Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn

Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn Phạm Bích Hiên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận án Tiến sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 62 42 40 01 Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Văn Toản, GS.TS Nguyễn Đình Quyến Năm bảo vệ: 2012 Abstract Chương Trình bày tổng quan chất thải chăn nuôi biện pháp xử lý; vi sinh vật tham gia trình xử lý chất thải hữu Chương Vật liệu phương pháp: mẫu thu thập chủng vi sinh vật, hóa chất; phương pháp: phân loại vi sinh vật; xác định hoạt tính sinh học vi sinh vật; xác định trạng chất thải chăn nuôi; thử nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm Chương Kết thảo luận: thực trạng chất thải số sở chăn nuôi; nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi; nghiên cứu sản xuất chế phẩn vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi hiệu sử dụng phân hữu từ chất thải chăn nuôi trồng Keywords Sinh học; Vi sinh vật học; Xử lý chất thải; Phế thải chăn nuôi Content MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN Việt Nam nước nông nghiệp, thời kỳ đổi ngành chăn nuôi có bước phát triển nhanh chóng, mô hình trang trại chăn nuôi tập trung nhân rộng toàn quốc Mỗi năm nước có khoảng 60 triệu chất thải vật nuôi, có khoảng 50% xử lý, số lại sử dụng trực tiếp bón cho trồng làm thức ăn cho cá Do tập trung đầu tư để nâng cao suất chất lượng vật nuôi, phần nhiều trang trại chưa trọng đến công tác kiểm soát, quản lý chất thải nên làm phát sinh dịch bệnh, tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng ảnh hưởng trực tiếp đến việc phát triển bền vững ngành chăn nuôi Tại nhiều địa phương người dân coi chất thải chăn nuôi phân bón, không quan tâm đến việc xử lý có ủ đống để chờ bón cho trồng theo mùa vụ Đây nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường lây truyền dịch bệnh cho người, vật nuôi trồng Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN - Tuyển chọn chủng vi sinh vật (VSV) thuộc nhóm an toàn, sinh trưởng mạnh, cạnh tranh với VSV chất thải, chuyển hóa nhanh hợp chất hữu ức chế hiệu vi khuẩn (VK) gây bệnh, gây thối, làm giảm ô nhiễm môi trường từ chất thải chăn nuôi - Tạo chế phẩm VSV để xử lý chất thải chăn nuôi thành phân hữu đáp ứng yêu cầu dinh dưỡng trồng, thay phần phân vô cơ, góp phần phát triển nông nghiệp an toàn, bền vững ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đây công trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống, từ trạng chất thải dạng rắn trang trại chăn nuôi tập trung đến sản xuất ứng dụng thành công chế phẩm VSV xử lý có hiệu chất thải chăn nuôi, giảm ô nhiễm môi trường rút ngắn thời gian chuyển hóa chất hữu từ 3- tháng xuống 21- 30 ngày, đánh giá đựơc hiệu phân hữu chế biến từ chất thải chăn nuôi trồng - Là công trình nghiên cứu cách tổng hợp chứng minh hiệu sử dụng vi khuẩn lactic sinh chất kháng khuẩn (axit lactic bacterioxin) để xử lý mùi hôi thối ức chế vi khuẩn gây bệnh chất thải chăn nuôi - Xây dựng qui trình sản xuất ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn làm phân bón hữu thay phân chuồng tiết kiệm 25% lượng phân khoáng góp phần phát triển sản xuất nông nghiệp an toàn, bền vững Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN - Cung cấp chủng vi sinh vật an toàn, có hoạt tính sinh học cao sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý chất thải chăn nuôi, tạo phân hữu góp phần giảm lượng phân hoá học nâng cao hiệu sản xuất nông dân - Đề xuất giải pháp giảm thiểu ô nhiễm môi trường chăn nuôi qui mô trang trại góp phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi BỐ CỤC LUẬN ÁN: Luận án bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (37 trang); vật liệu phương pháp (17 trang); kết thảo luận (71 trang); kết luận kiến nghị (2 trang); danh mục công trình liên quan đến luận án; danh mục 122 tài liệu tham khảo phụ lục Luận án có 45 bảng, 42 hình Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chất thải chăn nuôi biện pháp xử lý 1.1.1 Chất thải chăn nuôi nguy ô nhiễm môi trƣờng  Chất thải chăn nuôi: Là chất thải trình chăn nuôi, gồm ba dạng chủ yếu: Chất thải rắn (bao gồm chủ yếu phân, chất độn chuồng, thức ăn thừa xác gia súc, gia cầm chết hàng ngày); chất thải lỏng (bao gồm nước rửa chuồng, nước tắm cho vật nuôi, nước tiểu, phần phân); chất thải bán lỏng (gồm chất thải rắn chất thải lỏng)  Nguy ô nhiễm môi trƣờng: - Ô nhiễm kim loại nặng: Các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng, vật nuôi không tiêu hoá hết tiết theo đường phân làm thoái hoá đất, ức chế hoạt động VSV, ô nhiễm nước ngầm, tích tụ nội tạng người vật nuôi nguyên nhân gây loại bệnh tật - Ô nhiễm khí độc: Trong phân, nước thải lợn có khoảng 40 loại khí độc khác sinh từ trình thối rữa thức ăn thừa xác động thực vật hoạt động sống vi khuẩn yếm khí Các khí thải H2S, NH3, CH4, CO2, N2O gây mùi hôi thối khó chịu, kích thích trung khu hô hấp người vật nuôi, gây ngộ độc tử vong - Ô nhiễm vi sinh vật ký sinh trùng gây bệnh: Theo tài liệu FAO có khoảng 90 loại bệnh liên quan người gia súc mà phần lớn vi sinh vật ký sinh trùng (KST) lan truyền từ chất tiết vật nuôi bị bệnh vào không khí, nguồn nước, đất, nông phẩm, phổ biến nguy hiểm nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột 1.1.2 Tình hình sử dụng chất thải chăn nuôi Việt Nam Mỗi ngày đàn gia súc, gia cầm Việt Nam thải khoảng 539.733.15 chất thải rắn, khoảng 25-30 triệu khối chất thải lỏng, ước tính năm có 60 triệu phân vật nuôi loại Trong số có khoảng 50% xử lý phương pháp ủ trước sử dụng 1.1.3 Các biện pháp xử lý chất thải chăn nuôi - Phƣơng pháp vật lý: Bao gồm phương pháp lắng cặn; sử dụng máy tách chất rắn; lọc - Phƣơng pháp hoá học: Bơm trộn chất điện ly đơn giản chất điện ly polyme với hỗn hợp chất thải trước tách học làm tăng 82% hiệu tách chất rắn - Phƣơng pháp sinh học: + Sử dụng thảm thực vật, hồ thuỷ sinh + Sử dụng vi sinh vật: Là biện pháp phương pháp sinh học Dựa sở tối ưu hoá điều kiện môi trường cho hệ vi sinh vật tự nhiên vi sinh vật khởi động phát triển để phân giải hợp chất hữu phân điều kiện hiếu khí hay kỵ khí tạo sản phẩm cuối ổn định, có giá trị kinh tế, giảm hàm lượng chất rắn tổng số, giảm mùi, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh Biện pháp chủ yếu xử lý chất thải lỏng biogas, xử lý chất thải rắn composting 1.2 Vi sinh vật tham gia trình xử lý chất thải hữu Hệ vi sinh vật chất thải chăn nuôi gồm nhiều nhóm VSV có hoạt tính sinh học khác giữ vai trò quan trọng chu trình chuyển hóa hợp chất hữu thành chất mùn mà trồng sử dụng Ở đề cập nhóm VSV có khả phân huỷ hợp chất phổ biến, thành phần chất thải chăn nuôi gồm xenluloza, tinh bột, protein VSV có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn gây thối 1.2.1 Vi sinh vật phân giải xenluloza Xenluloza thành phần chủ yếu thành tế bào thực vật Trong tự nhiên khu hệ VSV có khả sinh tổng hợp enzym xenlulaza phân giải xenluloza vô phong phú, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn vi nấm Xenlulaza phức hệ enzym (Endo-1,4-glucanaza, Exo1,4-gluconaza, -1,4-glucozidaza) hoạt động để thuỷ phân xenluloza tạo loại đường qua thành tế bào VSV 1.2.2 Vi sinh vật phân giải tinh bột Amylaza hệ enzym phổ biến VSV Cơ chất xúc tác amylaza tinh bột glycogen, theo tính chất cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành loại: -amylaza, -amylaza, glucoamylaza oligo 1-6 glucozidaza -amylaza gặp hầu hết loại VSV nấm sợi, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử xạ khuẩn 1.2.3 Vi sinh vật phân giải protein VK có khả sinh hai loại proteaza (endopeptidaza exopeptidaza), proteaza VK có tính đặc hiệu chất cao Các VK có khả tổng hợp proteaza mạnh Nhiều loại nấm mốc có khả tổng hợp lượng lớn proteaza xạ khuẩn nghiên cứu 1.2.4 Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axit lactic bacterioxin Vi khuẩn lactic có khả sinh axit lactic làm tăng phân hủy hợp chất hữu cơ, chất tiệt trùng ứng dụng nhiều bảo quản, chế biến thực phẩm, y, dược xử lý môi trường Gần vi khuẩn lactic đặc biệt quan tâm nghiên cứu khả sinh bacterioxin chất diệt khuẩn hệ có phổ kháng khuẩn đa dạng, tính đặc hiệu tế bào đích cao, an toàn với người, vật nuôi, trồng môi trường giải pháp cho vấn đề kiểm soát nguồn bệnh Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu - Mẫu thu thập: 50 mẫu nghiên cứu gồm phân ủ, thức ăn chăn nuôi, phụ phẩm nông nghiệp chất thải sinh hoạt, chất thải chăn nuôi, phụ phẩm chế biến thực phẩm sản phẩm lên men truyền thống thu thập địa bàn Hà Nội, Nghệ An, Đăklac - Vi sinh vật gồm: VK lactic: Lactobacillus agilis JCM 1230,L salivarius JCM 5804, L plantarum JCM 1048 JCM1149, Leuconostos mesenteroides, L fermentum, Streptocccus spp Phòng Công nghệ Vật liệu Sinh học- Viện CNSH cung cấp Chủng VK gây thối nhũn khoai tây Erwinia carotovora KT03 Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp Chủng VK gây bệnh cho người vật nuôi: E coli PA2, E coli NC, S typhimurium, Shigella flexneri, Enterococcus faecalis, S aureus ATCC 29213 Phòng VK gặp- Viện Vệ sinh dịch tễ TW Viện CNSH cung cấp - Các hoá chất, thiết bị máy móc: Được sản xuất nước Mỹ, Nhật Bản, Thụy Điển Đức 2.2 Phƣơng pháp - Các phương pháp nghiên cứu VSV học thông thường: Phương pháp nuôi cấy, lên men, xác định đăc điểm sinh hóa… - Phân loại: Theo truyền thống (dựa đặc điểm hình thái, sinh hóa) kỹ thuật sinh học phân tử (lập phả hệ dựa kết giải trình tự gien ADNr 16S Xác định trình tự ADNr 16S chủng VK theo phương pháp Sakiyama cs năm 2009) - Các phương pháp xác định hoạt tính: Phương pháp khuếch tán đĩa thạch, điện di tricin SDS-PAGE, phương pháp Thener, Anson cải tiến, Micro-bertrand … - Phân tích lý hoá thí nghiệm đồng ruộng theo TCN, TCVN, xử lý số liệu theo thống kê sinh học Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THỰC TRẠNG CHẤT THẢI TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ CHĂN NUÔI Số liệu khảo sát trung bình sử dụng chất thải chăn nuôi dạng rắn sở chăn nuôi tập trung thành phố Hà Nội, tỉnh Nghệ An, Đắklắc cho thấy: Phần lớn (52%) chất thải chăn nuôi bán cho sở thu mua, có 21% lượng chất thải dùng để bón cho cây, 17% dùng làm thức ăn cho cá 10% thải hệ thống nước thải công cộng Kết xác định nồng độ trung bình số khí thải vi sinh vật gây bệnh điểm điều tra vượt ngưỡng cho phép (bảng 3.1.) Bảng 3.1 Môi trƣờng không khí trang trại chăn nuôi Nơi đánh giá Chỉ tiêu đánh giá (số liệu trung bình nơi đánh giá) Độ nhiễm khuẩn Nồng độ H2S không khí (CFU/m3) (mg/m3) Khu tập kết chất thải nuôi 5,8 ± 0,45 x 106 lợn 0,36 ± (4,5a) Khu tập kết chất thải nuôi 7,2 ± 0,38 x 106 gà 0,32 ± 0,04 (4a) Giới hạn tối đa 106 0,08 * Nồng độ (mg/m3) 0,05 3,12 ± b (15,6 ) 2,94 ± b (14,7 ) 0,2 ** NH3 0,06 0,08 (*): Theo TCVN 5937/95; (**): Theo TCVN 5938/95; a,b: số lần tăng so với giới hạn cho phép Nồng độ H2S trang trại chăn nuôi gà lợn cao gấp 4- 4,5 lần so với giới hạn Nồng độ NH3 trang trại nuôi lợn gà cao mức giới hạn 15 lần Kết nghiên cứu thấp kết điều tra báo cáo Cục Chăn nuôi, nồng độ H2S chuồng nuôi gà cao gấp 83,4 lần so với giới hạn chuồng nuôi lợn gấp 64,4 lần; Nồng độ NH3 chuồng nuôi gà cao gấp 30,6 lần so với giới hạn chuồng nuôi lợn gấp 24,15 lần Sở dĩ có sai khác khác thời điểm nghiên cứu, mô hình chăn nuôi địa điểm lấy mẫu chuồng nuôi khu vực tập kết chất thải Bảng 3.2 Mật độ vi sinh vật gây bệnh ký sinh trùng chất thải chăn nuôi Chất thải chăn nuôi Mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/g) VKTS * E coli Salmonella sp Trứng giun/g Chất thải nuôi lợn 6,58±0,6 x 106 2,20±0,5x 105 1,2±0,2x 103 105± 4,8 Chất thải nuôi gà 7,10 ±0,4x 107 8,06±0,3x 105 2,4±0,1x 103 120± 3,5 Mức cho phép 104 (-)** (*): VK tổng số ); (-)**: Không có 25 g mẫu Theo qui định chất thải chăn nuôi sử dụng cho nông nghiệp không chứa Salmonella 25 g mẫu nhiên kết phân tích cho thấy mẫu chất thải chăn nuôi lợn gà chứa Salmonella sp với nồng độ 103 CFU/g E coli cao 20- 80 lần giới hạn cho phép Kết phù hợp với kết nghiên cứu Cục Chăn nuôi Viện Chăn nuôi 3.2 NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật Từ 28 mẫu phân ủ; thức ăn chất thải chăn nuôi; phân ủ từ rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp, bã nấm phân lập 17 chủng VSV có khả phân giải xenluloza, 12 chủng phân giải tinh bột chủng phân giải protein Trong đó, sàng lọc 15 chủng sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định đa hoạt tính tuyển chọn chủng xạ khuẩn ký hiệu XK112 có khả phân giải xenluloza cao (kích thước VPG đạt 34mm); chủng VK B20 có hoạt tính phân giải tinh bột mạnh (kích thước VPG đạt 38mm); chủng VK B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh (kích thước VPG đạt 30 mm) Từ 22 mẫu thu thập địa bàn Hà Nội phân lập chủng VK lactic, lựa chọn chủng LH19 sinh bacterioxin ức chế chủng VK gây thối Erwinia carotovora KT03 Kết thử nghiệm khả ức chế chéo môi trường thạch cho thấy chủng LH19, XK112, B20 B15 không ức chế nhau, chủng VSV tuyển chọn cho nghiên cứu Bảng 3.7 Hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn Kí chủng hiệu Kích thước vòng phân giải (D-d) mm Hàm lượng Kháng axit lactic carotovora (mg/ml) (D-d, mm) Xenluloza Tinh bột Protein XK112 34 20 - - - B20 26 - - - B15 - 38 21 30 - - 27,9 22 LH19 E KT03 Hình 3.2 Hoạt tính Hình 3.3 Hoạt tính Hình 3.4 Hoạt tính Hình 3.5 Hoạt tính phân giải xenluloza phân giải tinh bột phân giải protein kháng E carotovora chủng XK112 chủng B20 chủng B15 KT03 chủng LH15 3.2.2 Định tên xác định độ an toàn sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn 3.2.2.1 Định tên vi sinh vật phƣơng pháp truyền thống Chủng XK112: Sau 48- 72 nuôi cấy môi trường Gauze 35- 370C, khuẩn lạc chủng XK112 có hình tròn, bề mặt khô, nhăn, đường kính 2- 2,5 mm, màu trắng xám, chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trường thạch Chuỗi bào tử dạng thẳng, chuỗi có từ 15 đến 35 bào tử Hình 3.6 Hình thái cuống sinh bào tử, bào tử Hình 3.10 Hình thái khuẩn chủng XK112 lạc chủng XK112 Chủng B20: Chủng VK B20 thuộc Gram (+), kỵ khí không bắt buộc Nuôi cấy môi trường King B nhiệt độ 300C, sau 48 khuẩn lạc khô, màu nâu nhạt, mép có thùy, có đường kính 0,5-1 mm Tế bào chủng B20 hình que, ngắn, kích thước 5,2 x 0,8 m Bào tử hình ovan Hình 3.7 Hình dạng tế bào chủng B20 Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc chủng XK112 Chủng B15: Chủng VK B15 thuộc Gram (+), hiếu khí Trên môi trường KingB 300C, sau 48 giờ, khuẩn lạc khô, lan bề mặt thạch, màu vàng nhạt, lồi tâm, mép xẻ thùy, có đường kính 0,7-1 mm Tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ kích thước 444 nm x 2,02 m Tạo bào tử hình bầu dục Hình 3.8 Hình dạng, kích thước tế bào chủng B15 Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc chủng B15 Chủng LH19: Trên môi trường thạch đĩa MRS 32-350C, sau 48 giờ, khuẩn lạc nhỏ, tròn lồi màu trắng sữa, bề mặt mịn, mùi chua thơm, tạo vòng phân giải suốt xung quanh khuẩn lạc môi trường thạch MRS có bổ sung 0,5% CaCO3 Chủng LH19 không di động, không sinh bào tử, bắt màu Gram (+), thuộc loại kỵ khí không bắt buộc Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, kích thước 514 nm  2,44 m Hình 3.9 Hình dạng, kích thước tế bào chủng LH19 Hình 3.13 Hình thái khuẩn lạc chủng LH19 Cả chủng có khả đồng hóa đa dạng với nguồn hydratcacbon, có chủng vừa có khả phân giải CMC tinh bột vừa có khả thuỷ phân gelatin, cazein Đặc tính thuận lợi cho việc lựa chọn môi trường nhân sinh khối sản xuất đồng thời phù hợp với mục đích sử dụng VSV để xử lý chất thải chăn nuôi giàu hợp chất hydratcacbon protein Căn vào tất kết đặc điểm hình thái, phản ứng sinh hoá chủng VSV, dựa vào khoá phân loại Bergey, sơ khẳng định chủng XK112 thuộc chi Streptomyces, có đặc điểm tương tự loài S griceosporeus; chủng B20 thuộc chi Bacillus, có đặc điểm tương tự loài B licheniformis; chủng B15 thuộc chi Bacillus, có đặc điểm tương tự loài B subtilis; chủng LH19 thuộc chi Lactobacillus, có đặc điểm tương tự loài L plantarum 3.2.2.2 Định tên vi sinh vật kỹ thuật sinh học phân tử Kết giải trình tự gien cho thấy: Chủng XK112 có trình tự gien ARNr 16S tương đồng tới 99,7% (1245/1250 bp) so với trình tự chủng XK S griseosporeus có ký hiệu AB184419 Chủng B20 có trình tự gen ARNr 16S tương đồng 99,9 % (1429/1430 bp) với trình tự gien chủng B licheniformis_X68416 Trình tự gien ARNr 16S chủng B15 tương đồng 99,9% (1449/1451 bp) với đoạn 16S Bacillus subtilis Chủng LH19 có trình tự ARNr 16S tương đồng 99,9% với loài nhóm Lactobacillus plantarum, nằm vị trí với Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum  Căn vào kết định danh theo phương pháp truyền thống kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác định chủng XK112 Streptomyces griseosporeus, chủng B20 Bacillus licheniformis, chủng B15 Bacillus subtilis, chủng LH19 Lactobacillus plantarum  Cả chủng VSV nghiên cứu thuộc nhóm 1, đảm bảo độ an toàn sinh học người, vật nuôi, trồng môi trường, phép sử dụng sản xuất nông nghiệp 3.2.3 Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả phân giải chất hữu VSV 3.2.3.1 Ảnh hƣởng đến khả phân giải xenluloza chủng XK112 * Ảnh hưởng nhiệt độ Chủng XK112 nuôi cấy môi trường Gauze, sau 72 điều kiện nhiệt độ từ 25 đến 650C, xác định mật độ tế bào kích thước vòng phân giải chất xenluloza thạch đĩa Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng khả phân giải xenluloza XK112 Nhiệt độ nuôi Mật độ tế bào Kích thước VPG (D-d, mm) (0C) (x 106 CFU/ml) CMC Bột giấy 25 0,53 10 +/- Hoạt tính tương đối (%) 29,5 30 180 18 11 52,8 35 5400 31 15 91,2 40 6200 34 16 100 45 5600 32 16 94,1 50 3600 31 15 92,2 55 440 31 14 92,0 60 22 19 11 56,0 65 0,26 +/- +/- 26,0 Chú thích: (+/-) Vòng phân giải mờ, kích thước VPG