Luận văn thạc sĩ xác định mức độ thuần chủng của cá thể loài cá sấu xiêm (crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn

Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho quần thể mới Khuếch đại, giải trình tự đoạn gen ty thể có kích thước 790bp, đồng thời xác định kiểu gen 8 locus mi

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thắm

XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THUẦN CHỦNG CỦA CÁ THỂ LOÀI CÁ SẤU

XIÊM (CROCODYLUS SIAMENSIS) BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

NHẰM HỖ TRỢ CÔNG TÁC BẢO TỒN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

H Nội - 2018

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THUẦN CHỦNG CỦA CÁ THỂ LOÀI CÁ SẤU

XIÊM (CROCODYLUS SIAMENSIS) BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

NHẰM HỖ TRỢ CÔNG TÁC BẢO TỒN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ ĐỨC MINH

PGS TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập do chính tôi nghiên cứu và thực hiện Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực, có nguồn gốc rõ ràng

Tác giả luận văn

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới PGS TS

Lê Đức Minh, người đã nhiệt tình, chu đáo hướng dẫn, động viên, cổ vũ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành bài luận văn này

Tôi xin gửi lời cám ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, cùng các thầy cô trong Phòng thí nghiệm Di truyền, bộ môn Di truyền, khoa Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành nghiên cứu này

Xin cảm ơn GS.TS Thomas Ziegler (Vườn thú Cologne, Đức), PGS TS Nguyễn Quảng Trường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), nhóm nghiên cứu của TS Lưu Quang Vinh (Đại học Lâm nghiệp), và các vườn thú tại châu Âu đã hỗ trợ trong quá trình nghiên cứu và thu thập mẫu vật

Xin cảm ơn TS Phạm Hữu Khánh cùng các cán bộ kiểm lâm, nhân viên tại Vườn quốc gia Cát Tiên đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu này

Cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Môi trường, các thầy cô trong Bộ môn Sinh thái môi trường đã trang bị những kiến thức nền tảng làm tiền đề cho tôi quá trình nghiên cứu

Cảm ơn CN Ngô Thị Hạnh đã tận tình giúp đỡ tôi trong thí nghiệm, phân tích, thảo luận và góp ý để hoàn thànhluận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Quỹ Môi trường Thiên nhiên Nagao và Vườn thú Cologne

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã ủng

hộ, động viên tôi trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu

Trang 5

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 11

1.1 Cá sấu Xiêm và hiện trạng loài 11

1.2 Các mối đe doạ đến loài và vấn đề lai tạo cá sấu trong các cơ sở nuôi nhốt 1.3 Các chỉ thị sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 18

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 23

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Thu mẫu, khảo sát ngoài thực địa 28

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự và xác định kiểu gen 29

2.3.3 Xây dựng cây quan hệ di truyền 34

2.3.4 Xác định mức độ thuần chủng 35

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Tạo dữ liệu di truyền cho quần thể mới tại Lào 36

3.1.1 Sự khác biệt về mặt di truyền 36

3.1.2 Mối quan hệ di truyền 36

3.2 Xác định mức độ thuần chủng 39

3.2.1 Xác định dòng mẹ 39

3.2.2 Khuếch đại các locus microsatellite 40

3.2.3 Phân tích xác suất thuộc về nhóm thuần chủng 42

3.2.4 Phân tích tỷ lệ loài trong từng cá thể 44

3.3 Đánh giá hiện trạng bảo tồn tại VQG Cát Tiên 47

3.3.1 Khảo sát hiện trạng bảo tồn tại Bàu Sấu 47

3.1.2 Kết quả phỏng vấn người dân 49

3.1.3 Kết quả phỏng vấn cán bộ VQG Cát Tiên 51

KẾT LUẬN 52

Trang 6

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58

Trang 7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CITES Convention on International Trade in Endangered Species of Wild

Fauna and Flora - Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động thực vật hoang dã nguy cấp

IUCN International Union for Conservation of Nature and Nature Resources -

Liên minh bảo tồn thiên nhiên quốc tế

Công nghệ sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ)

Trang 8

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Bản đồ phân bố cá sấu Xiêm (Bezuijen và cộng sự 2012) 14

Hình 2 Sai sót trong quá trình sao chép tạo nên alen mới có thể

Hình 3 Cây quan hệ di truyền dựa trên dữ liệu gen ty thể dài 790bp

Hình 4 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của một số mẫu khuếch đại

Hình 6 Tín hiệu nhiễu ở đoạn đầu của phản ứng giải trình tự 41

Hình 7 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của một số mẫu khuếch đại

Hình 8 Tín hiệu kiểu gen của locus Cj18 đƣợc đánh dấu huỳnh

Hình 9 Tín hiệu kiểu gen của locus Cj16 và Cj101 đƣợc đánh dấu

Hình 11 Biểu đồ phân tích với bộ dữ liệu microsatellite với K=3 46

Hình 13 Nguồn thức ăn dồi dào tại Bàu Sấu, VQG Cát Tiên 50

Trang 9

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 Trình tự các mồi microsatellite sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 3 Bảng khoảng cách di truyền các mẫu trong nghiên cứu 38

Bảng 4 Kết quả phân tích dữ liệu microsatellite bằng phần mềm

GeneClassv2.0 thể hiện xác suất thuộc về nhóm cá thể thuần chủng 43

Bảng 5 Kết quả phân tích dữ liệu microsatellite bằng phần mềm

STRUCTURE v2.3.4 Các mẫu tô đỏ là mẫu có khả năng thấp là mẫu

thuần chủng

46

Trang 10

MỞ ĐẦU

Do có sự đa dạng về địa hình, tiểu vùng khí hậu và các hệ sinh thái nên khu

hệ động vật hoang dã của Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài, phân bố ở hầu hết các vùng địa lý và cảnh quan khác nhau Tuy nhiên, những ảnh hưởng của suy thoái môi trường do tác động của con người, tình trạng khai thác quá mức và biến đổi khí hậu, đã khiến nhiều loài động vật đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng vì mất sinh cảnh sống và suy giảm số lượng quần thể, đặc biệt là các loài sống ở hệ sinh thái rừng nhiệt đới, trong đó có các loài cá sấu

Cá sấu xiêm (Crocodylus siamensis) là một loài cá sấu nước ngọt được Liên

minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế xếp vào nhóm cực kỳ nguy cấp (CR) Loài này cũng được liệt vào phụ lục I theo công ước CITES bởi sự phân mảnh quần thể và tình trạng săn bắt trái phép tăng mạnh

Tại Việt Nam, loài này đã từng được coi là tuyệt chủng ngoài tự nhiên Cho tới đầu những năm 2000, nhóm các nhà khoa học tại Việt Nam và đại học Queensland đã thực hiện chương trình tái thả cá sấu xiêm về vườn quốc gia Cát Tiên từ một số sơ sở nuôi động vật hoang dã Nghiên cứu của Polet năm 2006 và kết quả điều tra, giám sát vào năm 2015, 2017 của VQG Cát Tiên cho thấy có sự xuất hiện con non và gia tăng số lượng cá thể phản ánh hiệu quả của chương trình tái thả

Tại Lào và Việt Nam, lai không kiểm soát giữa các loài này thường xuyên diễn ra tại các trại nuôi nhốt Hai loài thường được lai với cá sấu Xiêm là cá sấu

nước mặn (C porosus) và cá sấu Cuba (C rhombifer) Con lai thường có kích

thước lớn, có giá trị thẩm mỹ và khó phân biệt về mặt hình thái với cá sấu Xiêm thuần chủng Sự tồn tại của cá thể lai ngoài tự nhiên sẽ gây tác động xấu đến sự tồn tại của cá thể thuần chủng bởi sự cạnh tranh về nơi ở, nguồn thức ăn và có thể làm ảnh hưởng đến nguồn gen của loài Bên cạnh đó, quần thể mới phát hiện tại bản Sóc, Khammouane, Lào chưa được thực hiện nghiên cứu về sinh học phân tử

Trang 11

Vì những lý do trên tôi thực hiện đề tài “Xác định mức độ thuần chủng của

cá thể loài cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử nhằm hỗ

trợ công tác bảo tồn”

Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng dữ liệu di truyền cho quần thể mới phát hiện tại Khammouane (Lào)

- Xác định sự thuần chủng của các cá thể tại khu vực nuôi nhốt bao gồm một vườn thú tại Lào, vườn thú Thủ Lệ (Hà Nội), vườn thú Sài Gòn (Tp Hồ Chí Minh)

- Đánh giá hiện trạng bảo tồn loài tại VQG Cát Tiên

Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho quần thể mới

Khuếch đại, giải trình tự đoạn gen ty thể có kích thước 790bp, đồng thời xác định kiểu gen 8 locus microsatellite

Xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên các mẫu vật của quần thể mới với các dữ liệu đã công bố trên ngân hàng gen (NCBI)

- Nội dung 2: Đánh giá mức độ thuần chủng của các cá thể trong một số khu nuôi nhốt tại Lào và Việt Nam

Xác định dòng mẹ: khuếch đại, giải trình tự đoạn gen ty thể, đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ Blast và xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên các dữ liệu thu được

Xác định độ thuần chủng: khuếch đại, xác định kiểu gen 8 locus microsatellite

Phân tích xác suất thuộc nhóm cá thể thuần chủng bằng phần mềm GeneClassv2

Phân tích tỷ lệ loài trong từng cá thể bằng phần mềm STRUCTUREv2.3.4

- Nội dung 3: Đánh giá hiện trạng bảo tồn loài tại VQG Cát Tiên

Khảo sát hiện trạng bảo tồn loài tại Bàu Sấu

Phỏng vấn các cán bộ, kiểm lâm thuộc VQG Cát Tiên và người dân xã Đăk Lua (huyện Tân Phú, tỉnh Đồng Nai)

Trang 13

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cá sấu Xiêm và hiện trạng loài

Sơ lược các nghiên cứu liên quan đến cá sấu Xiêm

Cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) hay còn được gọi là cá sấu Thái Lan hoặc cá sấu nước ngọt là một trong 13 loài thuộc giống Cá sấu (Crocodylus), thuộc

bộ Cá sấu (Crocodilia), lớp Bò sát (Reptilia) Loài này lần đầu được mô tả bởi Schneider vào năm 1801 [49] Chúng cũng được mô tả bởi một số tác giả khác như Anonymous (1688), Du (1733), tuy nhiên công bố của Schneider được sử dụng chủ yếu [22]

Các nghiên cứu về hiện trạng loài được thực hiện nhiều bởi tình trạng suy giảm liên tục của loài này từ thập kỉ 70 của thế kỉ trước [9, 43, 44] Đó cũng là nguyên nhân mà các nghiên cứu về sinh thái học còn khá hạn chế và ít có sự thống nhất vì số lượng còn rất ít trong tự nhiên [35] Năm 2005, nhóm Phothitay thực hiện nghiên cứu về thực trạng cá thể tại vườn thú Ban Kuen, Lào [41] Tại đây chúng

thường được lai với cá sấu nước mặn C.porosus Hiện nay trình tự toàn bộ hệ gen ty thể và nghiên cứu quan hệ di truyền các loài trong giống Crocodylus đã được công

bố bởi nhóm Ji và cộng sự (2008), Man và cộng sự (2011) [32, 35] Đây là cơ sở dữ liệu hữu ích cho các nghiên cứu trên gen ty thể

Chỉ thị microsatellite cho giống Crocodylus nói chung và cho cá sấu Xiêm

nói riêng đã được nghiên cứu và phát triển bởi nhóm FitzSimmons và cộng sự thuộc đại học Queensland (Úc), nhóm nghiên cứu của Chaeychomsri và cộng sự (2008) [16, 24, 36] Nghiên cứu của FitzSimmons và cộng sự là cơ sở khoa học cho dự án tái thả cá sấu tại VQG Cát Tiên năm 2002.Nghiên cứu về nhiễm sắc thể cũng được thực hiện bởi Youngprapakorn (1991) [54]

Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào ngoài nghiên cứu của nhóm FitzSimmons sử dụng chỉ thị microsatellite để xác định tính thuần chủng của các cá thể các sấu Xiêm phục vụ tái thả tại Vườn Quốc gia Cát Tiên Như vậy, các nghiên

Trang 14

cứu ứng dụng chỉ thị microsatellite để xác định mức độ thuần chủng của các cá thể nuôi nhốt tại Lào và Việt Nam chưa được thực hiện nhiều và chưa có tính cập nhật

Phân bố

Cá sấu Xiêm phân bố trên đất liền khu vực Đông Nam Á và một phần nhỏ thuộc In-đô-nê-xi-a Quần thể thuộc In-đô-nê-xi-a có sự khác biệt lớn với quần thể trên đất liền Dưới nhiều áp lực lên các quần thể tự nhiên, khu vực phân bố của loài ngày càng giảm và bị phân mảnh mạnh mẽ Hiện nay, cá sấu Xiêm phân bố ở các nước Campuchia, Lào, Thái Lan, In-đô-nê-xi-a và Việt Nam [12] Bản đồ phân bố loài được thể hiện ở Hình 1 Khu vực phân bố ngoài tự nhiên tại các nước như sau:

Campuchia: Cá sấu Xiêm phân bố ở 35 địa điểm trong hệ thống 21 sông thuộc về 11 tỉnh, chủ yếu ở các khu vực khó tiếp cận ở phía Tây Nam và Đông Bắc Các quần thể lớn nhất còn tồn tại là hệ thống sông Sepro, Sekong, Sre Ambel thuộc thành phố Koh Kong (Kampong Saom), Pursat, Koi, Kep, Tatai, Areng và đầm Veal Veng [12, 52] Tuy nhiên các đợt điều tra thực địa của nhóm Han và cộng sự vào năm 2015 chỉ phát hiện cá sấu Xiêm trong 50% địa điểm còn phân bố trước đó [28] Khu vực có cá sấu là các vùng rừng xung quanh dãy núi Cardamom và ở độ cao 500m so với mực nước biển

Indonesia: Hồ Mesangat thuộc hệ thống sông Mahakam thuộc tỉnh Kalimantan, Borneo là nơi duy nhất hiện nay ghi nhận loài này ngoài khu vực đất liền Báo cáo địa phương từ năm 1998 cho thấy là có sự xuất hiện loài này tại tỉnh Central Kalimantan [12]

Lào: Các nghiên cứu của Bezuijen và cộng sự cho thấy loài xuất hiện tại hệ thống 7 sông Xe Champhone, Xe Banghiang, Xe Bangfai và Xe Xangxoy (tỉnh Savannakhet), Xe Pian-Xe Khampho (tỉnh Attapu), Xe Don River (tỉnh Salavan) và khu bảo tồn quốc gia Phou Khaokhouay (tỉnh Bolikhamxay) Nghiên cứu của nhóm Ziegler và cộng sự (2015) đã ghi nhận một quần thể mới tại Bansoc (tỉnh Khammoune) [55]

Thái Lan: Các quần thể chủ yếu còn tồn tại ở miền Trung và miền Tây Thái Lan bao gồm vườn quốc gia Pang Sida và vườn quốc gia Kaengkrachan [37]

Trang 15

Việt Nam: Năm 2008, số lượng cá sấu Xiêm có khoảng hơn 50.000 cá thể còn tồn tại, chủ yếu ở các trang trại ở miền Nam Trước đó, loài này đã từng có khu vực phân bố khá rộng tại các khu vực khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai, Phú Yên;

hồ Lắk thuộc tỉnh Đắk Lắk và sống nhiều ở khu vực sông Đồng Nai đặc biệt là Bàu Sấu thuộc VQG Cát Tiên [30] Sau 5 chuyến khảo sát vào năm 2000 tại các địa điểm khác nhau, nhóm Platt và Ngô Văn Trí đã đưa ra kết luận là cá sấu Xiêm tại Việt Nam đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên [43] Sau các nỗ lực tái thả tại VQG Cát Tiên, quần thể ở Bàu Sấu đã được khôi phục và ngày càng phát triển [44] Các chuyến khảo sát thực địa của nhóm Nguyễn và cộng sự ghi nhận sự tồn tại của ít nhất hai cá thể tại bàu Hà Lầm, Phú Yên vào năm 2005 [38] Tuy nhiên, đến năm

2012, người dân phát hiện một cá thể cái trưởng thành bị chết tại hồ Ea Lâm cùng thuộc xã Ea Lâm Điều này cho thấy khả năng còn tồn tại cá sấu tại xã Ea Lâm, sông Hinh, Phú Yên là rất thấp Như vậy, với các số liệu hiện tại, VQG Cát Tiên là nơi duy nhất tại Việt Nam còn tồn tại cá sấu Xiêm ngoài tự nhiên

Một số đặc điểm sinh thái của cá sấu Xiêm

Cá sấu Xiêm là một loài cá sấu nước ngọt có kích thước trung bình Sinh cảnh sống phù hợp với loài này khá đa dạng bao gồm các vùng nước chảy như các sông và suối có dòng chảy chậm, đầm lầy, sông, hồ ngập nước theo mùa, đầm lầy

và đồng lầy [52]

Các nghiên cứu về sinh thái học của loài này vẫn còn khá ít Thức ăn chủ yếu của chúng là cá, rắn, động vật lưỡng cư và một số loài động vật có vú nhỏ và thậm chí cả xác thối [10] Ngoài ra, chúng cũng ăn côn trùng, ốc sên [7]

Về sinh sản, ngoài tự nhiên cá sấu Xiêm đẻ từ 11-26 trứng và con số này trong điều kiện nuôi nhốt là 6-50 trứng [42, 51] Tổ ấp trứng được con cái xây từ những mảnh vụn của cây và trộn với bùn [42] Trứng sẽ nở sau khoảng 70-80 ngày

ấp Sau khi trứng nở, con cái sẽ giúp con non ra khỏi trứng, sau đó ngậm con trong hàm và đưa chúng ra mặt nước [4] Cá sấu non sau 6 tháng tuổi thường sẽ tách đàn

và đi kiếm ăn riêng Trong giai đoạn này chúng có thể bị đối mặt với nhiều kẻ thù

hoặc tự tạo đàn mới

Trang 16

Hình 1 Bản đồ phân bố cá sấu Xiêm (Bezuijen và cộng sự 2012)

Hiện trạng loài

Theo thang xếp hạng của Liên minh bảo tồn thế giới (IUCN), tình trạng bảo tồn của cá sấu Xiêm đang ở mức CR A2cd v3.1 tức là cực kỳ nguy cấp và dự đoán suy giảm ít nhất 80% trong 10 năm tới hoặc 3 thế hệ tới bởi sự suy giảm nơi cư trú, khu phân bố hoặc chất lượng sinh cảnh sống, và mức độ khai thác hiện tại [12] Cá sấu Xiêm cũng được liệt vào phụ lục I của công ước CITES tức là mức nguy cấp bị

đe doạ tuyệt chủng do các hoạt đông khai thác buôn bán và bị kiểm soát nghiêm ngặt việc xuất nhập khẩu giữa các nước [1] Một mối đe doạ gần đây có thể có ảnh hưởng rất lớn đến sự tồn tại của loài này là mức độ lai tạo không kiểm soát giữa các

Trang 17

loài cá sấu trong các trang trại nuôi nhốt vì con lai không bị kiểm soát bởi pháp luật nên có thể tự do buôn bán

Hiện trạng loài tại Việt Nam

Việt Nam là nước duy nhất có phân bố cá sấu Xiêm mà từng bị tuyên bố đã tuyệt chủng ngoài tự nhiên Những số liệu về cá sấu Xiêm từ trước những năm 1990

là không có Tuy nhiên, các nghiên cứu cho rằng việc săn bắt cá sấu Xiêm bắt đầu

từ những năm 1970 và thời kì đỉnh điểm là giai đoạn 1975-1980 Đến những năm

1999, có nhiều tranh cãi về sự tồn tại của cá sấu Xiêm ngoài tự nhiên tại Việt Nam [43]

Sau các cuộc khảo sát, điều tra, phân tích thực nghiệm, vào cuối năm 2001, các cá thể cá sấu Xiêm thuần chủng đầu tiên đã được tái thả vào Bàu Sấu, VQG Cát Tiên Đây là nỗ lực nhằm hồi phục quần thể của loài này ở Việt Nam được thực hiện dựa trên các hoạt động hợp tác của các nhà khoa học từ đại học Queensland và các nhà khoa học Việt Nam [44] Đến năm 2005, các cá thể cá sấu con đầu tiên đã được phát hiện khẳng định sự thành công của dự án tái thả [40] Từ đó đến nay, các đợt điều tra, giám sát của các cán bộ VQG Cát Tiên cho thấy có sự gia tăng về mặt

số lượng cá thể và số lượng đàn tại Bàu Sấu

Hiện trạng loài tại Lào

Các đợt khảo sát từ năm 2003 đến 2008 ghi nhận 13 khu vực phân bố của cá sấu Xiêm với ít nhất là 36 cá thể xuất hiện với mật độ thấp Các đợt khảo sát tại 35 địa điểm của nhóm Bezuijen và cộng sự vào năm 2013 đã ghi nhận sự có mặt của cá sấu Xiêm tại 13/15 địa điểm Số lượng cá thể trong mỗi khu vực trong khoảng từ 1-

11 cá thể và 13 địa điểm này nằm trong vào 6 hệ thống sông khác nhau [13]

Một số lượng lớn cá thể đang được nuôi nhốt trong các trang trại tại Lào [41] Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào xác định độ thuần chủng của các cá thể này trong khi tình trạng lai không kiểm soát giữa các loài vẫn diễn ra

1.2 Các mối đe doạ và vấn đề lai tạo cá sấu trong các cơ sở nuôi nhốt

Các mối đe doạ đến loài bao gồm săn bắt, suy giảm và mất môi trường sống,

phân mảnh khu vực phân bố Tại các nước trong khu vực, tình trạng săn bắt trái

Trang 18

phép trứng và cá sấu vẫn diễn ra Trứng và các con non có thể dùng làm nguồn cho các trang trại nuôi nhốt Cá sấu có kích thước lớn bị giết để lấy da đem bán Hoạt động của các trang trại này gây ra áp lực rất lớn lên các quần thể tự nhiên

Việc ngăn đập thuỷ điện có ảnh hưởng đến chất lượng nước và lượng nước của môi trường sống tại Campuchia và Việt Nam [12, 44] Ví dụ, sông Đồng Nai có ảnh hưởng đến các khu ngập nước tại VQG Cát Tiên Trên sông này có tất cả 5 đập thuỷ điện bao gồm Trị An, Đồng Nai 2,3,4,5 Thuỷ điện Trị An đã làm giảm lưu lượng nước vào các khu ngập nước [3] Hai dự án 6 và 6A đã bị huỷ vì những ảnh hưởng đến đa dạng sinh học của VQG Cát Tiên Các quần thể tự nhiên tại Lào có số lượng cá thể rất thấp và gần như không có sự kết nối giữa các quần thể [13]

Gia tăng biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trung bình tăng 0,4 đến 1,2oC có thể ảnh hưởng đến việc quyết định giới tính trong quá trình ấp trứng cũng như sự tăng trưởng và tồn tại của các cá thể [53]

Vấn đề lai tạo cá sấu Xiêm là mối đe doạ tiềm tàng đến việc bảo tồn cá sấu

Xiêm tại các nước Đông Nam Á vì nó có thể gây ra sự xáo trộn di truyền giữa các

loài nếu vô tình hoặc cố ý thả các con lai vào tự nhiên

Sự lai tạo giữa các loài khác nhau là hiếm gặp trong tự nhiên Việc lai khác loài xảy ra với cả thực vật và nhiều lớp động vật khác nhau như côn trùng, cá, lưỡng

cư, chim, thú ăn thịt và linh trưởng[40] Lai khác loài diễn ra phổ biến hơn trong thời gian gần đây bởi việc di chuyển các loài từ khu vực phân bố tự nhiên của chúng sang các khu vực khác phục vụ nhu cầu của con người Nghiên cứu về lai khác loài

và khu vực lai có thể cung cấp thông tin về các quá trình tiến hoá như sự thích nghi, dòng gen và tách loài [8, 40] Quá trình lai khác loài sẽ tạo ra các cá thể có kiểu gen, kiểu hình mới và khác biệt, bất thụ và đôi khi là con lai có sức sống tốt trội hơn cả hai loài gốc Kết quả của quá trình này phụ thuộc vào hướng chọn lọc của tự nhiên

Có nhiều khả năng xảy ra do kết quả của quá trình lai tạo: hai loài hợp nhất thành một loài và hai loài bố mẹ hoàn toàn biến mất; hàng rào sinh sản sẽ được tạo ra giữa hai loài bố mẹ; vật liệu di truyền sẽ được chuyển vào hai loài và được giữ lại bởi quá trình chọn lọc thích nghi; một loài lai mới được hình thành; khu vực lai sẽ được tạo ra mà không làm ảnh hưởng đến sự tồn tại của loài bố mẹ [6, 50]

Trang 19

Đối với cá sấu Xiêm, các nghiên cứu về tác động của con lai với hai loài

thường được lai với nó là cá sấu nước mặn (C porosus) và cá sấu Cuba (C

rhombifer) hiện nay chưa được thực hiện Con lai sinh ra thường có kích thước lớn

có thể sẽ cạnh tranh với những cá thể thuần chủng về nơi ở, nguồn thức ăn nếu được thả về tự nhiên Điều này ảnh hưởng đến sự tồn tại các quần thể ngoài tự nhiên Do

đó việc tách các con lai với các cá thể thuần chủng là cần thiết để tránh những mối nguy hại đến sự tồn tại của loài cá sấu Xiêm

Vì cá sấu Xiêm bị liệt vào phụ lục I của CITES [1] và các nước có phân bố loài đều tham gia vào công ước này nên các hoạt động buôn bán, xuất nhập khẩu là trái phép Tuy nhiên việc lai với loài khác và các hoạt động thương mại lại không bị ngăn cấm Thêm vào đó, thực trạng quản lý thiếu nghiêm ngặt dẫn đến tình trạng lai khác loài diễn ra tràn lan tại các khu vực nuôi nhốt như các vườn thú nhà nước, các trang trại cá sấu tư nhân Tại Việt Nam, các trang trại nuôi cá sấu chủ yếu tập trung

ở các tỉnh phía Nam Tại các trang trại này, cá sấu Xiêm chủ yếu được lai với cá sấu

nước mặn (C porosus) do con lai sinh ra sẽ có kích thước lớn như cá sấu nước mặn

và có hoa văn đẹp như cá sấu Xiêm Tình trạng tương tự cũng xảy ra tại các cơ sở

nuôi nhốt ở Thái Lan Ngoài ra, cá sấu Xiêm cũng vô tình bị lai với cá sấu Cuba (C

rhombifer) bởi một số cá thể loài này được tặng cho cho chính phủ Việt Nam từ

năm 1985 Các bằng chứng về việc lai cá sấu Xiêm với hai loài cá sấu nước mặn (C

porosus) và cá sấu Cuba (C rhombifer) được công bố dựa trên các nghiên cứu sử

dụng chỉ thị microsatellite và các đợt điều tra, khảo sát của FitzSimmons và cộng sự (2000, 2002), Phothitay và cộng sự (2005) [13, 18, 24]

Tại Lào, các chương trình bảo vệ cá sấu Xiêm với sự tham gia của cộng đồng

đã được thực hiện từ những năm 2006 [11] Các đợt khảo sát nhằm tìm thêm quần thể mới vẫn đang liên tục được thực hiện tại các khu vực tiềm năng [13, 55] Việt Nam có chương trình tái thả vào VQG Cát Tiên từ năm 2000 Từ đó đến nay quần thể tái thả đã có sự tăng về số lượng và mở rộng đàn nhờ có sự bảo vệ nghiêm ngặt [3, 37] Tuy nhiên hiện nay, khu vực hồ Hà Lâm và Ea Lâm tại Sông Hinh, Phú Yên không được bảo vệ và giám sát Năm 2017, nhóm Lapbenjakul và cộng sự đã công

Trang 20

bố nghiên cứu đa dạng di truyền của cá sấu Xiêm và cá sấu nước mặn nhằm mục đích tái thả vào tự nhiên tại Thái Lan [33]

1.3 Các chỉ thị sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu

Chỉ thị Microsatellite

Microsatellite là những đoạn lặp lại nhất định trong hệ gen nhân có chiều dài

từ 1-6 bp và lặp lại khoảng 5-50 lần [14] Microsatellite là một công cụ hữu ích trong việc lập bản đồ gen và nghiên cứu cấu trúc di truyền của các quần thể đồng thời là một chỉ thị di truyền giúp phân biệt các quần thể với nhau do chúng đơn giản, phân bố đều trên hệ gen nhân và tốc độ biến đổi của chúng khá nhanh Microsatellite còn được biết đến với các thuật ngữ như STR’s (Short tandem repeats), VNTR (Variable number tandem repeats), SSR’s (simple sequence repepeats), SSTR (sequence tandem repeats), SSLP (simple sequence length), STMS (sequence tagged microsatellites) [14, 20]

Mỗi đơn vị lặp của microsatellite thường có từ 1-5 nucleotide [47] Có 4 cách lặp có thể là:

Ví dụ: CACATTCACACATTCATT (các đoạn CA bị ngắt quãng)

Vì microsatellite thuộc hệ gen nhân nên chúng tồn tại ở hai trạng thái :

Trang 21

Đồng hợp:

Dị hợp:

Cơ chế và mô hình đột biến của microsatellite

Nguồn gốc của microsatellite trong bộ gen nhân là kết quả của quá trình tự nhiên gây ra do sự cân bằng giữa các cơ chế ngăn chặn và thúc đẩy sự hình thành

Tỷ lệ đột biến của một locus microsatellite phụ thuộc vào cách thức lặp, lượng GC chứa trong vùng liền kề (flanking region), kích thước alen, trạng thái nhiễm sắc thể, phân chia tế bào, giới tính, tuổi, kiểu lặp, kiểu gen và tỷ lệ đột biến này cao hơn so với các phần còn lại của gen nhân (10-2-10-6/locus/thế hệ) [17, 34] Hai cơ chế đột biến đơn giản nhất của microsatellite là sai sót trong quá trình sao chép ADN và sai sót trong trao đổi chéo và kết hợp trong pha đầu của giảm phân (Hình 2) [34]

Hình 2 Sai sót trong quá trình sao chép tạo nên alen mới có thể nhiều hơn,

hoặc ít hơn số lượng đơn vị lặp [34]

Trang 22

Có hai mô hình đột biến chính là: mô hình alen vô hạn (IAM-infinite allede model) và mô hình đột biến từng bước (SMM- stepwise mutation model) Trong mô hình alen vô hạn IAM, sau một loạt các sự kiện đột biến sẽ tạo nên một alen mới và alen đó có nhiều hơn một đoạn lặp và khác biệt so với alen ban đầu (parental allele)

Mô hình đột biến từng bước SMM dự đoán rằng kết quả của đột biến là tạo nên một alen mà đơn vị lặp lại của nó có kích thước lớn hoặc nhỏ hơn Sự khác biệt về kích thước truyền tải thêm thông tin về mối quan hệ tổ tiên giữa các alen Theo mô hình IAM, alen giữa các cá thể khác nhau có thể là giống nhau hoặc khác nhau Còn theo

mô hình SMM, có thể có sự giống và khác nhau giữa các cá thể nhưng sự khác biệt kích thước lớn thì quan hệ giữa các alen sẽ xa hơn so với các alen có kích thước nhỏ Tỷ lệ đột biến trung bình của một microsatellite là khoảng 10-2-10-6 trên một locus trên một thế hệ, giữa các loài khác nhau và các loại microsatellite khác nhau

tỷ lệ này là khác nhau [5, 34] Ngoài ra, một số mô hình đột biến khác như: mô hình alen K (KAM- K-Allele model), mô hình hai pha (TPM- Two-phase-model)

Nghiên cứu về microsatellite với cá sấu Xiêm (C siamensis)

FitzSimmons và cộng sự đã phát triển 26 locus microsatellite cho cả giống cá

sấu (Crocodylus) [25] 21/ 26 locus được nghiên cứu chứa các đoạn lặp CA với số

lần lặp từ 12 đến 26 Các locus khác chứa các đoạn lặp phức tạp như : Cj35 chứa (CT)7TA(CA)17(CT)12, Cj127 chứa (CT)7TT(CT)12(CA)16, CUD78 chứa (CA)10(TA)9, CUJ131 chứa (CA)7(TA)3(CA)10, CUJ-B131 chứa (CA)18(TA)9 Nghiên cứu này là nền tảng để lựa chọn 8 locus dùng để xác định cá thể cá sấu thuần chủng nhằm mục đích phục hồi lại quần thể tự nhiên tại Bàu Sấu, Cát Tiên từ những cá thể trong trang trại ở Sài Gòn [24, 25] vào năm 2002 [44] Các locus này đều chứa các đoạn lặp dinucleotide CA với số lần lặp từ 12 đến 22 lần Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Chaeychomsri và cộng sự cũng đã phát triển 20 locus microsatellite từ thư viện micosatellite giàu (AC)15 [16]

Chỉ thị gen ty thể

ADN ty thể là cấu trúc ADN hầu hết là mạch vòng kép nằm trong ty thể Hai loại sợi phân biệt nhau bởi thành phần nucleotit: sợi nặng (H-strand) giàu Guanine

Trang 23

và sợi nhẹ (L-strand) giàu Cytosine [19] nên phiên mã và sao chép ADN ty thể đƣợc diễn ra đồng thời Chúng chỉ chiếm một lƣợng rất nhỏ trong lƣợng lớn vật chất

di truyền của một tế bào nhân chuẩn (nằm chủ yếu trong nhân tế bào) Mỗi ty thể chứa từ khoảng 2-10 bản sao của một ADN ty thể Số lƣợng ty thể là khác nhau giữa các loại tế bào dựa theo nhu cầu năng lƣợng của mỗi loại tế bào và số lƣợng bản sao ADN ty thể trong mỗi tế bào vào khoảng 100-10000 Chiều dài của toàn bộ

hệ gen ty thể là khác nhau giữa các loài khác nhau và có độ dài vào vào khoảng 15000-17000bp [19]

ADN ty thể mã hoá cho 37 gen (28 gen trên sợi nặng và 9 gen trên sợi nhẹ [19]), 13 gen trong đó mã hoá cho chuỗi polypeptit trong chuỗi truyền điện tử (trên tổng số 92 thành phần của chuỗi, phần còn lại đƣợc mã hoá bởi hệ gen nhân), 22tRNAs và hai rRNAs [19, 27] Bốn phần chính của ADN ty thể bao gồm: D-Loop, rRNA, tRNA và đoạn gen mã hoá cho protein [27]

Vai trò của đoạn D-Loop

Đoạn D-Loop có tỷ lệ đột biến cao trung bình cao Tỷ lệ này khác nhau giữa các khu vực đặc biệt cao tại HVI và HVII Do có tỷ lệ đột biến trung bình cao nên đoạn này đƣợc sử dụng nhiều để nghiên cứu sự biến đổi trong quần thể, sự di nhập

cƣ, phân tích pháp y và chuẩn đoán y khoa [27] Sự biến đổi trình tự ADN ty thể có thể diễn ra theo 4 cách: sắp xếp lại, thêm nucleotit, bớt nucleotit và thay thế [15] Tuy nhiên các nghiên cứu về đa dạng di truyền, phát sinh chủng loại chủ yếu quan tâm đến đột biến thay thế và tỷ lệ đột biến thay thế của mỗi vị trí trên gen ty thể gấp

từ 5-10 lần so với tỷ lệ này ở hệ gen nhân [27] Tuy nhiên độ bảo tồn của gen ty thể vẫn thấp hơn so với các vùng biến đổi trong hệ gen nhân ví dụ nhƣ microsatellite

Do vậy, hệ gen ty thể đƣợc sử dụng nhiều hơn trong các nghiên cứu quan hệ di truyền và phát sinh chủng loài [19]

ADN ty thể di truyền theo dòng mẹ bởi số lƣợng ty thể trong trứng lớn hơn nhiều so với lƣợng ty thể trong tinh trùng Ngoài ra còn có một số nguyên nhân khác của nguyên lí này nhƣ sự suy thoái hệ gen ty thể trong hệ sinh dục đực, sự mất đuôi của tinh trùng trong quá trình thụ tinh Các công trình nghiên cứu gen ty thể

Trang 24

đóng góp lớn trong việc xây dựng cơ sở di truyền phả hệ giúp tái hiện lịch sử, tìm ra nguồn gốc phát sinh của các loài [48]

Các công trình nghiên cứu gen ty thể của cá sấu Xiêm và các loài khác trong

giống cá sấu, đặc biệt là cá sấu nước mặn (C porosus) và cá sấu Cuba (C

rhombifer) đã được thực hiện trong thời gian qua Cá sấu Xiêm đã có 3 trình tự

được công bố trên ngân hàng gen NCBI với mã truy cập DQ353946.1 [32], NC_008795.1 và EF581859.1 Chiều dài hệ gen ty thể nhóm Ji và cộng sự giải được

có chiều dài 16836 bp bao gồm 31 gen mã hoá protein, 22 gen tRNAs, 2 rRNAs và một vùng kiểm soát Thành phần của sợi nặng bao gồm: A:32.01% (5389 bp); T: 24.76% (4168 bp); C: 28.47% (4793 bp); G: 14.77% (2486 bp)

Đoạn ADN ty thể sử dụng trong nghiên cứu là một đoạn ADN có chiều dài

790 bp sẽ khuếch đại đoạn từ giữa đoạn tRNA-Thr, tRNA-Pro, tRNA-Phe và một phần đoạn D-Loop [24] Tỷ lệ đột biến ở các phần khác nhau của hệ gen ty thể là khác nhau và đoạn gen được sử dụng có mức độ biến đổi khá cao giữa các loài

trong giống Crocodylus [35] Do đó tôi lựa chọn đoạn gen này để xác định dòng mẹ

của các mẫu phân tích Bên cạnh đó chúng tôi cũng xác định quan hệ di truyền của các mẫu phân tích bằng cách xây dựng cây quan hệ di truyền và phân tích khoảng

cách di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp Bayesian

Phương pháp xây dựng cây quan hệ di truyền

Bayesian là phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh sử dụng Markov Chain Monte Carlo (MCMC) có kết hợp của mô hình tiến hóa và dữ liệu đưa vào,

từ đấy tính toán ra giá trị xác suất hậu nghiệm (posterior probability - PP) của cây Xác suất hậu nghiệm là xác suất có điều kiện mà cây nhận được khi đưa các mô hình vào, cơ sở dữ liệu Phương pháp Bayesian với MCMC đã được được chấp nhận và sử dụng rộng rãi như là một phươg pháp tin cậy trong xây dựng cây phát sinh chủng loại [31]

Trang 25

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Các cá thể cá sấu Xiêm của một số khu vực nuôi

nhốt tại Lào, Việt Nam;

Địa điểm nghiên cứu: Vườn quốc gia Cát Tiên, vườn thú Thủ Lệ, Sài Gòn,

vườn thú Lào (Viêng Chăn), bản Sóc (Lào)

Sơ lược về Vườn quốc gia Cát Tiên

Vườn Quốc gia Cát Tiên nằm trên địa bàn của 3 tỉnh Đồng Nai, Lâm Đồng

và Bình Phước, cách thành phố Hồ Chí Minh khoảng 150 km theo quốc lộ 20 về hướng Đà Lạt

Tọa độ địa lý:11o20’50’’ – 11o50’20” độ vĩ Bắc

107o09’05” – 107o35’20” độ kinh Đông Diện tích tự nhiên của Vườn Quốc gia Cát Tiên là 71.350ha, trong đó khu vực Nam Cát Tiên (tỉnh Đồng Nai) là 39.627 ha; khu vực Cát Lộc (tỉnh Lâm Đồng)

là 27.530 ha; khu vực Tây Cát Tiên (tỉnh Bình Phước) là 4.193ha

Đây là một trong 200 vùng sinh thái quan trọng của Việt Nam (WWF 2001)

và nằm trong vùng chim đặc hữu đất thấp Miền Nam Việt Nam (Birdlife 2001) Ngày 10/11/2001, Vườn Quốc gia Cát Tiên được tổ chức UNESCO quốc tế công nhận l Khu Dự trữ sinh quyển thứ 411 của quốc tế và là Khu Dự trữ sinh quyển thứ

2 của Việt Nam Ngày 04/08/2005 Ban Thư ký Công ước Ramsar đã công nhận khu

hệ đất ngập nước Bàu Sấu vào danh sách các vùng đất ngập nước quan trọng thứ 1.499 của quốc tế

Vườn nằm giữa 2 vùng sinh học địa lý chuyển tiếp từ vùng cao nguyên Trường Sơn xuống vùng đồng bằng Nam bộ, do vậy hội tụ được các luồng hệ thực vật, hệ động vật phong phú, đa dạng, đặc trưng cho hệ sinh thái rừng ẩm nhiệt đới thường xanh của các tỉnh miền đông Nam bộ, Việt Nam

Hệ thực vật: VQG Cát Tiên đã xác định được 1.610 loài, 75 bộ, 162 họ, 724 chi Trong đó: Cây gỗ lớn: 176 loài; Cây gỗ nhỏ: 335 loài; Cây tiểu mộc (bụi): 345

Trang 26

loài; Thảm tươi: 311 loài; Dây leo: 238 loài; Thực vật phụ sinh, kí sinh: 143 loài; Khuyết thực vật: 62 loài [3]

Hệ động vật: Khu hệ động vật VQG Cát Tiên có những nét đặc trưng của khu hệ động vật vùng bình nguyên Đông Trường Sơn và có quan hệ chặt chẽ với Tây Nguyên Thú: 113 loài thuộc 32 họ,12 bộ; Chim: 348 loài thuộc 64 họ, 18 bộ;

Bò sát: 79 loài thuộc 17 họ và 4 phân họ, 4 bộ; Lưỡng cư: 41 loài thuộc 6 họ, 2 bộ;

Cá trên 168 loài thuộc 29 họ, 9 bộ; Côn trùng: đã điều tra được 819 loài thuộc 58

họ, 10 bộ [3]

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích các chỉ thị phân tử thu được từ 85 (Bảng 1) mẫu bao gồm:

 64 mẫu mô cơ đuôi cá sấu Xiêm: 12 mẫu tại vườn thú Thủ Lệ (Hà Nội), 28 mẫu từ vườn thú Sài Gòn, 1 mẫu tại trạm cứu hộ Hòn Me (Kiên Giang), 2 mẫu tại vườn thú Tây Ban Nha và 21 mẫu tại vườn thú Lào (Viêng chăn) (trong đó có 4 mẫu nghi ngờ là thuần chủng)

 3 mẫu phân cá sấu tại bản Sóc Khammoune, Lào

 4 mẫu mô cơ đuôi cá sấu Xiêm thuần chủng tại vườn quốc gia Cát Tiên

 4 mẫu máu cá sấu Xiêm thuần chủng tại các vườn thú Châu Âu

 5 mẫu mô cơ đuôi cá sấu Cuba (C rhombifer) bao gồm: 1 mẫu từ vườn thú

Zagreb (Croatia), 1 mẫu từ vườn thú Terrariet Vissenbjerg (Đan Mạch), và 3 mẫu từ vườn thú Hoyerswerda Zoo (Đức)

 5 mẫu máu cá sấu nước mặn (C porosus) tại vườn thú Wilhelma Zoo (Đức)

Các mẫu vật trong các khu vực nuôi nhốt được thu bởi nhóm nghiên cứu của Thomas Zigler và Lưu Quang Vinh từ năm 2016 - 2018 Điều tra thực địa tại VQG Cát Tiên được tiến hành để thu mẫu thuần chủng làm đối chứng và khảo sát sơ bộ

về hiện trạng và các mối đe doạ đến loài (chi tiết được trình bày ở phần sau)

Trang 27

Bảng 1 Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu

1 C cf siamensis Cr1 mô đuôi Kiên Giang: Hòn Me

2 C cf siamensis Cr7 Bs1 phân Tỉnh Khammouane, Lào

5 C cf siamensis Cr10 Saigon 1 mô đuôi Vườn thú Sài Gòn

33 C cf siamensis Cr38 Hanoi 41 mô đuôi Vườn thú Thủ Lệ

Trang 28

45 C cf siamensis Cr52 Lao Zoo 5 mô đuôi Vườn thú Lào, Viêng Chăn

60 C cf siamensis Cr67 Lao Zoo CS20 mô đuôi Vườn thú Lào, Viêng Chăn

66 C siamensis Cr95 S1 máu Vườn thú Plzen, Séc

69 C siamensis Cr98 COS002 máu Vườn thú Benidorm, Tây Ban Nha

70 C cf siamensis Cr100 COS003 máu Vườn thú Benidorm, Tây Ban Nha

71 C siamensis Cr77 CT.2018.1 mô đuôi Vườn quốc gia Cát Tiên

75 C cf siamensis Cr99 COS004 máu Vườn thú Benidorm, Tây Ban Nha

Trang 29

77 C porosus Cp2 máu Vườn thú Wilhelma, Đức

81 C rhombifer Crb1 mô đuôi Vườn thúZagreb, Croatia

82 C rhombifer Crb2 mô đuôi Terrariet Vissenbjerg, Đan Mạch

83 C rhombifer Crb3 mô đuôi Vườn thú Hoyerswerda, Đức

Hoá chất và thiết bị sử dụng

- Các hoá chất, bộ Kit được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Tách chiết ADN: Kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, Đức), GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher), Ethanol (Merck, Đức)

- PCR: Dream Taq Master Mix (Thermo Fisher), các mồi đánh dấu huỳnh quang (FAM, HEX) và mồi không đánh dấu (Bảng 2)

- Điện di: Đệm TBE 10X với công thức pha 250ml: 27g Tris Base Sigma, 13,75g Boric Acid Merck và 1,875g EDTA Merck

- Ethidium bromide của Invitrogen, gel agarose (Invitrogen), marker 100bp, 1kb (Thermo Fisher)

- Tinh sạch sản phẩm PCR: Kit GeneJET PCR Purification (Thermo Fisher)

- Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu có tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội bao gồm: bể ổn nhiệt, máy li tâm Hettich Mikro 22R, Máy PCR SimpliAmp™ Thermal Cycler, máy soi gel, bể điện di Bio-RAD, pipet

các loại

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Để hoàn thành các mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi sử dụng hai phương pháp nghiên cứu chính:

-Thu mẫu và khảo sát hiện trạng bảo tồn tại VQG Cát Tiên

Trang 30

-Phân tích sử dụng hai chỉ thị sinh học phân tử microsatellite và đoạn gen ty thể bao gồm 4 bước:

• Tách chiết ADN tổng số

• Khuếch đại các phân đoạn gen quan tâm

• Tinh sạch, giải trình tự đoạn gen ty thể, xác định kiểu gen các locus microsatellite

• Phân tích quan hệ di truyền, xác định dòng mẹ và độ thuần chủng dựa trên các dữ liệu thu được bằng phần mềm tin sinh

2.3.1 Thu mẫu, khảo sát ngoài thực địa

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện khảo sát, lấy mẫu tại Bào Sấu (VQG Cát Tiên) Chúng tôi cũng tiến hành phỏng vấn các bên liên quan

Thời gian: chuyến khảo sát được thực hiện từ ngày 13/5/2018 đến ngày

20/5/2018 tại VQG Cát Tiên

Lựa chọn khu vực nghiên cứu

Trước khi tiến hành khảo sát thực địa và phỏng vấn, tôi đã phỏng vấn các cán

bộ VQG Cát Tiên để xác nhận khu vực dễ bắt gặp và thu mẫu cá sấu Xiêm, nhóm người dân có nhiều thông tin về VQG Cát Tiên, những cán bộ kiểm lâm nắm rõ về hiện trạng bảo tồn của loài cá sấu Xiêm

Tại Bàu Sấu, chúng tôi tiến hành khảo sát, thu thập mẫu vật trên mặt nước, quanh các trảng cỏ nổi và quanh bờ

Thu thập mẫu vật

-Thu các mẫu phân bằng thìa nhỏ và bảo quản trong cồn Merck 70% Chú ý chỉ thu các mẫu phân mới bởi các mẫu phân khô và cũ rất khó phân tích (Hình 3, Phụ lục)

-Thu mẫu mô: bắt cá sấu non vào ban đêm khi các đàn cá sấu nổi trên mặt nước Các mẫu được chụp ảnh, cân và đo một số thông số cơ bản, thu mẫu vảy đuôi sau đó thả về đúng với vị trí đàn của mình Các mẫu mô cơ đuôi được bảo quản trong cồn Merck 70% (Hình 3, Phụ lục)

Chúng tôi cũng đi khảo sát trên bờ quanh khu vực Bàu Sấu nhỏ Tại đây chúng tôi có phát hiện ra một vài mẫu phân có khả năng là phân cá sấu Tuy nhiên

Trang 31

các mẫu này đã khô sẽ khó khăn cho phân tích nên chúng tôi không tiến hành thu mẫu

Phỏng vấn các bên liên quan

Chúng tôi tiến hành phỏng vấn những người dân đã từng vào rừng tại xã Đăk Lua và những cán bộ kiểm lâm tại hai trạm Bàu Sấu và Đăk Lua Người dân xã Đăk Lua là đối tượng cần tập trung phỏng vấn bởi xã này có tỷ lệ người dân vào rừng và vào các khu ngập nước vẫn còn cao Xã Đăk Lua là xã giáp ranh với VQG Cát Tiên

Trạm Bàu Sấu được chọn vì đây là địa điểm thu mẫu, khảo sát Đây là nơi có khả năng cao phát hiện cá sấu Xiêm và các cán bộ kiểm lâm tại đây có nhiều kiến thức về loài Các cán bộ kiểm lâm tại trạm Đăk Lua được lựa chọn bởi vì vị trí trạm tại cửa ngõ của con đường xuyên qua VQG từ đó có thể dễ dàng tiếp cận các khu vực trọng yếu trong vườn mà cụ thể là Bàu Sấu Thêm vào đó cán bộ kiểm lâm tại trạm có công tác dân vận và nắm bắt khá tốt tình hình tại địa phương

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự và xác định kiểu gen

Tách chiết ADN

Các mẫu được tách chiết ADN tổng số sử dụng 2 bộ kit: Kit Dneasy Blood and Tissue (Quiagen, Đức) và GeneJET Genomic DNA Purification Kit tùy thuộc vào loại mẫu Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất,

có chỉnh lý

Quy trình cụ thể như sau:

- QIAamp DNA Stool Mini Kit (Quiagen):

Bộ Kit này được sử dụng để tách chiết các mẫu phân với một vài thay đổi so với quy trình của nhà sản xuất cụ thể như sau:

Kiểm tra ASL, AL, và AE trước khi tách chiết, tránh bị vón cục Nếu hoá chất bị vón cục thì ủ trong bể ổn nhiệt ở 70oC Máy ly tâm cần được cài đặt ở nhiệt

độ phòng

Bước 1: Tiền xử lý mẫu

Trộn đều thật mạnh mẫu khoảng 5 phút, loại bỏ các sợi hay cục to, cho vào một ống eppendorf mới

Tiêu đề	Xác định mức độ thuần chủng của cá thể loài cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn
Tác giả	Nguyễn Thị Thắm
Người hướng dẫn	PGS. TS. Lê Đức Minh, PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Sinh thái môi trường
Thể loại	Luận văn thạc sĩ khoa học
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	2,93 MB