Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn luận án TS vi sinh vật học62 42 40 01

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM BÍCH HIÊN NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI DẠNG RẮN Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62.42.40.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2012 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Văn Toản GS.TS Nguyễn Đình Quyến Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Thành Đạt Phản biện 2: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh Phản biện 3: PGS.TS Ngô Tự Thành Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi 00 ngày 26 tháng năm 2012 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin – Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ Danh mục sơ đồ Mục lục MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHẤT THẢI CHĂN NUÔI VÀ BIỆN PHÁP XỬ LÝ 1.1.1 Chất thải chăn nuôi nguy ô nhiễm môi trƣờng 1.1.2 Tình hình sử dụng chất thải chăn nuôi Việt Nam 1.1.3 Các biện pháp xử lý chất thải chăn nuôi 10 1.1.3.1 Phƣơng pháp vật lý phân tách chất rắn - lỏng 10 1.1.3.2 Các phƣơng pháp hoá học 10 1.1.3.3 Các phƣơng pháp sinh học 11 1.2 VI SINH VẬT THAM GIA QUÁ TRÌNH XỬ LÝ CHẤT THẢI HỮU CƠ 17 1.2.1 Vi sinh vật phân giải xenluloza 17 1.2.1.1 Xenluloza 17 1.2.1.2 Enzym xenlulaza 18 1.2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp xenlulaza 20 1.2.2 Vi sinh vật thủy phân tinh bột 22 1.2.2.1 Cấu trúc tinh bột 22 1.2.2.2 Enzym thuỷ phân tinh bột 24 1.2.2.3 Vi sinh vật tổng hợp enzim thuỷ phân tinh bột 26 1.2.3 Vi sinh vật phân giải protein 27 1.2.3.1 Enzym proteaza 27 1.2.3.2 Vi sinh vật tổng hợp enzim phân giải protein 29 1.2.4 Vi khuẩn tổng hợp axit lactic bacterioxin 31 1.2.4.1 Bacterioxin 32 1.2.4.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic 37 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 41 2.1 VẬT LIỆU 41 2.1.1 Các mẫu thu thập chủng vi sinh vật 41 2.1.1.1 Mẫu thu thập 41 2.1.1.2 Vi sinh vật 41 2.1.2 Hóa chất 41 2.1.3 Các dung dịch môi trƣờng 42 2.1.3.1 Các dung dịch 42 2.1.3.2 Môi trƣờng 43 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 44 2.2 PHƢƠNG PHÁP 44 2.2.1 Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật 44 2.2.1.1 Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống 44 2.2.1.2 Phân loại kỹ thuật sinh học phân tử 45 2.2.2 Xác định hoạt tính sinh học vi sinh vật 49 2.2.2.1 Xác định hoạt tính xenlulaza, amylaza, proteaza 49 2.2.2.2 Nghiên cứu đặc tính proteaza 50 2.2.2.3 Định lƣợng đƣờng khử theo Micro-Bertrand 50 2.2.2.4 Xác định khả tổng hợp axit lactic 51 2.2.2.5 Định lƣợng axit lactic theo Therner 51 2.2.2.6 Xác định khả kháng khuẩn môi trƣờng thạch đĩa 52 2.2.2.7 Xác định khả kháng khuẩn môi trƣờng dịch thể 52 2.2.2.8 Phát bacterioxin 2.2.2.9 Điện di protein gel tricine- SDS- PAGE 2.2.2.10 Xác định khả kháng khuẩn trực tiếp gel acrylamit 52 53 53 2.2.3 Xác định trạng chất thải chăn nuôi 54 2.2.3.1 Điều tra thực trạng chất thải chăn nuôi 54 2.2.3.2 Xác định khí thải H2S NH3 54 2.2.3.3 Xác định mật độ vi sinh vật gây bệnh, ký sinh trùng 54 2.2.3.4 Xác định hàm lƣợng nguyên tố khoáng 55 2.2.4 Thử nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm 55 2.2.4.1 Thử nghiệm sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn 55 2.2.4.2 Đánh giá độ chín độ an tồn phân ủ 55 2.2.4.3 Thí nghiệm đồng ruộng đánh giá hiệu phân bón hữu 56 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 THỰC TRẠNG CHẤT THẢI TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ CHĂN NUÔI 58 3.1.1 Tình hình quản lý, sử dụng chất thải chăn nuôi 58 3.1.2 Thực trạng môi trƣờng số sở chăn ni 59 3.1.1.1 Ơ nhiễm khí thải độc hại 59 3.1.1.2 Ơ nhiễm vi sinh vật gây bệnh ký sinh trùng 61 3.2 NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI 61 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật 61 3.2.1.1 Vi sinh vật phân giải xenluloza, tinh bột, protein 3.2.1.2 Vi khuẩn lactic 3.2.2 Định tên xác định độ an toàn sinh học chủng 62 64 nghiên cứu 67 3.2.2.1 Định tên vi sinh vật phƣơng pháp truyền thống 68 3.2.2.2 Định tên vi sinh vật kỹ thuật sinh học phân tử 73 3.2.2.3 Độ an toàn sinh học chủng vi sinh vật nghiên cứu .77 3.2.3 Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả phân giải chất hữu chủng vi sinh vật nghiên cứu 79 3.2.3.1 Ảnh hƣởng đến khả phân giải xenluloza chủng XK112 79 3.2.3.2 Ảnh hƣởng đến khả phân giải tinh bột chủng B20 82 3.2.3.3 Ảnh hƣởng đến khả phân giải protein chủng B15 87 3.2.4 Hoạt tính đối kháng chủng LH19 91 3.2.4.1 Khả đối kháng vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn gây thối rữa 90 3.2.4.2 Khả sinh tổng hợp bacterioxin vi khuẩn lactic LH19 93 3.2.4.3 Một số yếu tố mơi trƣờng ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng khuẩn chủng LH19 98 3.3 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI 102 3.3.1 Điều kiện nhân sinh khối vi sinh vật 102 3.3.1.1 Thời gian nuôi cấy 102 3.3.1.2 Tỷ lệ giống cấy 103 3.3.1.3 Điều kiện cấp khí 104 3.3.1.4 Mơi trƣờng nhân sinh khối 105 3.3.2 Quy trình sản xuất chế phẩm 106 3.3.3 Chất lƣợng chế phẩm 108 3.4 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI 110 3.4.1 Hiệu xử lý chất thải chăn nuôi 110 3.4.1.1 Động thái nhiệt độ đống ủ 111 3.4.1.2 Hiệu chuyển hóa thành phần dinh dƣỡng 113 3.4.1.3 Hiệu xử lý vi sinh vật gây bệnh ký sinh trùng 115 3.4.1.4 Hiệu xử lý mùi khí phát thải 116 3.4.2 Khả sử dụng chất thải chăn nuôi sau xử lý làm phân bón .118 3.5 HIỆU QUẢ SƢ DỤNG PHÂN HỮU CƠ TỪ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI ĐỐI VỚI CÂY TRỒNG 121 3.5.1 Hiệu phân hữu rau cải 121 3.5.2 Hiệu phân hữu dƣa chuột 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 129 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MUCC̣ CÁC KÝHIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate Bp Base pair (cặp bazơ) CFU Colony forming unit (V) CMC Cacboxymethyl xenluloza CV Coefficient of variation (Sai số thí nghiệm) ADN Axit deoxyribonucleic DNS 3,5 axit dinitrosalicylic dNTP 2’- deoxyribonucleocide - 5’triphosphate DTT 1,4-Dithiothreitol EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EM Effective microorganisms (V) EtBr Ethidium bromide Kb Kilobase KST Ký sinh trùng kDa Kilodalton LAB Lactic acid bacteria (V) LB Luria – Betani LSD Least Significant Difference (Sai khác cơng thức có ý nghĩa) OC Organic cacbon (Các bon hữu cơ) OD Optical density (Mật độ quang) OM Organic matter (Chất hữu cơ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) ARN Axit ribonucleic SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 10 TAE TBE TCN Tris- Acetate- EDTA TCVN Tris- Borate- EDTA TE Tiêu chuẩn ngành TEMED Tiêu chuẩn Việt Nam TFA Tris - EDTA v/v N, N, N’,N’- tetramethyl ethylendiamine w/v Trifluoroacetic acid Volume/volume ( Thể tích/ thể tích) Weight/volume (Khơi lƣợng/thể tích) 11 DANH MỤC CÁC BẢ Bảng Tên bảng 1.1 Thành phần hoá học số loại phân 1.2 Phân loại bacterioxin vi khuẩn gram ( 1.3 Một số bacterioxin thuộc phân lớp IIa 3.1 Mơi trƣờng khơng khí trang trại ch 3.2 Mật độ vi sinh vật gây bệnh ký sinh trù nuôi 3.3 Số lƣợng chủng vi sinh vật phân lập 3.4 Khả phân giải chất hữu ch 3.5 Kết phân lập vi khuẩn lactic 3.6 Hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn 3.7 Hoạt tính sinh học chủng vi sinh v 3.8 Đặc điểm sinh hóa chủng vi sinh v 3.9 Mức độ an toàn chủng vi sinh vật 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng xenluloza chủng XK112 3.11 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng khả nă chủng XK112 Ảnh hƣởng ion Ca 3.12 2+ đến độ bền nhiệt tổng hợp 3.13 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt tính 3.14 Khả đối kháng vi khuẩn gây bệnh ch chủng LH19 3.15 Khả đối kháng E carotovora KT03 c 3.16 Phổ kháng khuẩn chủng LH19 3.17 Phản ứng dịch chứa chất kháng khuẩn giải protein 12 Phụ lục 2: Các bảng hình ảnh minh hoạ Bảng Ảnh hƣởng phân hữu đến số tiêu sinh trƣởng cải mơ Công thức CT1(ĐC) CT2 CT3 CT4 Bảng Ƣớc tính chi phí sản xuất phân hữu từ chất thải chăn nuôi Hạng mục Chất thải chăn nuôi Chế phẩm VSV Urê Lân super Kali clorua Vôi bột Lao động 166 Bảng Chất lƣợng phân bón hữu chế biến từ phế thải chăn nuôi Chỉ tiêu Độ ẩm (%) pH OM (%) Nts (%) P2O5 (%) K2O (%) As (mg/kg) Cd (mg/kg) Pb (mg/kg) Hg (mg/kg) Độ chín (t sau lần đo liên tiếp) Mật độ E coli (CFU/25g) Mật độ Salmonella sp (CFU/25g) Chú thích: (-): Khơng có 25 g mẫu 167 Các hình ảnh minh hoạ Chuồng nuôi gà đẻ Chuồng nuôi lợn thịt Chất thải chăn nuôi gà chƣa xử lý Chất thải chăn nuôi lợn chƣa xử lý Xử lý chất thải trang trại nuôi lợn (Hƣng Nguyên, Nghệ An) Xử lý chất thải trang trại nuôi lợn (Đan Phƣợng, Hà Nội) 168 Xử lý chất thải trại lợn Đồng Tâm Xanh (Chƣơng Mỹ) Xử lý chất thải trại lợn (Thạch Thất) Xử lý chất thải trang trại chăn nuôi (Đăklăk) Xử lý chất thải trang trại gà (ĐăkLăk) Thí nghiệm đánh giá hiệu phân hữu từ chất thải chăn ni rau cải Thí nghiệm đánh giá hiệu phân hữu từ chất thải chăn nuôi dƣa chuột 169 Phụ lục 3: Xử lý số liệu thống kê 3.1 Năng suất rau cải CropStat - Balanced Analysis of Variance Command File :C:\USERS\LIONESS\DESKTOP\HIEN\HIEN XU LY SO LIEU\CRD.gfc Output File :C:\USERS\LIONESS\DESKTOP\HIEN\HIEN XU LY SO LIEU\CRD.out 12 RECORDS NOF FACTOR TREATMEN$ dc FACTOR NHAC LAI VARIATE - NS TT FILE rau cai 15/ 1/11 BALANCED ANOVA FOR VARIATE 15:51 :PAGE THI NGHIEM TREN RAU CAI VU XUAN HE VARIATE V003 NS TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT LN SOURCE OF VARIATION PROB ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN ============================================================= ======= TREATMEN$ 0.040 * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) 170 - TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS 1/11 15:51 -:PAGE THI NGHIEM TREN RAU CAI VU XUAN HE MEANS FOR EFFECT TREATMEN$ TREATMEN$ dc t1 t2 t3 SE(N= 5%LSD ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE 1/11 15:51 :PAGE THI NGHIEM TREN RAU CAI VU XUAN HE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION VARIATE GRAND MEAN |TREATMEN | 12) (N= | NO | STANDARD DEVIATION BASED ON 171 BASED ON COFV SD/MEAN |$ % | | NS TT 0.0402 1/11 14:55 :PAGE THI NGHIEM TREN RAU CAI VU THU DONG VARIATE V003 NS TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT SOURCE OF VARIATION LN PROB ER DF SUMS OF SQUARES MEAN F RATIO SQUARES LN ============================================================= ======= TREATMEN$ 0.049 * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS 1/11 14:55 :PAGE THI NGHIEM TREN RAU CAI VU THU DONG MEANS FOR EFFECT TREATMEN$ -TREATMEN$ dc t1 t2 t3 172 SE(N= 5%LSD 3) 8DF ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE 1/11 14:55 :PAGE THI NGHIEM TREN RAU CAI VU THU DONG F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION VARIATE |TREATMEN| | | | NS TT 173 3.2 Năng suất dƣa chuột BALANCED ANOVA FOR VARIATE TONG QUA FILE NS THO1 25/ 7/11 5:46 -:PAGE VARIATE V003 TONG QUA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= VAR01$ NL * RESIDUAL - * TOTAL (CORRECTED) - BALANCED ANOVA FOR VARIATE TONG QUA TP FILE NS THO1 25/ 7/11 5:46 :PAGE VARIATE V004 TONG QUA TP LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================== VAR01$ NL * RESIDUAL -* TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TY LE QUA TP FILE NS THO1 25/ 7/11 5:46 -: PAGE VARIATE V005 TY LE QUA TP LN SOURCE OF VARIATION LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================== VAR01$ NL * RESIDUAL -* TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLTB Qua FILE NS THO1 25/ 7/11 5:46 :PAGE VARIATE V006 KLTB Qua F SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= VAR01$ NL 174 * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSLT FILE NS THO1 25/ 7/11 5:46 -:PAGE VARIATE V007 NSLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= VAR01$ NL * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT FILE NS THO1 25/ 7/11 5:46 -:PAGE VARIATE V008 NSTT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================== VAR01$ NL * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NS THO1 -MEANS FOR EFFECT VAR01$ SE(N= 5%LSD 175 SE(N= 5%LSD 4) 3DF MEANS FOR EFFECT NL NL SE(N= 5%LSD 2) 3DF NL SE(N= 2) 5%LSD 3DF - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - RIATE TONG QUA TONG QUA TY LE QU KLTB Q NSLT NSTT 176 3.3 Chất lƣợng dƣa chuột BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEU DAI FILE 25/ 7/11 10: -:PAGE VARIATE V003 CHIEU DAI LN SOURCE OF VARIATION MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================== VAR01$ NL * RESIDUAL -* TOTAL (CORRECTED) -BALANCED ANOVA FOR VARIATE DUONG KINH FILE 25/ 7/11 10: - :PAGE VARIATE V004 DUONG KINH SOURCE OF VARIATION LN D F SUMS OF SQUARES MEAN SQUARES F RATIO PROB ER LN ========================================================================= VAR01$ NL * RESIDUAL -* TOTAL (CORRECTED) -BALANCED ANOVA FOR VARIATE DO DAY FILE 25/ 7/11 10: :PAGE VARIATE V005 DO DAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================== VAR01$ NL * RESIDUAL -* TOTAL (CORRECTED) -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE -MEANS FOR EFFECT VAR01$ -1 SE(N= 177 5%LSD 3DF 1.12254 0.384958 0.164401 -MEANS FOR EFFECT NL -NL SE(N= 2) 5%LSD 3DF ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY | VARIATE | | | CHIEU DAI DUONG KINH DO DAY 178 ... ? ?Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn? ?? đƣợc triển khai nhằm tạo đƣợc chế phẩm từ chủng vi sinh vật an tồn, có khả xử lý hiệu mùi hôi thối phát sinh từ chất thải chăn nuôi, ... môi trƣờng số sở chăn nuôi 59 3.1.1.1 Ơ nhiễm khí thải độc hại 59 3.1.1.2 Ô nhiễm vi sinh vật gây bệnh ký sinh trùng 61 3.2 NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI ... 1.1 CHẤT THẢI CHĂN NUÔI VÀ BIỆN PHÁP XỬ LÝ 1.1.1 Chất thải chăn nuôi nguy ô nhiễm môi trƣờng 1.1.2 Tình hình sử dụng chất thải chăn nuôi Vi? ??t Nam 1.1.3 Các biện pháp xử lý chất thải