tự gen oạn ITS thuộc ADNr c a ch ng VN10-1103: CTTCTAAGAATTAGAACACCGCAAGAAATTGATATATTATTTGATT CCAAATCCCTGTATTTTTGATTTTTAGACCCAATTGGCCCCCCCATA TTTGGGGGGCATCCTTTTTAAGGTTCTTTCAACCCTCGAACTCCCCG GGGAGAGGTCGGTTTGGGGACCGGAAGACACCCGCGGCCCTTAAA AGGAGGGCGGCCCTTCCGGGGGACCTTTGCGTAGTAAACAGTTCGC ACCGGAACCCGGACGGGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTG AACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT ACGTAATGGTCATCAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAG TCGTCTTCGTATGCGAGTGTTCGGGTGTCAAACCCCTACGCGTAAT GAAAGTGAACGTAGGTGAGAGCTTCGGCGCATCACCGACCGATCC TGATGTTCTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCATACGGGGCCGGACCC GAAAGAAGGTGAACTATGCCTGTATAGGGTGAAGCCAGAGGAAAC TCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCGAATCGATCGTCAA ATATGGGCATGGGGGCGAAAGACTAATCGAACCTTCTAGTAGCTG GTTTCCGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGTGTTGAACTCAGTTTT ATGAGGTAAAGCGAATGATTAGGGACTCGGGGGCGCTATATTGCC TTCATCCATTCTCAAACTTTAAATATGTAAGAAGCCCTTGTTACTTG ATTGAACGTGGGCATTCGAATGTATCAACAACTAGTGGCCATGTT Trình tự gen phần D1D2 c a ADNr 28S c a ch ng VN10-1103: TCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCCAGTAAC GGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTCAG GGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTTGGCGAGGTGCCTTC CGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCACAGAGGGTGAGAGCCCCGTAT GGTCGGACACCGAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAG TTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTA AATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAG -1- ATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAAAAGTACGTGAAATTGT TGAAAGGGAAGCGCCTATGACCAGACTTGCGCCCGGTGAATCACC CAGCGTTCTCGCTGGTGCACTTTGCCGGGCACAGGCCAGCATCAGT TCAGCGCGGGGGAGAAAGGCTTCGGGAATGTGGCTCCCTCGGGAG TGTTATAGCCCGCTGCGTAATGCCCTGCGCCGGACTGAGGTACGCG CATTGCAAGGATGCTGG Hoạt tính enzyme chitinase c a 438 ch ng nấm sợi Bảng 12 Sàng lọc sơ hoạt tính chitinase 438 chủng nấm sợi Số thứ tự Số thứ tự 33 34 35 10 11 12 13 14 15 -2- 16 VN 17 VN 18 VN 19 VN 20 VN 21 VN 22 VN 23 VN 24 VN 25 VN 26 VN 27 VN 28 VN 29 VN 30 VN 31 VN 32 VN Số thứ tự Tn 65 VN 66 VN 67 VN 68 VN -3- -4- 91 VN 92 VN 93 VN 94 VN 95 VN 96 VN 97 VN 98 VN 99 VN 100 VN Số thứ tự Tn 137 VN 138 VN 139 VN 140 VN 141 VN 142 VN 143 VN 144 VN 145 VN 146 VN 147 VN -5- -6- Số thứ tự Số thứ tự 207 242 208 243 209 244 210 245 211 246 212 247 213 248 214 249 215 250 251 252 253 254 255 -7- 225 260 226 261 227 262 228 263 229 264 230 265 231 266 232 267 233 268 234 269 235 270 236 271 237 272 238 273 239 274 240 275 241 276 Số thứ tự Số thứ tự 277 312 278 313 279 314 280 315 -8- -9- 303 338 304 339 305 340 306 341 307 342 308 343 309 344 310 345 311 346 Số thứ tự Số thứ tự 347 382 348 383 349 384 350 385 351 386 352 387 353 388 354 389 355 390 356 391 357 392 358 393 10- 11- 381 416 Số thứ tự Số thứ tự 417 428 418 429 419 430 420 431 421 432 422 433 423 434 424 435 425 436 426 437 427 438 12- ... Hoạt tính enzyme chitinase 438 chủng nấm sợi nghiên cứu 40 Bảng ết hoạt tính enzyme 44 chủng nấm sợi nghiên cứu MT1 41 Bảng Hoạt tính chitinase 10 chủng nấm sợi 43 Bảng Hoạt tính chitinase. .. này, đề tài: Nghi n cứu ặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi? ?? đƣợc thực nhằm: a) Tuyển chọn chủng nấm sợi sinh tổng hợp chitinase cao; b) Nắm đƣợc đặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi Chƣơng – TỔNG... 24 C pH nhiệt độ mà chitinase chủng bị biến tính [32] 1.6.2 Trong nƣớc Hiện Việt Nam có nhiều nghiên cứu enzyme chitinase từ nấm sợi, nhƣng nghiên cứu thƣờng tập trung nghiên cứu điều kiện ni cấy