Nghiên cứu sự lưu hành của một số virus gây bệnh cho người trên dơi ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SỰ LƢU HÀNH CỦA MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH CHO NGƢỜI TRÊN DƠI Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SỰ LƢU HÀNH CỦA MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH CHO NGƢỜI TRÊN DƠI Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH MÃ SỐ : VI SINH VẬT HỌC :62424001 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.PGS.TS LÊ THỊ QUỲNH MAI GS.TS PHẠM VĂN TY HÀ NỘI – 2013 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh có nguồn gốc từ động vật 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Giả thiết xuất lây truyền bện 1.1.3 Các bệnh lây truyền từ động vật 1.2 Dơi vai trò truyền bệnh 1.2.1 Sinh thái, phân loại, phân bố lồi dơi 1.2.2 Một số thơng tin khu hệ dơi Việt Nam 1.2.3 Vai trò dơi truyền bệnh 1.3 Mốt số bệnh nhiễm trùng xuất 1.3.1 Nhóm Henipavirus 1.3.2 Nhóm Coronavirus 1.3.3 Nhóm Coltivirus 1.3.4 Nhóm Arbovirus 1.4 Biện pháp phịng chống bệnh lây truyền ngƣời 1.4.1 Chủ động giám sát bệnh 1.4.2 Kiểm soát vật chủ, vectơ, ổ chứa tác nhân truyền bệnh 1.5 Các phƣơng pháp phát xác định 1.5.1 RT- PCR 1.5.2 Phân lập virus 1.5.3 Huyết học CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, cỡ mẫu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.1.1 Mẫu dơi thu thập nghiên cứu 2.1.2 Mẫu máu ngƣời khỏe mạnh tham gia nghiên cứu 2.2 Vật liệu 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 2.2.2 Sinh phẩm 2.2.3 Trang thiết bị dụng cụ 2.3 Phƣơng pháp 2.3.1 Định loại dơi thực địa 2.3.2 Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA) tóm bắt IgG 2.3.3 Kỹ thuật xác định kháng thể trung hòa 2.3.4 Phương pháp xác định số yếu tố liên quan đến khả lây truyền virus từ dơi sang người 2.3.5.Phương pháp xử lý số liệu 2.4 Đạo đức nghiên cứu CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Dấu vết kháng thể kháng virus Nipah, SARS-CoV, Banna, Viêm não Nhật Bản, Chikungunya loài Dơi Việt Nam 3.1.1 Thời gian, địa điểm thu thập mẫu dơi 3.1.2 Các loài dơi thu thập nghiên cứu 3.1.3 Kết xác định số tác nhân gây bệnh cho ngƣời liên quan đến dơi phƣơng pháp huyết học 3.1.4 Mối liên quan virus gây bệnh truyền nhiễm cho ngƣời với họ/ loài dơi 3.2 Khả phơi nhiễm virus có vật chủ lồi dơi số nhóm ngƣời có yếu tố liên quan dịch tễ 3.2.1 Phát kháng thể kháng virus Nipah mẫu huyết nguời phƣơng pháp huyết học 3.2.2 Phát kháng thể kháng SARS –CoV mẫu huyết nguời phƣơng pháp huyết học 3.2.3 Một số yếu tố nguy liên quan đến khả truyền virus Nipah sang ngƣời Tây Nguyên KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN ARN Acid ribonucleic ATSH An toàn sinh học BSL–3 Biosafety level III (Phịng thí nghiệm an tồn sinh học cấp độ 3) CDC The US Center of Diseases Control and Prevention (Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh Mỹ) CPE Cytopathic effects (Hiệu ứng hủy hoại tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) ELISA Enzyme linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết bào thai bê) HEV Hendra Virus IFA Immunofluorescent Assay (Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang) NiV Nipah virus NT50 50% CPE Neutralization test (Phản ứng trung hòa gây hủy hoại 50% tế bào) PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch đệm PBS) RT- PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymeraza phiên mã ngược) SARS Severe acute respiratory syndrome (Hôi chứng viêm đường hô hấp nặng) SXH Sốt xuất huyết TCID50 SHPT TTYTDP Sinh học phân tử VNNB Tissue culture infectious dose (liều gây nhiễm 50% tế VSDTTU bào nuôi cấy) WB Trung tâm Y tế dự phòng WHO Viêm não Nhật Bản Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng Western Blot World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) Bảng 1.1 Hệ 1.2 Các 1.3 Các 3.1 Số 3.2 Các 3.3 Các 3.4 Kế thu 3.5 Kế trun 3.6 Kế bằn 3.7 Kế phả 3.8 Kế thu 3.9 Kế phả 3.10 Kế Ch 3.11 Kế phả 3.12 Kế phản ứng trung hòa (NT50) 3.13 Bảng tổng hợp kết mẫu huy thể IgG kháng virus Nipah, SARS Chikungunya 3.14 Kết xác định kháng thể IgG kh tình nguyện khu vực Tây Nguyê 3.15 Kết xác định kháng thể IgG kh tình nguyện khu vực Tây Nguyê hòa 3.16 Kết xác định kháng thể IgG kh tình nguyện khu vực Tây Nguyê 3.17 Kết xác định kháng thể IgG kh ngƣời tình nguyện khu vực Tây trung hịa 3.18 Kết khảo sát câu hỏi in nguyện DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 128 128 The European parliament and the council of the european union (2000), "Directive 2000/54/EC of the European parliament and of the council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work", Official Journal of the European Communities, pp 262/1–262/45 129 Tom Blanchard (2004), "Rabies and other lyssavirus diseases", Lancet 363(9424), pp 1906–1907 130 Tsutomu Omatsua, Shumpei Watanabe, Hiroomi Akashi, Y.Y (2007), "Biological characters of bats in relation to natural reservoir of emerging viruses", Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 30(5-6), pp 357–374 131 Ute Pieper, Jan-Gerd Kuhling, R.S (2000), "Code of practice Laboratory Biosafety", Infection Prevention - Healthcare Sector 132 Vidya A Arankalle, Shubham Shrivastava, Sarah Cherian, Rashmi S Gunjikar, Atul M Walimbe, Santosh M Jadhav, A.B.S and A.C.M (2007), "Genetic divergence of Chikungunya viruses in India (1963-2006) with special reference to the 2005-2006 explosive epidemic", The Journal of general virology 88, pp 1967–1976 133 Vidya Shankar, Richard A Bowen, T.J.O and April D Davis, C.E.R (2004), "Rabies in a captive colony of big brown bats (Eptesicus fuscus).", Journal of wildlife diseases 40(3), pp 403–413 134 Vincent P Hsu, Mohammed Jahangir Hossain, Umesh D Parashar, Mohammed Monsur Ali, Thomas G Ksiazek, Ivan Kuzmin, Michael Niezgoda, Charles Rupprecht, Joseph Bresee, R.F.B (2004), "Nipah virus encephalitis reemergence, Bangladesh", Emerging infectious diseases 10(12), pp 2082–2087 135 W H M Van der Poel, R Van der Heide, G Van Amerongen, L.J.M.Van Keulen, G J.Wellenberg, H Bourhy, W Schaftenaar, J Groen, and A.D.M.E.O (2000), "Characterisation of a recently isolated lyssavirus in frugivorous zoo bats.", Archives of virology 145(9), pp 1919–1931 136 WHO (2011), "Ebola haemorrhagic fever" 137 2011 WHO (2011), "Global HIV/AIDS response", Progress report 129 138 WHO (2004), "WHO guidelines for the global surveillance of severe acute respiratory syndrome ( SARS )", Department of Communicable Disease 139 WHO guidelines for the global surveillance of severe acute respiratory syndrome: (2004) 140 Woo, P.C.Y (2005), "Differential Sensitivities of Severe Acute Respiratory Syndrome ( SARS ) Coronavirus Spike Polypeptide Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ( ELISA ) and SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein ELISA for Serodiagnosis of SARS Coronavirus Pneumonia Differential", Society 43(7), pp 3054–3058 141 X C Tang, J X Zhang, S Y Zhang, P Wang, X H Fan, L F Li, G Li, B Q Dong, W Liu, C L Cheung, K M Xu, W J Song, D Vijaykrishna, L L M Poon, J S M Peiris, G J D Smith, H Chen, and Y.G (2006), "Prevalence and genetic diversity of coronaviruses in bats from China", Journal of virology 80(15), pp 7481–7490 142 Xingtai Wang, Barbara G Werner, Raimond Konomi, Dennis Hennigan, David Fadden, Evan Caten, Susan Soliva, and A.D (2009), "Animal rabies in Massachusetts, 1985-2006", Journal of wildlife diseases 45(2), pp 375–387 143 Yan Li, J.W (2008), "Antibodies to Nipah or Nipah-like Viruses in Bats , China", Emerging Infectious Diseases 14(12), pp 1974–1976 144 Yoshihito Kashiwazakia, Yeoh No Na, Nobuhiko Tanimura, T.I (2004), "Short communication A solid-phase blocking ELISA for detection of antibodies to Nipah virus", Journal of virological methods 121pp 259– 261 145 Zhang H, Yang X, L.G (1998), Detection of dengue virus genome RNA in some kinds of animals caught from dengue fever endemic areas in Hainan Island with reverse transcription-polymerase chain reaction Zhonghua shi yan he lin chuang bing du xue za zhi = Zhonghua shiyan he linchuang bingduxue zazhi = Chinese journal of experimental and clinical virology 146 (2005), "Chiroptera", http://tolweb.org/Chiroptera 130 147 (2009), "The significance of zoonostic transmission of virus in human disease", Microbiology today, (2008), pp 213–214 131 Ngày vấn (ngày/tháng/năm) Họ tên Giới tính Ngày sinh (ngày/tháng/năm) Nơi sinh: Địa chỉ: Số điện thoại liên lạc 1) Bạn ăn thịt Dơi chưa? 2) Nếu có, bạn có ăn thường xuyên không? 3) Bạn ăn thịt Dơi đâu? 4) Lượng Dơi tiêu thụ nhiều nào? 5) Bạn tự chế biến thịt Dơi chưa? 6) Nếu có, có thường xun khơng? 7) Bạn mua thịt Dơi từ đâu? 8) Bạn uống máu Dơi chưa? 9) Nếu có, có thường xun khơng? 10) Tại bạn lại ăn thịt Dơi? 11) Tại bạn lại uống máu Dơi? 12) Bạn bị Dơi cắn chưa? 13) Bạn có sử dụng phân Dơi làm phân bón hay khơng? 14) Nếu có, bạn sử dụng nào? 15) Bạn có biết Dơi lồi truyền nhiều bệnh nguy hiểm hay khơng? 16) Bạn ăn thịt thú rừng chưa? 17) Nếu có, loại thú nào? 132 PHỤ LỤC Cơng thức tính TCID50 theo phƣơng pháp Reed-Muench: Pha loãng virut CPE(+) CPE(-) ∑ CPE(+) ∑ (-) Tỷ lệ (%) TCID50 -5- (75-50)/(75-0) = -5-25/75 = -5-0.33 =-5.33 5.33 10 TCID50/0.1mL = 10 6.33 TCID50/mL 105.33 TCID50/0.1mL † 200 TCID50/0.1mL = x 102.33 = x 213.8 = 1069 x độ pha loãng Trong trƣờng hợp virut gốc là: 10 6.33 TCID50/mL (=105.33 TCID50/0.1mL ) độ pha loãng virut 1069x để đạt đƣợc 200 TCID 50/0.1mL) cho NT50 133 1:10 (-) (-) (-) Cơng thức tính NT50 theo phƣơng pháp Reed-Muench: Pha loãng huyết CPE(+) (-) ∑ CPE(+) ∑ (-) Tỷ lệ (%) 40 = 10 x 22 80 = 10 x 23 -2- (66.7-50)/(66.7-0) = -2-16.7/66.7 = -2-0.25 = -2.25 10 x 22.25 NT50 = 10 x (100.3)2.25 = 10 x 100.675 = 101.675 = 47.3 134 Phụ lục Một số hình ảnh loài dơi thu thập nghiên cứu Dơi vách mũi dài Pipistrellus cadornae thuộc Họ Dơi muỗi Dơi nâu Scotophilus kuhli thuộc Họ Dơi muỗi 135 Dơi ma nam Megaderma spasma thuộc Họ Dơi ma Dơi thị Charephone plicata thuộc Họ Dơi thị 136 Dơi nếp mũi quạ Hipposideros armiger thuộc Họ Dơi nếp mũi Dơi nếp mũi Hipposideros cineraceus thuộc Họ Dơi nếp mũi 137 Dơi cáo nâu Rousettus leschenaulti thuộc Họ Dơi ăn Dơi chó cánh dài Cynoterus sphinx thuộc Họ Dơi ăn 138 Thu thập mẫu máu dơi thực địa Mẫu huyết dơi dƣơng tính với ELISA 139 140 ... NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SỰ LƢU HÀNH CỦA MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH CHO NGƢỜI TRÊN DƠI Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH MÃ SỐ : VI SINH VẬT HỌC :62424001 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa... hƣơng số 18 loài linh trƣởng [29,34] Sự liên quan SARS-CoV; virus Dại gây bệnh cho ngƣời virus Corona; virus gây bệnh dại số loài dơi đặc trƣng cho thấy có đồng tiến hóa số loại virus vật chủ dơi. .. bệnh nhiễm trùng nguyên virus Việt Nam thực đề tài ? ?Nghiên cứu lƣu hành số virus gây bệnh cho ngƣời dơi Việt Nam? ?? Với mục tiêu cụ thể sau: - Xác định dấu vết kháng thể kháng virus Nipah, SARS-CoV,