Xác Định Hàm Lượng Melamine Trong Thức Ăn Thủy Sản Bằng Phương Pháp Miễn Dịch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐƯỜNG TÀI THẮNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRONG THỨC ĂN THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐƯỜNG TÀI THẮNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRONG THỨC ĂN THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s PHẠM VĂN HÙNG 2010 TÓM TẮT Đề tài “Xác định hàm lượng melamine thức ăn thủy sản phương pháp miễn dịch” tiến hành nghiên cứu nhằm đưa phương pháp miễn dịch phổ biến rộng rãi cho phịng kiểm nghiệm áp dụng hay cơng ty, xí nghiệp nhằm ngăn chặn gian dối thương mại việc phân tích xác định hàm lượng melamine thức ăn thủy sản Mục tiêu đề tài là: xác định giá trị sử dụng phương pháp thông qua việc xác định độ nhạy, độ thu hồi, độ lặp lại phương pháp mẫu thức ăn thủy sản áp dụng phương pháp để phân tích melamine thức ăn thủy sản từ sở thức ăn thủy sản Nội dung đề tài xác định độ nhạy, độ thu hồi, độ lặp lại phương pháp miễn dịch áp dụng phương pháp phân tích 32 mẫu thức ăn thủy sản từ công ty thức ăn thủy sản Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp hấp thu miễn dịch dùng enzyme liên kết (ELISA) có độ nhạy cao với giá trị LOD = 0,395 mg/kg nhỏ gấp lần so với giới hạn tối đa cho phép melamine thức ăn thủy sản, độ thu hồi trung bình nồng độ mg/kg 102,31%; nồng độ mg/kg 99,44%; nồng độ mg/kg 98,41% độ thu hồi khoảng từ mg/kg đến mg/kg 80-119,9%, độ lặp lại phương pháp 100% Từ thông số thực nghiệm, phương pháp áp dụng để phân tích 32 mẫu thức ăn thủy sản lấy từ sở thức ăn thủy sản, phát 7/32 mẫu có hàm lượng melamine từ 0,414 đến 0,571 mg/kg áp dụng mức giới hạn tối đa cho phép 32 mẫu không phát Với kết nghiên cứu thu được, đề nghị việc áp dụng phương pháp phân tích melamine kĩ thuật Elisa hồn tồn phù hợp nhằm góp phần ngăn chặn thức ăn có lạm dụng melamine sử dụng làm nguồn thức ăn thủy sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi ảnh hưởng đến suất nuôi thủy sản gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe người Do thời gian có hạn nên đề tài dừng lại việc phân tích melamine thức ăn thủy sản mà khơng phân tích hàm lượng melamine nhiều mẫu khác nên nghiên cứu cần dùng phương pháp miễn dịch để phân tích melamine nhiều mẫu khác (cá, thịt…) i LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành tốt luận văn có kết ngày hơm Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Thủy Sản, q thầy Bộ mơn Dinh Dưỡng Chế Biến Thủy Sản tạo điều kiện giúp em hồn thành tốt luận văn q thầy cô trường Đại học Cần Thơ trang bị cho em kiến thức vô quý giá suốt q trình học tập trường Em vơ cảm động xin gửi lòng biết ơn sâu sắc nhất, chân thành đến thầy Phạm Văn Hùng phó giám đốc Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng (NAFIQAD 6) tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn cách tốt Thầy truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm kiến thức quí báu từ thực tiễn, giúp em vững bước tự tin bước đường phía trước Bên cạnh đó, em chân thành cảm ơn chị Liên, anh Hồ, anh Sơn anh chị khác phòng kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nơng Lâm Thủy Sản vùng tận tình giúp đỡ em suốt trình thực tập quan Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân động viên, giúp đỡ em suốt thời gian thực luận văn Cần Thơ, ngày 14 tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực Đường Tài Thắng ii MỤC LỤC Trang TÓM TẮT i LỜI CẢM TẠ ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu .1 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài .1 1.4 Thời gian thực Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược melamine 2.1.1 Melamine 2.1.2 Các chất tương tự Melamine 2.1.3 Ứng dụng .4 2.1.4 Nghiên cứu giới melamine cyanuric acid thủy sản 2.1.5 Ảnh hưởng melamine cyanuric acid 2.2 Phương pháp phân tích melamine 2.2.1 Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng m liên kết (ELISA) 2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS) 2.3 Giới thiệu chung quy trình vận hành hệ thống máy Elisa/Biorad 2.3.1 Quy trình sử dụng tủ ủ .8 2.3.2 Quy trình sử dụng máy rửa 2.3.3 Quy trình sử dụng máy đọc 2.4 Các thông số kỹ thuật chế phẩm phân tích ELISA 2.4.1 Các thơng số kỹ thuật ghi sẵn bảng hướng dẫn sử dụng chế phẩm phân tích iii 2.4.2 Các tiêu đánh giá chất lượng khác (không ghi kèm chế phẩm phân tích) 10 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Địa điểm thực đề tài 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu .11 3.2.1 Mẫu thí nghiệm .11 3.2.2 Thiết bị dụng cụ sử dụng 11 3.2.3 Hóa chất sử dụng 12 3.2.4 Các thành phần chế phẩm 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu 12 3.3.1 Các thông số cần xác định triển khai phương pháp .12 3.3.2 Qui trình phân tích melamine Elisa 13 3.3.3 Cách thức tiến hành .14 3.3.4 Bố trí thí nghiệm 15 3.3.5 Phương pháp thu thập, tính tốn xử lý số liệu 16 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Xây dựng đường chuẩn .19 4.1.1 Mục đích .19 4.1.2 Cách tiến hành .19 4.1.3 Kết 19 4.1.4 Kết luận 20 4.2 Xác định giá trị mẫu giới hạn phát .20 4.2.1 Mục đích .20 4.2.2 Cách tiến hành .20 4.2.3 Kết 21 4.2.4 Kết luận 22 4.3 Xác định độ thu hồi 22 4.3.1 Mục đích .22 4.3.2 Cách tiến hành .22 4.3.3 Kết 22 4.3.4 Kết luận 26 4.4 Xác định độ lặp lại 27 4.4.1 Mục đích .27 iv 4.4.2 Cách tiến hành .27 4.4.3 Kết 27 4.4.4 Kết luận 31 4.5 Áp dụng phương pháp miến dịch phân tích mẫu thức ăn thủy sản lấy từ sở thức ăn thủy sản 31 4.5.1 Mục đích .31 4.5.2 Cách tiến hành .31 4.5.3 Kết 32 4.5.4 Kết luận 33 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề xuất .34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 36 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Tính đặc hiệu chế phẩm thử sử dụng 10 Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm triển khai phương pháp .15 Bảng 4.1: Kết phân tích giá trị độ hấp thu 19 Bảng 4.2: Kết phân tích mẫu trắng 21 Bảng 4.3: Giá trị độ thu hồi nồng độ thêm vào mẫu trắng đợt phân tích thứ 23 Bảng 4.4: Giá trị độ thu hồi nồng độ thêm vào mẫu trắng đợt phân tích thứ hai .24 Bảng 4.5: Giá trị độ thu hồi nồng độ thêm vào mẫu trắng đợt phân tích thứ ba 25 Bảng 4.6: Giá trị độ thu hồi đợt phân tích .26 Bảng 4.7: Giá trị số lạc đợt phân tích thêm mg/kg chuẩn melamine vào mẫu trắng 28 Bảng 4.8: Giá trị số lạc đợt phân tích thêm mg/kg chuẩn melamine vào mẫu trắng 29 Bảng 4.9: Giá trị số lạc đợt phân tích thêm mg/kg chuẩn melamine vào mẫu trắng 30 Bảng 4.10: Kết phân tích 32 mẫu thức ăn thủy sản ngày thực nghiệm 32 vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc phân tử melamine .3 Hình 2.2: Cấu trúc phân tử cyanuric acid Hình 2.3: Cấu trúc phân tử ammelide .4 Hình 2.4: Cấu trúc phân tử ammeline .4 Hình 2.5: Tủ ủ có phận làm mát Hình 2.6: Máy rửa Hình 2.7: Máy đọc Elisa Hình 3.1: Bộ chế phẩm Elisa ………… 12 Hình 3.2: Khay phân tích 96 giếng 12 Hình 4.1: Đồ thị đường chuẩn 20 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ melamine thêm vào nồng độ melamine phân tích 31 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Những chữ viết tắt sau sử dụng đề tài luận văn: ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phương pháp hấp thu miễn dịch dùng enzyme liên kết) HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) LC/MS/MS Liquid chromatography - Mass spectrometry Mass spectrometry (Sắc kí lỏng hai lần khối phổ) GC/MS Gas chromatography mass spectrometry (Sắc kí khí khối phổ) LD50 Medium Letalisdosis (liều lượng gây chết trung bình) FDA Food And Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) AOZ 3-amino-2-oxazolidinon AMOZ 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon SMT Sulfamethazine SDM Sulfadimethoxine PE Poly ethylen ppm Part per million (Phần triệu) ppb Part per billion (Phần tỷ) viii Tổng hợp kết từ Bảng 4.3 đến Bảng 4.5 vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ melamine thêm vào nồng độ phân tích Nồng độ melamine phân tích (ppm) 4,000 3,000 2,000 y = 937.57x + 116.76 R2 = 0.9711 1,000 0 Nồng độ melamine thêm vào (ppm) Hình 4.2 : Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ melamine thêm vào nồng độ melamine phân tích 4.4.4 Kết luận Phương pháp có độ lặp lại 100% 4.5 Áp dụng phương pháp miến dịch phân tích mẫu thức ăn thủy sản lấy từ sở thức ăn thủy sản 4.5.1 Mục đích Áp dụng qui trình xác định độ nhạy, độ thu hồi, độ lặp lại nhằm phân tích melamine có thức ăn thủy sản 4.5.2 Cách tiến hành Phân tích 32 mẫu thức ăn thủy sản lấy từ sở thức ăn thủy sản dựa kết công bố độ nhạy (LOD = 0,395 mg/kg) nhằm xác định diện melamine có thức ăn thủy sản Các mẫu thức ăn lấy từ sở để phân tích ngày thực nghiệm khơng thiết phải lấy lấy mẫu thức ăn có thay đổi mẫu lấy mẫu sở 31 4.5.3 Kết Bảng 4.10: Kết phân tích 32 mẫu thức ăn thủy sản ngày thực nghiệm Ngày Số mẫu phân tích 12 Kết phân tích (mg/kg) 0,100 0,137 0,156 0,138 0,154 0,213 0,334 0,282 0,124 0,134 0,331 0,472 0,292 0,250 0,571 0,464 0,414 0,479 0,193 0,179 0,256 0,165 0,173 0,341 0,502 0,477 0,149 0,089 0,152 0,125 0,153 0,043 Kết luận Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Phát Không phát Không phát Phát Phát Phát Phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Phát Phát Không phát Không phát Không phát Không phát Không phát Khơng phát Ghi chú: Kết phân tích nhỏ LOD=0,395 mg/kg: khơng phát Kết phân tích lớn LOD=0,395 mg/kg: phát Kết thu từ Bảng 4.10 cho thấy: - Ngày thực nghiệm thứ với số mẫu phân tích mẫu, kết thu tất mẫu phân tích không phát - Ngày thực nghiệm thứ hai với số mẫu phân tích 12 mẫu có mẫu phát mẫu không phát 32 - Ngày thực nghiệm thứ ba với số mẫu phân tích mẫu có mẫu phát mẫu không phát - Ngày thực nghiệm thứ tư với số mẫu phân tích mẫu tất mẫu khơng phát Hàm lượng melamine có nồng độ thấp từ 0,414 đến 0,571 mg/kg thấp giới hạn tối đa cho phép 2,5 mg/kg theo Quyết định 3762 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Với hàm lượng thấp chứng tỏ mẫu thức ăn lấy từ sở khơng có lạm dụng melamine, mà hàm lượng melamine phát nhiễm vào từ bao bì nhựa hay bề mặt tiếp xúc có thành phần nhựa q trình chế biến 4.5.4 Kết luận Từ thực nghiệm phân tích hàm lượng melamine 32 mẫu thức ăn thủy sản đề tài thu kết có 25 mẫu khơng phát có mẫu phát có hàm lượng melamine khơng có mẫu có hàm lượng melamine vượt giới hạn tối đa cho phép 33 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu đến số kết luận sau đây: 5.1.1 Nền mẫu thức ăn thủy sản phương pháp Elisa thực nghiệm 0,137 mg/kg 5.1.2 Giới hạn phát (LOD) phương pháp 0,395 mg/kg nhỏ gấp lần giới hạn tối đa cho phép melamine thức ăn thủy sản 5.1.3 Độ lệch chuẩn Sr 0,086 mg/kg 5.1.4 Độ thu hồi (R%) trung bình nồng độ mg/kg 102,31%; nồng độ mg/kg 99,44%; nồng độ mg/kg 98,41% độ thu hồi khoảng mg/kg đến mg/kg 80-119,9% 5.1.5 Độ lặp lại 100% 5.1.6 Mối tương quan nồng độ chuẩn melamine thêm vào phân tích biểu diễn qua phương trình y = 937,57x + 116,76 với độ tuyến tính R2=0,9711 5.1.7 Phát 7/32 mẫu có hàm lượng melamine từ 0,414 đến 0,571 mg/kg áp dụng mức giới hạn tối đa cho phép 32 mẫu khơng phát Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp miễn dịch có độ nhạy cao, độ xác cao ổn định Vì vậy, việc ứng dụng phương pháp để phân tích melamine thức ăn thủy sản thích hợp 5.2 Đề xuất Với kết nghiên cứu thu được, đề nghị việc áp dụng phương pháp phân tích melamine kĩ thuật Elisa hồn tồn phù hợp nhằm góp phần ngăn chặn thức ăn có lạm dụng melamine sử dụng làm nguồn thức ăn thủy sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi ảnh hưởng đến suất nuôi thủy sản gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe người Do thời gian có hạn nên đề tài dừng lại việc phân tích melamine thức ăn thủy sản mà khơng phân tích hàm lượng melamine nhiều mẫu khác nên nghiên cứu cần dùng phương pháp miễn dịch để phân tích melamine nhiều mẫu khác (cá, thịt…) 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Văn Hùng, Melamine, 2008, Tham luận Đại hội nghị kiểm soát thức ăn thủy sản, 2008, Cần Thơ Trần Minh Phú, Vương Thanh Tùng, Lê Bảo Ngọc – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ Bài giảng Phân Tích Thực Phẩm Thủy Sản Trần Phương Ngọc Hân, 2008 Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản phòng kiểm nghiệm NAFIQAD 6- Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp chuyên nghành Chế biến thủy sản, trường Đại học Cần Thơ http://www.bme.vn/bmevn/bme/lien-nganh/ly-hoa/88 9/12/2009) (truy cập ngày http://niengiamnongnghiep.vn/index.php?self=article&id=5477 (truy cập ngày 10/12/2009) http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/ELISA (truy cập ngày 12/12/2009) Một số tài liệu Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản Vùng cung cấp 35 PHỤ LỤC Phụ lục A: Ảnh chụp trình thực nghiệm phịng kiểm nghiệm NAFIQAD Hình 1: Hỗn hợp tách thành lớp sau ly tâm Hình 2: Vi giếng có màu xanh thêm dung dịch chất Hình 3: Vi giếng chuyển từ màu xanh sang vàng thêm dung dịch kết thúc phản ứng Hình 4: Vi giếng hồn tồn chuyển sang màu vàng thêm xong dung dịch kết thúc phản ứng 36 Phụ lục B: Bảng giá trị số lạc định Bảng 1: Bảng giá trị số lạc định 37 Phụ lục C: Kết phân tích melamine thức ăn thủy sản lấy từ sở thức ăn thủy sản ngày thực nghiệm Blank Spike ppm 38 39 Blank Spike ppm 40 41 Blank Spike ppm 42 43 Spike ppm Blank 44 45 ... lại phương pháp mẫu thức ăn thủy sản áp dụng phương pháp để phân tích melamine thức ăn thủy sản từ sở thức ăn thủy sản Nội dung đề tài xác định độ nhạy, độ thu hồi, độ lặp lại phương pháp miễn dịch. .. KHOA THỦY SẢN ĐƯỜNG TÀI THẮNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRONG THỨC ĂN THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s PHẠM VĂN HÙNG... vậy, đề tài ? ?Xác định hàm lượng melamine thức ăn thủy sản phương pháp miễn dịch? ?? tiến hành nghiên cứu 1.2 Mục tiêu đề tài Xác định giá trị sử dụng phương pháp thông qua việc xác định độ nhạy,