Xác định mức độ thuần chủng của cá thể loài cá sấu xiêm (crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thắm XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THUẦN CHỦNG CỦA CÁ THỂ LOÀI CÁ SẤU XIÊM (CROCODYLUS SIAMENSIS) BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ NHẰM HỖ TRỢ CÔNG TÁC BẢO TỒN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC H Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thắm XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THUẦN CHỦNG CỦA CÁ THỂ LOÀI CÁ SẤU XIÊM (CROCODYLUS SIAMENSIS) BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ NHẰM HỖ TRỢ CÔNG TÁC BẢO TỒN Chuyên ngành : Sinh thái môi trƣờng Mã số : 8440301.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ ĐỨC MINH PGS TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN H Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập tơi nghiên cứu thực Các số liệu kết luận văn trung thực, có nguồn gốc rõ ràng Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thắm LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin gửi lời cám ơn chân thành tới PGS TS Lê Đức Minh, người nhiệt tình, chu đáo hướng dẫn, động viên, cổ vũ suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cám ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, thầy Phịng thí nghiệm Di truyền, môn Di truyền, khoa Sinh học tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ q trình hồn thành nghiên cứu Xin cảm ơn GS.TS Thomas Ziegler (Vườn thú Cologne, Đức), PGS TS Nguyễn Quảng Trường (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam), nhóm nghiên cứu TS Lưu Quang Vinh (Đại học Lâm nghiệp), vườn thú châu Âu hỗ trợ trình nghiên cứu thu thập mẫu vật Xin cảm ơn TS Phạm Hữu Khánh cán kiểm lâm, nhân viên Vườn quốc gia Cát Tiên tạo điều kiện cho thực nghiên cứu Cảm ơn thầy giáo, cô giáo Khoa Môi trường, thầy cô Bộ môn Sinh thái môi trường trang bị kiến thức tảng làm tiền đề cho tơi q trình nghiên cứu Cảm ơn CN Ngô Thị Hạnh tận tình giúp đỡ tơi thí nghiệm, phân tích, thảo luận góp ý để hồn thànhluận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Quỹ Môi trường Thiên nhiên Nagao Vườn thú Cologne Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp ủng hộ, động viên tơi q trình học tập, làm việc nghiên cứu MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 11 1.1 Cá sấu Xiêm trạng loài 11 1.2 Các mối đe doạ đến loài vấn đề lai tạo cá sấu sở nuôi nhốt 1.3 Các thị sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu 18 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng, địa điểm vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 23 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 24 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Thu mẫu, khảo sát thực địa 28 2.3.2 Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự xác định kiểu gen 29 2.3.3 Xây dựng quan hệ di truyền 34 2.3.4 Xác định mức độ chủng 35 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Tạo liệu di truyền cho quần thể Lào 36 3.1.1 Sự khác biệt mặt di truyền 36 3.1.2 Mối quan hệ di truyền 36 3.2 Xác định mức độ chủng 39 3.2.1 Xác định dòng mẹ 39 3.2.2 Khuếch đại locus microsatellite 40 3.2.3 Phân tích xác suất thuộc nhóm chủng 42 3.2.4 Phân tích tỷ lệ lồi cá thể 44 3.3 Đánh giá trạng bảo tồn VQG Cát Tiên 47 3.3.1 Khảo sát trạng bảo tồn Bàu Sấu 47 3.1.2 Kết vấn người dân 49 3.1.3 Kết vấn cán VQG Cát Tiên 51 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 iii TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic CITES Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora - Công ƣớc bn bán quốc tế lồi động thực vật hoang dã nguy cấp CR Critical Endangerd - Cực kỳ nguy cấp IAM Infinite allede model - Mơ hình alen vô hạn IUCN International Union for Conservation of Nature and Nature Resources Liên minh bảo tồn thiên nhiên quốc tế NCBI National Center for Biotechnology Information - Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp SMM Stepwise mutation model - Mơ hình đột biến bƣớc SSR Simple sequence repeats- Trình tự lặp lại đơn giản VQG Vƣờn quốc gia v DANH MỤC HÌNH ẢNH Nội dung Hình Bản đồ phân bố cá sấu Xiêm (Bezuijen cộng 2012) Hình Sai sót q trình chép tạo nên alen nhiều hơn, số lƣợng đơn vị lặp Hình Cây quan hệ di truyền dựa liệu gen ty thể dài 790bp phƣơng pháp Bayesian Hình Kết kiểm tra sản phẩm PCR số mẫu khuếch đại đoạn gen ty thể gel Agarose 1%, TBE 1X Hình Tín hiệu tốt kết giải trình tự Hình Tín hiệu nhiễu đoạn đầu phản ứng giải trình tự Hình Kết kiểm tra sản phẩm PCR số mẫu khuếch đại microsatellite Hình Tín hiệu kiểu gen locus Cj18 đƣợc đánh dấu huỳnh quang HEX Hình Tín hiệu kiểu gen locus Cj16 Cj101 đƣợc đánh dấu huỳnh quang FAM Hình 10 Thang đo để xác định kích thƣớc alen Hình 11 Biểu đồ phân tích với liệu microsatellite với K=3 Hình 12 Phần bàu trƣớc cửa trạm (Bàu Sấu nhỏ) Hình 13 Nguồn thức ăn dồi Bàu Sấu, VQG Cát Tiên vi DANH MỤC BẢNG Nộ Bảng Danh sách mẫu sử dụng nghiên cứu Bảng Trình tự mồi microsatellite sử dụng nghiên cứu Bảng Bảng khoảng cách di tru Bảng Kết phân tích liệu GeneClassv2.0 thể xác suất thuộc nhóm cá thể chủng Bảng Kết phân tích liệu STRUCTURE v2.3.4 Các mẫu tơ đỏ mẫu có khả thấp mẫu chủng vii 23 C cf siamensis 24 C cf siamensis 25 C cf siamensis 26 C cf siamensis 27 C cf siamensis 28 C cf siamensis 29 C cf siamensis 30 C cf siamensis 31 C cf siamensis 32 C cf siamensis 33 C cf siamensis 34 C cf siamensis 35 C cf siamensis 36 C cf siamensis 37 C cf siamensis 38 C cf siamensis 39 C cf siamensis 40 C cf siamensis 41 C cf siamensis 42 C cf siamensis 43 C cf siamensis 44 C cf siamensis 45 C cf siamensis 46 C cf siamensis 47 C cf siamensis 48 C cf siamensis 49 C cf siamensis 50 C cf siamensis 51 C cf siamensis 52 C cf siamensis 53 C cf siamensis 54 C cf siamensis 55 C cf siamensis 56 C cf siamensis 57 C cf siamensis 58 C cf siamensis 59 C cf siamensis 60 C cf siamensis 61 C cf siamensis 62 C cf siamensis 63 C cf siamensis 64 C cf siamensis 65 C cf siamensis 66 C siamensis 67 C siamensis 68 C siamensis 69 C siamensis 70 C cf siamensis 71 C siamensis 72 C siamensis 73 C siamensis 46 74 C siamensis 75 C cf siamensis 76 C porosus 77 C porosus 78 C porosus 79 C porosus 80 C porosus 81 C rhombifer 82 C rhombifer 83 C rhombifer 84 C rhombifer 85 C rhombifer Dựa kết chạy STRUCTUREv2.3.4, mẫu Cr60 vƣờn thú Lào mẫu có tỷ lệ cá sấu Xiêm (C siamensis) thấp 88,6% Đây mẫu đƣợc ghi nhận chủng chủ trang trại Tuy nhiên kết luận chƣa có sở khoa học cần tách khỏi chƣơng trình nuôi sinh sản phục vụ bảo tồn Mẫu trạm Hòn Me, Kiên Giang tổ chức WAR (Cr1) cá thể tự nhiên kênh gần cửa sông đổ vịnh Thái Lan bị bắt ngƣời dân Với số liệu tại, cá thể có khả cao chủng Do số cá thể chủng ngồi tự nhiên Việt Nam cịn tồn Tuy nhiên cá thể bị quyền tỉnh Kiên Giang chuyển đến khu nghỉ dƣỡng Vin Pearl đảo Phú Quốc trƣớc đƣợc gắn chíp Do khơng cịn khả sử dụng cá thể làm nguồn tái thả Các cá thể có khả cao mẫu chủng (tỷ lệ C siamensis 99%) cần đƣợc tách biệt với thể lại đƣa vào danh sách làm nguồn cho chƣơng trình tái thả 3.3 Đánh giá trạng bảo tồn VQG Cát Tiên 3.3.1 Khảo sát trạng bảo tồn Bàu Sấu Với việc thu mẫu phân, chúng tơi thu đƣợc phân cá sấu cá sấu trƣởng thành thƣờng không vệ sinh chỗ phơi nắng đƣờng Chúng thu mẫu sâu bên trảng cỏ nguy bị cá sấu cơng cao Cũng quan sát thu đƣợc mẫu vỏ trứng 47 Sau trình khảo sát, đƣa số kết điều kiện sống cá sấu Xiêm khu vực này: Thời điểm khảo sát chớm vào mùa mƣa nên mực nƣớc bàu gần tƣơng tự mùa khô tức diện tích mặt nƣớc khoảng 150ha [44] Mặt nƣớc bị trảng cỏ che phủ, lan rộng dẫn đến lấp đầy diện tích mặt nƣớc Các trảng cỏ hình thành loại cỏ liên kết bèo lại với nhau, tạo đám cỏ di chuyển mặt nƣớc Khảo sát quanh trảng dễ dàng ghi nhận dấu vết phơi nắng, lối lên cá sấu (Hình 4, Phụ lục) Sự phát triển mạnh mẽ trảng cỏ có hai mặt Đây nơi sinh sống trú ẩn lý tƣởng cho lồi nhƣng chiếm diện tích mặt nƣớc khơng có biện pháp hợp lí tích tụ dần nhiều chất lắng đọng đáy bàu, làm cho bàu bị nông dần biến dần thành vùng đất trũng Do có trạm kiểm lâm hoạt động khách du lịch nên cá sấu bơi lên bãi đất gần trạm kiểm lâm - khu vực có địa hình tƣơng đối phẳng Tuy nhiên khu vực trƣớc trạm kiểm lâm (Bàu Sấu nhỏ) nơi tập trung nhiều cá thể (Hình 12) - Hình 12 Phần bàu trƣớc cửa trạm (Bàu Sấu nhỏ) Một diện tích lớn Bàu Sấu bị che phủ mai dƣơng, loài xâm lấn có khả lan rộng nhanh Mặc dù vấn đề đƣợc khắc phục hoạt động tình nguyện số tổ chức nhƣng chƣa triệt để (Hình 6, Phụ lục) Mai dƣơng có gai nên cá sấu lên khu vực phẳng để phơi nắng hay đẻ trứng Nhƣ phần sinh cảnh sống cá sấu bị thu hẹp 48 Nguồn thức ăn cá sấu dồi dào, chủ yếu cá rơ phi (Hình12) Hiện nay, ngƣời dân từ khu vực lân cận vào khu vực để đánh cá trái phép Tuy nhiên, trạm kiểm lâm Bàu Sấu đƣợc đặt gần mặt nƣớc nên nguồn thức ăn loài khu vực bị ảnh hƣởng Hình 13 Nguồn thức ăn dồi Bàu Sấu, VQG Cát Tiên Theo ghi nhận cán kiểm lâm tồn số kẻ thù lồi ăn thịt cá sấu nhƣ: cá lóc bơng lớn, chim ó cá Tuy vậy, điều chƣa đủ ảnh hƣởng đến tồn quần thể kích thƣớc quần thể tăng qua năm Khu vực bờ quanh Bàu Sấu nhỏ rộng rãi, thống phẳng Tuy nhiên chúng tơi phát vài mẫu phân khô, nhỏ mà khơng có mẫu phân tƣơi Từ cho thấy cá sấu lên bờ mà chủ yếu nằm trảng cỏ mặt nƣớc Nhƣ vậy, Bàu Sấu có nhiều điều kiện lý tƣởng cho tồn lồi Tuy nhiên cịn tồn số vấn đề loài xâm lấn trảng cỏ ảnh hƣởng đến sinh cảnh sống loài Những vấn đề cần đƣợc cân nhắc khắc phục để tạo điều kiện tốt cho việc tồn phát triển quần thể cá sấu Xiêm 3.1.2 Kết vấn người dân Chúng vấn đƣợc 28 ngƣời dân ngƣời dân thuộc xã Đăk Lua, huyện Tân Phú, tỉnh Đồng Nai Những ngƣời dân vào rừng với mục đích khác nhƣ đánh cá, đặt bẫy săn thú, lấy gỗ 49 trái phép Các câu hỏi tập trung vào vấn đề: sinh kế ngƣời dân, thị trƣờng tiêu thụ sản phẩm từ cá sấu Xiêm, khả tiếp cận với khu vực có cá sấu Xiêm VQG Cát Tiên, phƣơng thức đánh cá ảnh hƣởng đến tồn cá sấu Xiêm, nhận thức ngƣời dân mức độ quan trọng việc bảo tồn loài Kết thu đƣợc nhƣ sau:  Sinh kế ngƣời dân: 28/28 ngƣời dân có nghề chủ yếu dựa vào nông nghiệp, trồng ngô, trồng dâu Săn bắt nghề phụ làm  Thị trƣờng tiêu thụ sản phẩm từ cá sấu Xiêm: 28/28 ngƣời trả lời tự lột da, thuộc da, khơng có nguồn tiêu thụ Thêm vào có trại cá sấu gần nên việc săn bắt trái phép cá sấu tự nhiên gần nhƣ không diễn  Sự tiếp cận ngƣời dân với khu vực: 7/28 ngƣời gần vào khu vực Bàu Sấu Ngƣời dân vào rừng từ nhiều cửa khác Tuy nhiên có vài trƣờng hợp bị cá sấu cắn nên việc đánh cá giảm dần Ngƣời dân bắt gặp đƣợc cá sấu nhiều kích thƣớc, độ tuổi khác từ sinh vài tháng tuổi  Phƣơng thức đánh cá: 3/28 ngƣời đánh cá cách dùng lƣỡi câu trùm, 4/28 ngƣời đánh cá phƣơng pháp chích điện Việc sử dụng lƣỡi câu trùm chích điện có nguy ảnh hƣởng lớn các sấu dễ bị mắc lƣỡi câu  Thực trạng cá sấu theo ngƣời dân: 28/28 ngƣời trả lời số lƣợng cá sấu VQG Cát Tiên tăng dần theo thời gian lan bàu khác Có mở rộng khu vực phân bố cá sấu khu vực lên phía bắc Bàu Sấu (khu vực có độ cao vừa phải không bị tách biệt với Bàu Sấu vùng đất cao) Các bàu nhắc đến nhƣ bàu Chim, bàu Thái Bình Dƣơng, bàu C4, bàu Ngang, bàu Sen, bàu Cá Tuy nhiên từ khơng cịn nƣớc lũ, trao đổi khu vực hạn chế Nguyên nhân tƣợng tác động việc xây thuỷ điện Trị An Nhƣ việc mở rộng khu vực phân bố loài từ Bàu Sấu khu vực lân cận  Nhận thức việc cần bảo vệ cá sấu Xiêm: 28/28 ngƣời dân biết mức độ xử phạt cho việc săn bắt trái phép cá sấu Xiêm 50 Kết điều tra vấn cho thấy ngƣời dân có hiểu biết trạng loài biết đƣợc mức xử phạt săn bắt trái phép với cá sấu riêng lồi khác nói chung nhờ vào cơng tác tuyên truyền từ quyền địa phƣơng lực lƣợng kiểm lâm Tuy nhiên sinh kế chủ yếu nông nghiệp nên ngƣời dân cần nguồn lợi từ rừng Do cần có biện pháp thích hợp để phát triển kinh tế địa phƣơng 3.1.3 Kết vấn cán VQG Cát Tiên Phỏng vấn thức đƣợc thực với cán VQG Cát Tiên bao gồm: TS Phạm Hữu Khánh, CN Phạm Văn Thuấn CN Đặng Văn Thành Chúng vấn cán kiểm lâm thuộc hai trạm kiểm lâm Bàu Sấu Đăk Lua bao gồm :CN Nguyễn Văn Tới, CN Lƣơng Văn Lực Những thông tin trạng lồi VQG Cát Tiên nói chung nhƣ sau: - Số lƣợng cá sấu tăng qua năm có tách đàn Số liệu thống kê cho thấy số lƣợng cá thể vào năm cuối năm 2017 177 với 69 trƣởng thành, 15 nhỡ 93 non Số đàn đàn với số lƣợng cá thể đàn dao động từ 15-35 non Số đàn tăng gấp đôi so với số liệu từ năm 2013 Khu vực Bàu Sấu nhỏ (phần mặt nƣớc trƣớc trạm kiểm lâm) nơi tập trung nhiều cá sấu điều kiện sinh sống lý tƣởng thức ăn mức độ bảo vệ kiểm lâm - Đợt giám sát vào năm 2015 khu vực Bàu Sấu nhỏ, bàu Cá, bàu Sen, bàu C6 suối Đăk Lua cho thấy cá sấu xuất Bàu Sấu nhỏ, bàu Cá, bàu Sen mùa mƣa Bàu C6 suối Đắk lua không ghi nhận đƣợc thông tin cá sấu Để khẳng định cá sấu vƣờn có di chuyển sơng Đồng Nai đƣờng suối Đăk Lua hay khơng cần có khảo sát Tháng 12/2015, cán kiểm lâm phát cá thể cá sấu trƣởng thành sinh sống bàu Cá Bàu mực nƣớc mức khoảng 1,5 mét khu vực trung tâm bàu Nhƣ vậy, khu vực Bàu Sấu, Bàu Cá có cá sấu sinh sống Bàu Sen vào tháng mùa khô mực nƣớc xuống thấp nên cá sấu di chuyển Bàu Sấu nhỏ [2, 3] 51 KẾT LUẬN Phân tích quần thể Lào Các mẫu phân tự nhiên quần thể Lào có kết xác định dịng mẹ cá sấu Xiêm (C siamensis) Kết xác định mức độ chủng cho thấy khả cao cá thể chủng Phân tích quan hệ di truyền mẫu không cho thấy có khác biệt đáng kể với cá thể chủng với khoảng cách di truyền 0% Phân tích xác định độ chủng thị sinh học phân tử Xác nhận 55/69 mẫu có khả cao chủng Các cá thể cần đƣợc tách biệt với cá thể không chủng nguồn gen quan trọng cho chƣơng trình nhân ni sinh sản phục vụ tái thả địa điểm phù hợp vùng phân bố nhƣ bổ sung cho quần thể tự nhiên Đánh giá trạng bảo tồn VQG Cát Tiên Cá sấu Bàu Sấu đƣợc bảo vệ tốt nhờ có quan tâm, giám sát bên liên quan Cá sấu Xiêm có điều kiện tốt thức ăn môi trƣờng sinh thái để phát triển vài vấn đề tồn Ngƣời dân nhận thức đƣợc mặt lợi, sách xử phạt việc bảo vệ sinh vật rừng có cá sấu Xiêm Cát Tiên Do sinh kế chƣa đƣợc đảm bảo chủ yếu phụ thuộc nông nghiệp nên ngƣời dân cần nguồn lợi rừng 52 KIẾN NGHỊ Các nghiên cứu với mục đích bảo tồn lồi cá sấu Xiêm (C siamensis) Lào, Việt Nam nƣớc có phân bố loài chƣa đƣợc thực đầy đủ Trong thời gian tới, hoạt động sau cần đƣợc thực để bảo tồn cá sấu Xiêm: - Điều tra trạng quần thể loài khu vực phân bố tiềm nhƣ khu vực lại VQG Cát Tiên, hồ Hà Lầm, hồ Ea Lâm Sông Hinh (Phú Yên) Việt Nam - Tiếp tục phân tích tính chủng cá thể khác vƣờn thú sở nuôi cá sấu khác nhằm phát cá thể chủng cho chƣơng trình nhân ni sinh sản hỗ trợ cơng tác bảo tồn lồi động vật nguy cấp - Hỗ trợ ngƣời dân Đăk Lua việc tìm sinh kế thay để giảm áp lực khai thác tài nguyên thiên nhiên gây ảnh hƣởng tới quần thể cá sấu Xiêm Bàu Sấu 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2017), "Thông tƣ số 04/2017/TTBNNPTNT Ban hành danh mục loài động vật, thực vật hoang dã quy định phụ lục cơng ƣớc bn bán quốc tế lồi động vật, thực vật hoang dã nguy cấp.", Hà Nội Vƣờn quốc gia Cát Tiên (2015), "Báo cáo giám sát quần thể cá sấu nƣớc (Crocodylus siamensis) vƣờn quốc gia Cát Tiên 2015", Đồng Nai Vƣờn quốc gia Cát Tiên (2017), "Báo cáo giám sát quần thể cá sấu nƣớc (Crocodylus siamensis) vƣờn quốc gia Cát Tiên 2017", Đồng Nai Tài liệu tiếng Anh Alderton D and B Tanner (1991), Crocodiles & alligators of the world, Facts on file Amos W (2010), "Mutation biases and mutation rate variation around very short human microsatellites revealed by human–chimpanzee–orangutan genomic sequence alignments", Journal of molecular evolution, 71, pp 192-201 Arnold M L (1992), "Natural hybridization as an evolutionary process", Annual review of Ecology and Systematics, 23, pp 237-261 Behler N., L Kopsieker, A Staniewicz, S Darmansyah, R Stuebing and T Ziegler (2018), "Population size, demography and diet of the Siamese crocodile, Crocodylus siamensis (Schneider, 1801) in the Mesangat Swamp in Kalimantan, Indonesia ", The Raffles Bulletin of Zoology, 66, pp 506–516 Bell M A and M P Travis (2005), "Hybridization, transgressive segregation, genetic covariation, and adaptive radiation", Trends in ecology & evolution, 20, pp 358-361 Benzuijen M R., C Phothitay, M Hedemark and S Chanrya (2006), "Preliminary status review of the Siamese Crocodile (Crocodylus siamensis Schneider; 1801)(Reptilia: Crocodylia) in the Lao People's Democratic Republic Living Aquatic Resources Research Centre (Government of Lao PDR)" 10 Bezuijen M (2010), "Crocodylus siamensis (Siamese Crocodile) Diet", Herpetological Review, 41, pp 68-69 11 Bezuijen M., R Mollot and B Amath (2006), "Strengthening Siamese crocodile conservation through community participation in Lao PDR", Crocodile Specialist Group Newsletter, 25, pp 10-11 12 Bezuijen M., B Simpson, N Behler, J Daltry and Y Tempsiripong (2012), "Crocodylus siamensis, Siamese Crocodile", Journal, 2012: e.T5671A3048087 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2012.RLTS.T5671A3048087.en 13 Bezuijen M R., J H Cox Jr, J B Thorbjarnarson, C Phothitay, M Hedemark and A Rasphone (2013), "Status of siamese crocodile (Crocodylus siamensis) schneider, 1801 (reptilia: crocodylia) in laos", Journal of Herpetology, 47, pp 41-65 14 Brinkmann B., M Klintschar, F Neuhuber, J Hühne and B Rolf (1998), "Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length 54 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 of the tandem repeat", The American Journal of Human Genetics, 62, pp 1408-1415 Brown W M (1985), "The mitochondrial genome of animals", Molecular evolutionary genetics, pp 95-130 Chaeychomsri W., P Tabthipwon, N Noparatnaraporn and V Siripholvat (2008), "Development of microsatellite markers for Siamese Crocodile (Crocodylus siamensis)", Kasetsart J.(Nat Sci.), 42, pp 256-262 Chapuis M P., C Plantamp, R Streiff, L Blondin and C Piou (2015), "Microsatellite evolutionary rate and pattern in Schistocerca gregaria inferred from direct observation of germline mutations", Molecular ecology, 24, pp 6107-6119 Chavananikul V., S Wattanodorn and P Youngprapakorn (1994), Karyotypes of species of crocodile kept in Samutprakan Crocodile Farm and Zoo, Crocodiles The 12th Working Meeting of the IUCN-SSC Crocodile Specialist Group IUCN, Gland, Switzerland, pp.58-62 Chinnery P F and G Hudson (2013), "Mitochondrial genetics", British Medical Bulletin, 106, pp 135-159 Chistiakov D A., B Hellemans and F A Volckaert (2006), "Microsatellites and their genomic distribution, evolution, function and applications: a review with special reference to fish genetics", Aquaculture, 255, pp 1-29 Cornuet J M., S Piry, G Luikart, A Estoup and M Solignac (1999), "New methods employing multilocus genotypes to select or exclude populations as origins of individuals", Genetics, 153(4), pp 1989-2000 Cuvier F (1807), "Sur les differentes especes de Crocodiles vivans et Sur leurs caracteres distinctiss", Ann Natl Mus Hist Nat Paris, 10, pp 8-86 Earl D A (2012), "STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method", Conservation genetics resources, 4, pp 359-361 FitzSimmons N N., Buchan, J.C., Lam, P.V., Polet, G., Hung, T.T., Thang, N.Q and Gratten J.(2002) Part B 294:373-381 (2002), "Identification of purebred Crocodylus siamensis for reintroduction in Vietnam", Journal of experimental zoology, 294, pp 373–381 FitzSimmons N N., S Tanksley, M R Forstner, E E Louis, R Daglish, J Gratten and S Davis (2000), "Microsatellite markers for Crocodylus: new genetic tools for population genetics, mating system studies and forensics", Crocodilian biology and evolution, pp 51-57 Goldstein D B., A R Linares, L L Cavalli-sforza and M W Feldman (1995), "Genetic absolute dating based on microsatellites and the origin of modern humans", Proc Natl Acad Sci USA 92, pp 6723-6727 Gupta A., A Bhardwaj, Supriya, P Sharma, Y Pal and M a S Kumar (2015), "Mitochondrial DNA- a Tool for Phylogenetic and Biodiversity Search in Equines", Journal of Biodiversity & Endangered Species, S1: S1.006, pp 28 Han S., H Leng, N Ratanapich, S Piseth, H Sovannara, B Simpson, A Brook, J L Frechette and J C Daltry (2015), "Status, distribution and 55 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 ecology of the Siamese crocodile Crocodylus siamensis in Cambodia", Cambodian Journal of Natural History 2, pp 153–164 Hansson B., M Tarka, D A Dawson and G J Horsburgh (2012), "Hybridization but no evidence for backcrossing and introgression in a sympatric population of great reed warblers and clamorous reed warblers ", PLoS ONE, 7(2) Ho C T (1994), "Status and conservation of crocodiles in Vietnam", Proceedings of the 12th Working Meeting of the IUCN-SSC Crocodile Specialist Group IUCN: Gland, pp 28-34 Huelsenbeck J P and F Ronquist (2001), "MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees", Bioinformatics, 17, pp 754-755 Ji X., X Wu, P Yan and G Amato (2008), "Complete sequence and gene organization of the mitochondrial genome of Siamensis Crocodile (Crocodylus siamensis)", Molecular biology reports, 35, pp 133-138 Lapbenjakul S., W Thapana, P Twilprawat, N Muangmai, T Kanchanaketu, Y Temsiripong, S Unajak, S Peyachoknagul and K Srikulnath (2017), "High genetic diversity and demographic history of captive Siamese and Saltwater crocodiles suggest the first step toward the establishment of a breeding and reintroduction program in Thailand", PloS one, 12, pp e0184526 Madesis P., I Ganopoulos and A Tsaftaris (2013), "Microsatellites: evolution and contribution", Microsatellites, pp 1-13 Man Z., W Yishu, Y Peng and W Xiaobing (2011), "Crocodilian phylogeny inferred from twelve mitochondrial protein-coding genes, with new complete mitochondrial genomic sequences for Crocodylus acutus and Crocodylus novaeguineae", Molecular phylogenetics and evolution, 60, pp 62-67 Miles L G., S L Lance, S R Isberg, C Moran and T C Glenn (2009), "Cross-species amplification of microsatellites in crocodilians: assessment and applications for the future", Conservation genetics, 10, pp 935-954 Murphy D (2004), The status and conservation of Javan rhinoceros, Siamese crocodile, Phasianidae and gaur in Cat Tien National Park, Vietnam, Cat Tien National Park Conservation Project Technical Report Nguyen X V., N L Vu, B K Simpson, V T Ngo, T Q Lai, X Q Huynh and V D Vo (2006), Status of the Freshwater Crocodile (Crocodylus siamensis) in Song Hinh District, Phu Yen Province, Viet Nam, Mekong Wetlands Biodiversity Conservation and Sustainable Use Programme, Vientiane, Lao PDR Paetkau D., W Calvert, I Stirling and C strobeck (1995), " Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears", Mol Ecol., 4, pp 347-354 Pastorini J., A Zaramody, D J Curtis4, C M Nievergelt and N I Mundy (2009), "Genetic analysis of hybridization and introgression between wild mongoose and brown lemurs", BMC Evolutionary Biology, (32) 56 41 Phothitay C., B Phommachanh and M Bezuijen (2005), "Siamese Crocodiles at 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Ban Kuen Zoo, Lao PDR", Crocodile Specialist Group Newsletter, 24, pp 11-12 Platt S G., V Monyrath, H Sovannara, L Kheng and T R Rainwater (2012), "Nesting phenology and clutch characteristics of captive Siamese Crocodiles (Crocodylus siamensis) in Cambodia", Zoo biology, 31, pp 534-545 Platt S G and N V Tri (2000), "Status of the Siamese crocodile in Vietnam", Oryx, 34 (3), pp 217-221 Polet G., D J Murphy, V L Phan and V M Tran (2002), "Crocodile Conservation at Work in Vietnam; Re-Establishing Crocodylus siamensis in Cat Tien National Park", Technical Report, pp 86-95 Pritchard J K., M Stephens and P Donnelly (2000), "Inference of population structure using multilocus genotype data", Genetics, 155, pp 945–959 Rannala B and J L Mountain (1997), "Detecting immigration by using multilocus genotypes", Proc Natl Acad Sci USA, 94, pp 9197-9221 Richard G.-F., A Kerrest and B Dujon (2008), "Comparative genomics and molecular dynamics of DNA repeats in eukaryotes", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72, pp 686-727 San Gabriel M., S W Chan, N Alhathal, J Z Chen and A Zini (2012), "Influence of microsurgical varicocelectomy on human sperm mitochondrial DNA copy number: a pilot study", Journal of assisted reproduction and genetics, 29, pp 759-764 Schneider J G (1801), "Historiae amphibiorum naturalis et literariae", Fasciculus secundus continens Crocodilos, Scincos, Chamaesauras, Boas Pseudoboas, Elapes, Angues Amphisbaenas et Caecilias Frommanni, Jena, 2, pp 374 Seehausen O (2004), "Hybridization and adaptive radiation", Trends in ecology & evolution, 19, pp 198-207 Simpson B and S Han (2004), "Siamese crocodile (Crocodylus siamensis) surveys in Cambodia", Crocodiles The 17th Working Meeting of the Crocodile Specialist Group IUCN, Gland, Switzerland, pp 110-120 Simpson B K and M R Bezuijen (2010), "Siamese crocodile Crocodylus siamensis", Crocodile Specialist Group: Darwin , Third Edition, ed by S.C Manolis and C Stevenson., pp 120-126 Webb G J., P G Bayliss and S C Manolis (1989), "Population research on crocodiles in the Northern Territory, 1984–86", Proceedings of the 8th Working Meeting of the Crocodile Specialist Group of the Species Survival Commission of the IUCN Ecuador Youngprapakorn P (1991), "Crocodile chromosomes", Crocodile Specialist Group Newsletter, 10, pp 20 Ziegler T and V Q Luu (2015), "Rediscovery of the Siamese crocodile (Crocodylus siamensis) in khammouane province, central lao PDR", Crocodile Specialist Group: Darwin., 34 (3), pp 11-13 57 PHỤ LỤC Hình Phỏng vấn ngƣời dân có kinh nghiệm rừng trạm kiểm lâm Đăk Lua Hình Một mẫu phân 58 Hình Thu mẫu phân mẫu mơ cá sấu Hình Lối vào trảng cỏ rậm rạp lộ rõ lối lại cá sấu Hình Chỗ nằm phơi nắng trảng cỏ cá thể có kích thƣớc lớn 59 Hình Phần khoảng trống lộ vào mùa khơ có mai dƣơng khoảng đƣợc đốt bớt Hình Một cá thể nằm phơi nắng khoảng trống trƣớc cửa trạm kiểm lâm 60 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thắm XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THUẦN CHỦNG CỦA CÁ THỂ LOÀI CÁ SẤU XIÊM (CROCODYLUS SIAMENSIS) BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ NHẰM HỖ TRỢ CÔNG TÁC... thực đề tài ? ?Xác định mức độ chủng cá thể loài cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) sinh học phân tử nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng liệu di truyền cho quần thể phát Khammouane... truyền cá thể cá sấu Cuba cá sấu nƣớc mặn 7,2% - 7,54% Khoảng cách di truyền cá thể cá sấu Xiêm cá sấu Cuba 6,29% - 9,91% Khoảng cách di truyền cá thể sấu Xiêm cá sấu nƣớc mặn 6,56 - 11,75% Quần thể