Tài liệu Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao cho sản xuất chế phẩm xử lý phế thải chăn nuôi dạng rắn pptx

TUYN CHN CHNG VI SINH VT Cể KH NNG PHN GII XENLULOZA CAO CHO SN XUT CH PHM X Lí PH THI CHN NUễI DNG RN Phm Bớch Hiờn, o Vn Thụng, Lng Hu Thnh, V Thỳy Nga. SUMMARY Selection microorganism able high decompose of xenluloza for production inoculant treatments of solid waste livestock. Selection microorganisms able high decompose of xenluloza will play an important role in the production inoculant for treatment of solid waste livestock. This paper showed that the strain of microorganisms signed PTCX04 was selected. It can be decomposed of pig manure. By colony characteristic, cell morphology, and sequencing of DNA fragment of 16S rRNA gene the PTCN04 strain was determined as Streptomyces rochei. According to European Community, species are selected have high biosafety and they are permission to apply in common. The Streptomyces rochei will be continuous research to apply for production of inoculant. Keywords: Xenluloza, Streptomyces rochei, innoculant. I. ĐặT VấN Đề S liu c tớnh n gia sỳc, gia cm ca Vit Nam thi ra khong 539.733,15 tn cht thi rn/ngy, trong ú khong 50% c x lý bng phng phỏp truc khi bún rung, phn cũn li c s dng ngay hoc cho thi trc tip ra mụi trng gõy nhiu vn ụ nhim lm lõy lan ngun bnh nh hng n sc khe cng ng cng nh chớnh ngnh chn nuụi. Ph thi chn nuụi, ngoi hm lng dinh dng cũn cha khong 20 - 30% cỏc hp cht hydratcacbon m cõy trng khụng s dng c, trong ú xenluloza chim t l cao nht. Phõn gii xenluloza t nhiờn l quỏ trỡnh phc tp, thng kộo di 3 - 6 thỏng. Trong cỏc bin phỏp x lý ph thi chn nuụi hin nay, phng phỏp nhanh cú s tr giỳp ca vi sinh vt khi ng cú kh nng sinh enzym xenlulaza ngoi bo em li hiu qu cao nht. Nghiờn cu Tuyn chn chng vi sinh vt cú kh nng phõn gii xenluloza cao s dng trong sn xut ch phm vi sinh vt x lý nhanh ph thi chn nuụi nhm mc tiờu rỳt ngn thi gian , hn ch ụ nhim mụi trng, to ra sn phNm phõn bún hu c cú cht lng, ỏp ng yờu cu qun lý tng hp dinh dng cõy trng v phỏt trin nụng nghip bn vng. II. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Vt liu nghiờn cu - B chng ging VSV phõn gii xenluloza cú ký hiu t PTCX01 - PTCX10 c lu gi ti Vin Mụi trng N ụng nghip. - Húa cht v cỏc thit b cn thit trong phõn tớch, ỏnh giỏ VSV. 2. Phng phỏp nghiờn cu + Phng phỏp xỏc nh kh nng phõn gii xenluloza - Phng phỏp nh tớnh: S dng phng phỏp khuych tỏn trờn thch a Enzym xenlulaza thy phõn CMC trong mụi trng s to thnh vũng khụng mu vi thuc th lugol quanh ging cha dch enzym. Hot lc enzym ca VSV c biu th bng giỏ tr D - d (mm) trong ú: D l ưng kính vòng thy phân và d là ưng kính ca l khoan. - Phương pháp nh lưng: Da trên nguyên tc xác nh hot lc enzym C 1 và C x xúc tác phn ng phân ct bt giy hoc CMC thành các gc ưng kh. - nh lưng ưng kh: Xác nh bng thuc th DN SA. + Phương pháp xác nh tên vi sinh vt bng k thut phân t nh tên VSV bng phương pháp phân loi hc phân t da trên cơ s gii trình t on gien 16s ARN riboxom ca chng nghiên cu, so sánh vi các trình t có sn trong N gân hàng Gien Quc t EMBL bng phương pháp FASTA 33  nh loi n loài. Cp mi ưc thit k da trên trình t on gien mã hóa 16s ARN riboxom ca chng E. coli (J01695), tương ng vi các v trí nucleotit 15 - 33 (cho mi xuôi) và 1548 - 1532 (cho mi ngưc). Trình t nucleotit ca các chng nghiên cu ưc gii trình trên máy t ng ABI - 377, sau ó ưc x lý bng chương trình SeqEd1.03 và chương trình AssemblyLIGN 1.9 trong h chương trình MacVector 6.5.3. Truy cp N gân hàng Gien bng chương trình Entrez/nucleotide/ tìm kim các trình t gien 16s ARN riboxom ca VSV. So sánh i chiu và x lý s liu ca tt c các chui bng chương trình GEN DOC2.5. Thành phn nucleotit ưc thu nhn bng cách s dng b mã ca VSV bc thp (vi khuNn) trong N gân hàng Gien (bng mã di truyn s 11) thông qua chương trình GEN DOC 2.5. Tên VSV ưc xác nh vi xác sut tương ng cao nht. III. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao 1.1. Xác định định tính khả năng phân giải xenluloza T b chng ging VSV ưc phân lp, lưu gi bo qun ti B môn Sinh hc môi trưng - Vin Môi trưng Nông nghip, ã xác nh nh tính và tuyn chn chng có kh năng phân gii xenluloza cao. Bảng 1. Tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenluloza. STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc Nhóm VSV Đương kính vòng phân giải xenluloza (D-d)mm 1 PTCX01 Phân lập từ đất Vi khuẩn 17,0 2 PTCX02 - nt - Vi khuẩn 20,0 3 PTCX03 - nt - Xạ khuẩn 15,0 4 PTCX04 - nt - Xạ khuẩn 30,0 5 PTCX05 Từ phế thải chăn nuôi Xạ khuẩn 23,0 6 PTCX06 - nt - Vi khuẩn 21,0 7 PTCX07 - nt - Vi khuẩn 15,0 8 PTCX08 Phân lập từ đất Xạ khuẩn 13,0 9 PTCX09 - nt - Xạ khuẩn 18,0 10 PTCX10 - nt - Vi khuẩn 17,0 Trong 10 chng VSV nghiên cu có 5 chng thuc nhóm vi khuNn và 5 chng thuc nhóm x khuNn. Tt c các chng u có hot tính phân gii xenluloza. Chng PTCX08 có hot lc enzym xenlulaza thp nht (t 13,0mm), cao nht là chng x khuNn PTCX04 (t 30,0mm). Các chng còn li có ưng kính vòng phân gii xenluloza (D - d) trung bình t 17,0 n 23,0mm. T kt qu nghiên cu,  tài ã la chn ưc 1 chng x khuNn ký hiu PTCX04 s dng cho các nghiên cu tip theo. 1.2. Định lượng hoạt độ xenlulaza của chủng xạ khuẩn PTCX04. Xenlulaza là mt phc h enzym bao gm 3 enzym ch yu sau: Endo-1,4- glucanaza (hay CMC-aza, C x) , Exo-1,4- glucanaza (hay xenlobiohydrolaza, C 1 ) và β- 1,4-glucanaza (hay xenlobiaza). Nhng enzym này hot ng cùng nhau  thy phân xenluloza (Bng 2). Bảng 2. Kết quả xác định hoạt độ enzime của chủng PTCX04. Hoạt tính Mật độ (OD 540nm ) Hoạt lực enzyme (U/ml) Endo-glucanase 0,84 5,32 Exo-glucanase 0,23 0,41 Kt qu nh lưng và nh tính khng nh chng x khuNn PTCX04 có hot tính phân gii xenluloza cao. Dch enzyme ngoi bào ca chng PTCX04 có kh năng thy phân c 2 loi cơ cht CMC và bt giy, do ó có th s dng tt cho sn xut ch phNm VSV x lý ph thi chăn nuôi giàu cơ cht xenluloza. 2. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi sinh vật nghiên cứu - c im sinh lý, hình thái: KhuNn lc PTCX04 nuôi cy trên môi trưng Gauze có hình tròn, ưng kính 2,2 - 2,5mm, màu trng ngà, chân khuNn lc bám sâu trong môi trưng. Nuôi cy lc trên môi trưng dch th, sau 72 gi to thành ht nh kích c khong 1 mm, làm trong môi trưng nuôi cy, trên thành bình to vòng váng màu trng, bám cht vào thành bình, mt  t bào t 2.10 9 CFU/ml, hot  enzyme là 3,0mm. Sau 3 tháng lưu gi, mt  t bào t 3,6.10 8 , hot  enzym là 2,8mm (Bng 3). Bảng 3. Các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho hoạt tính sinh xenlulaza của chủng PTCX04 Điều kiện nuôi cấy Kết quả xác định Nhiệt độ thích hợp 35±2 Phổ pH 6,0 - 7,5 Nhu cầu O 2 (Lưu lượng cấp khí (dm 3 O 2 /dm 3 môi trường/h) 0,75 Thời gian nuôi cấy (h) 72 Nguồn hydratcacbon CMC, bột giấy, tinh bột, rỉ đường Nguồn Nitơ Pepton, cao nấm men 3. Thử nghiệm sử dụng chủng PCTX04 trong ủ, xử lý phế thải chăn nuôi Th nghim kh năng ng dng chng PCTX04 trong , x lý ph thi chăn nuôi. o nhit  ng  theo thi gian, sau 21 ngày xác nh mt s c im lý hoá ca phân   ánh giá kh năng chuyn hoá cht hu cơ trong ph thi chăn nuôi. Biểu đồ 1. Biến động nhiệt độ trong khối ủ phế thải chăn nuôi lợn 0 10 20 30 40 50 60 70 0 giờ 2 ngày 7 ngày 9 ngày 15 ngày 17 ngày 21 ngày Thời gian Nhiệt độ Đối chứng Thí nghiệm Biểu đồ 1. Biến động nhiệt độ trong khối ủ phế thải chăn nuôi lợn Bảng 4. Biến đổi thành phần lý, hóa học của phế thải chăn nuôi lợn được xử lý bằng chủng PTCXO4 Công thức Định tính sự biến đổi lý học Hàm lượng OC tổng số (%) Thành phần cơ giới Màu sắc Mùi Trước xử lý Bết, không xốp Vàng Hôi 45,5 Sau xử lý Tơi xốp Nâu sẫm Không còn mùi 25,7 Bảng 5. Quần thể vi sinh vật gây bệnh trong phế thải chăn nuôi lợn được xử lý bằng chủng PTCXO4 Công thức Định tính sự biến đổi lý học Trứng giun (trứng/gr) Coliform (CFU/g) Salmonella (CFU/g) 0 giờ Sau 21 ngày 0 giờ Sau 21 ngày 0 giờ Sau 21 ngày Đối chứng 5,2 x10 5 2,2 x10 3 6,3 x10 3 1,6x10 2 15 10 Thí nghiệm 5,2 x10 5 - 6,3 x10 3 - 15 0 ( - ): Không phát hin  nng  pha loãng 10 - 1 B sung chng PTCX04 trong ng  ã em li hiu qu rõ rt trong x lý ph thi chăn nuôi ln. Ch s OC ca ph thi chăn nuôi ln t 45,5% gim xung còn 25,7%. Trong quá trình chuyn hoá các hp cht hydratcacbon, nhit  tăng cao không nhng làm rút ngn thi gian , tăng hiu qu chuyn hoá cơ cht, to sn phNm sau x lý tơi xp, chuyn sang màu nâu sm, không còn mùi hôi mà còn giúp loi b các yu t sinh hc gây hi. 4. Định danh chủng xạ khuẩn nghiên cứu *. Gii trình t gen chng x khuNn PTCX04. GAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGC GACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGG CCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGC TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAG CTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCA GGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACA CCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCC GCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACAT ACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTG TGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCA TGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGA GCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTA GTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG CCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGG GAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGA AGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT Vị trí phân loại của chủng PTCX04 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADr 16S vùng V1 - V3 (vị trí 968 - 1401 của E. coli) * Xác nh tên: Trình t gen rARN 16S ca chng PTCX04 tương ng 99,7% (1297 - 1296/1300 bp) vi on 16S ca x khuNn Streptomyces aurantiogriseus, Streptomyces levis, Streptomyces djakartensis, Streptomyces rochei, Streptomyces mutabilis, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces anandii, Streptomyces geysiriensis, Streptomyces tuirus, Streptomyces gancidicus . Da vào kt qu xác nh trình t gen và c im sinh hóa ca x khuNn nghiên cu, chng PTCX04 có c im trùng vi chng x khuNn có tên là Streptomyces rochei. 5. Xác định mức độ an toàn sinh học Theo Hưng dn s 90/679/EWG ca Cng ng châu Âu v an toàn sinh hc, nhóm tác nhân sinh hc ưc phân làm 4 cp  an toàn, trong ó ch các VSV  cp  1 và 2 ưc ng dng trong sn xut  iu kin bình thưng. Mc an toàn sinh hc 1 - 4 là các mc an toàn sinh hc chung, ch yu cho các tác nhân sinh hc như vi khuNn, virut, nm, ký sinh trùng (k c có và không có bin i gien). Kt qu i chiu vi danh mc cho thy chng x khuNn phân gii xenluloza Streptomyces rochei ưc xp vào nhóm VSV có  an toàn sinh hc mc 2, có th ng dng rng rãi trong sn xut ch phNm vi sinh vt x lý nhanh ph thi chăn nuôi. IV. KÕt luËn - ã tuyn chn ưc chng x khuNn có hot tính phân gii xenluloza cao, các c im sinh hc thích hp cho s dng sn xut ch phNm VSV, bưc u ng Kitasatos poria setalba_U93332 Streptomyces virens_DQ442554 Streptomyces asterosporus_ AY999902 Streptomyces gancidicus_ AY999919 Streptomyces tuirus_AF503493 Streptomyces geysiriensis_ DQ442501 Streptomyces anandii_AY999803 Streptomyces fungicidicus_ AB184529 Streptomyces mutabilis_ EU741237 Streptomyces rochei_GQ392058 PTCX04 Streptomyces aurantiogriseus_ AY999793 Streptomyces naganishii_ DQ442529 Streptomyces shandongensis_ AY875718 Streptomyces djakartensis_ AB184657 Streptomyces lavendulocolor_ DQ442516 Streptomyces minutiscleroticus_ EF178696 Streptomyces levis_DQ442517 0.01 dng cho thy chng vi sinh vt này có hiu qu trong x lý ph thi dng rn trong chăn nuôi gà, ln. - Kt qu phân loi xác nh chng x khuNn tuyn chn thuc loài Streptomyces rochei, ưc xp vào nhóm vi sinh vt có  an toàn sinh hc mc 2, có th ng dng rng rãi trong sn xut ch phNm vi sinh vt x lý nhanh ph thi chăn nuôi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ajay (EDT) Singh, Owen P. (EDT) Ward (2004), Biodegradation and Bioremediation, Springer 57 - 74. 2. Coughlan, M. and Mayer F. (1998), Cellulose decomposing bacteria and their enzyme system. The procayotes, chapter 20, 460 - 502 3. Gaur A. C. (1980), Microbial decomposition of organic matterial and humus in soil and compost, FAO/UNDP, Technology composting. 4. Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A, Staley J. T., Williams S. T. (2000), Bergey’s Manual of Determinative., Bacteriology, 9 th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (4), 5. Meinke A., Gilkes N. R., Kilburn D. G., Miller R. C., Jr. and Warren R. A. J. (1993), “Cellulose - binding polypeptides from Cellulomonas fimi: endoglucanase D (CenD), a family A α - 1,4 - glucanase”, J. Bacteriol, (175), pp. 1910 - 1918. 6. Smith, R. C. (1995), Composting practices, NDSU Extension Service. North Dakota State University of Agriculture and Applied Science, and USDA. 7. TCVN 6168:2002, Chế phm vi sinh vật phân giải xenluloza. Người phản biện GS. TSKH. Trần Duy Quý T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 . ng cao nht. III. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao 1.1. Xác định định tính khả năng phân giải. tính và tuyn chn chng có kh năng phân gii xenluloza cao. Bảng 1. Tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenluloza. STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc Nhóm