Phân Lập Và Ly Trích Enzyme Amylase Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ HOÀNG ANH PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH ENZYME AMYLASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS Luận văn tốt nghiệp Ngành: TRỒNG TRỌT Cần Thơ, 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: TRỒNG TRỌT Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH ENZYME AMYLASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS Giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Phước Nhẫn Sinh viên thực hiện: Lê Hoàng Anh MSSV: 3060555 Lớp: Trồng Trọt K32 Cần Thơ, 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành trồng trọt với đề tài: “PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH ENZYME AMYLASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS” Do sinh viên LÊ HỒNG ANH thực kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009 Cán hướng dẫn Ts Phạm Phước Nhẫn ii TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG Luận văn tốt nghiệp kèm theo với đề tài:“PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH ENZYME AMYLASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS”, sinh viên HUỲNH THỊ NHANH thực bảo vệ trước Hội Đồng chấm luận văn tốt nghiệp thông qua Luận văn tốt nghiệp Hội Đồng đánh giá mức:………………………… Ý kiến Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:…………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009 Duyệt Khoa Chủ tịch Hội đồng Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố cơng trình luận văn trước Tác giả luận văn Lê Hoàng Anh iv TIỂU SỬ CÁ NHÂN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC Họ tên: LÊ HOÀNG ANH Năm sinh:1988 Nơi sinh: Hội An Đơng, Lấp Vị, Đồng Tháp Họ tên cha: Lê Hoàng Tâm Nghề nghiệp: Làm ruộng Họ tên mẹ: Nguyễn Thị Anh Đào Nghề nghiệp: Làm ruộng Chỗ nay: ấp An Phú, xã Hội An Đông, huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp II Q TRÌNH HỌC TẬP 1994 - 1999: học tiểu học Trường tiểu học Hội An Đơng, xã Hội An Đơng, huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp 1999 - 2003: học trung học Trường trung học sơ Hội An Đông, huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp 2003 - 2006: học phổ thơng Trường trung học phổ thơng Lấp Vị 1, thị trấn Lấp Vò, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp 2006 - 2010:học đại học Trường Đại học Cần Thơ, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ v LỜI CẢM ƠN Chân thành biết ơn: Cha mẹ gia đình chỗ dựa vững chắc, nguồn động lực mạnh mẽ đời Thầy Phạm Phước Nhẫn tất thầy hướng dẫn, bảo truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt trình thực đề tài Chị Đỗ Thị Hồng, anh Huỳnh Văn Trung, anh Nguyễn Trọng Cần tận tình giúp đỡ giải đáp khó khăn Đồng gởi lời cảm ơn đến tất thầy anh, chị Phịng thí nghiệm Sinh hóa, mơn Sinh Lý – Sinh Hóa, khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng Các bạn sinh viên lớp Cơng nghệ Hóa Khóa 30 đặc biệt nhóm bạn làm luận văn chung ln gắn bó, động viên, chia sẻ khó khăn vui, buồn suốt trình học tập làm luận văn Và gửi lời biết ơn chân thành đến quý thầy cô Bộ môn Khoa học trồng tất thầy cô trường Đại Học Cần Thơ tận tình giảng dạy, bảo kiến thức bổ ích phục vụ cho luận văn công việc tương lai Mặc dù cố gắng không tránh khỏi nhiều sai sót, mong q thầy dẫn thêm vi LÊ HOÀNG ANH, 2010 Phân lập đánh giá khả tạo amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis Luận văn tốt nghiệp ngành Trồng Trọt Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại Học Cần Thơ, 44 trang Cán hướng dẫn: Ts Phạm Phước Nhẫn TĨM LƯỢC Amylase nhóm enzyme sử dụng để đường hóa tinh bột nhiều lĩnh vực như: công nghệ sản xuất rượu bia, công nghệ thực phẩm,… Enzyme có từ nhiều nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vật Trong nguồn thu nhận amylase từ vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn có nhiều ưu điểm vi khuẩn có khả sinh trưởng phát triển nhanh nấm mốc nấm men Trong hướng nghiên cứu sản xuất amylase từ vi khuẩn, Bacillus subtilis đối tượng có nhiều triển vọng B subtilis có khả sản xuất amylase với hoạt tính cao amylase từ vi khuẩn B subtilis có nhiệt độ thích hợp cao loại amylase từ nguồn vi khuẩn khác Vì vậy, đề tài “Phân lập ly trích enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis” cần thiết nhằm phân lập thử nghiệm khả sản xuất amylase từ vi khuẩn B subtilis từ tự nhiên Nhằm phân lập đánh giá khả tạo amylase B subtilis, đề tài thực phân lập B subtilis từ mẫu đất rễ cà chua khỏe có nhiễm bệnh héo xanh (do Ralstonia solanacearum) Sau nuôi thử nghiệm hai môi trường lỏng nhằm xác định môi trường tối ưu Dùng (NH4)2SO4 60% để kết tủa protein, thẩm tích với dung dịch phosphate pH 7, sau đơng khơ để thu lượng protein thơ có chứa enzyme amylase, hoạt tính amylase đánh giá qua khả phản ứng thủy phân hồ tinh bột Kết phân lập tách ròng vi khuẩn B subtilis từ mẫu đất rễ cà chua Ly trích enzyme amylase từ vi khuẩn B subtilis Xác định hàm lượng protein hòa tan cao 37,2% hỗn hợp protein – amylase ly trích Xác định hoạt tính enzyme amylase từ hỗn hợp protein trích với nồng độ tinh bột bị thủy phân đạt tối đa 82,91% Kết thí nghiệm cho thấy B subtilis vi khuẩn tiềm để ly trích amylase xii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC DANH SÁCH BẢNG v DACH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC PHỤ LỤC vii MỞ ĐẦU xiii CHƯƠNG I: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE 1.1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme amylase nước ngồi nước 1.1.2 Giới thiệu tổng quan enzyme enzyme amylase 1.1.3 Phân loại enzyme amylase 1.1.4 Nguồn amylase từ sinh vật 11 1.1.5 Ứng dụng enzyme amylase 12 1.1.6 Giới thiệu chế phẩm thương mại enzyme amylase 15 1.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS 16 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Thời gian địa điểm 18 2.1.2 Vật liệu dụng cụ 18 2.1.3 Các môi trường nuôi cấy vi khuần Bacillus subtilis 18 xiii 2.1.4 Hóa chất 19 2.1.5 Xử lý số liệu 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP 20 2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập nhân nguồn vi khuẩn vùng rễ Bacillus subtilis 20 2.2.2 Thí nghiệm 2: Ly trích thử hoạt lực enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 PHÂN LẬP BACILLUS SUBTILIS 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 26 3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào 26 3.1.3 Mật số Bacillus subtilis 27 3.1.4 Trữ nguồn 30 3.2 LY TRÍCH VÀ THỬ HOẠT LỰC CỦA ENZYME AMYLADE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 30 3.2.1 Xác định hàm lượng protein hịa tan có mẫu protein ly trích từ vi khuẩn Bacillus subtilis hai môi trường 33 3.2.2 Thử hoạt lực enzyme amylase phản ứng thủy phân hồ tinh bột 35 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC xiv CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận chung sau: - Từ đất lúa khỏe ruộng có nhiễm đốm vằn (do nấm Rhizoctonia solani) phân lập khuẩn lạc Bacillus subtilis có hoạt tính enzyme amylase - Môi trường tốt để Bacillus subtilis phát triển sinh enzyme tốt môi trường có bổ sung CaCO3 - Bước đầu xác định hoạt tính enzyme amylase trích từ vi khuẩn Bacillus subtilis Đề nghị - Tìm pH nhiệt độ tối ưu cho Bacillus subtilis phát triển cho enzyme có hoạt tính cao - Tìm phương pháp trích enzyme amylase từ Bacillus subtilis rẻ tiền - Xác định tỷ lệ enzyme amylase có mẫu trích enzyme amylase chuẩn - Tinh nguồn enzyme trích từ vi khuẩn 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đoàn Thị Kim Hoàn (2008) Ảnh hưởng gibberelin lên nảy mầm tổng hợp enzyme amylase hột lúa Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học Khoa Nộng Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, Đại Học Cần Thơ Hồng Kim Anh, Ngơ Kế Sương Nguyễn Thị Phương Thủy (1998) Thu nhận enzyml amylase từ nấm mốc Aspergillus sp Tài liệu khoa học công nghệ Trang: 319 – 325 Nguyễn Văn Mùi (2001) Thực hành Hóa sinh học.Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội Trang: 156 - 157 Lương Đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Nông nghiệp I, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng cộng tác viên (2004) Công nghệ enzym Nhà Xuất Bản Đại học quốc gia Tp.HCM Nguyễn Đức Lượng (2006) Vi sinh vật công nghiệp (Công nghệ vi sinh Tập 2) Nhà Xuất Bản Đại học quốc gia Tp.HCM Nguyễn Tiến Thắng (2008) Giáo trình cơng nghệ enzym Trường Đại học Kỹ thuật cơng nghệ Tp.HCM Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007 Công nghệ sinh học, Tập ba: Enzyme ứng dụng Nhà Xuất Bản Giáo Dục Phạm Văn Kim (2000) Giáo trình vi sinh học đại cương Bộ Mơn Bảo vệ Thực Vật Trường Đại Học Cần Thơ Trần Đình Mẫn, Nguyễn Kim Thoa, Lương Đức Phẩm, Lê Văn Nhương (2004) Ảnh hưởng số yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp α-amylase chịu nhiệt chủng tái tổ hợp B.subtilis 168M [pHV33-BL.amy.BSPr] Tạp chí Khoa học Công nghệ, vol42 – No Trang: 7-12 Trần Xuân Ngạch (2007) Công nghệ enzyme Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng 39 Vũ Thị Yến (2008) Xác định phương pháp ly trích ảnh hưởng pH, nhiệt độ, chất hoạt hóa đến hoạt tính enzyme amylase tụy heo Luận văn tốt nghiệp Cơng Nghệ Hóa Tiếng Anh Bernfeld, P (1955) Amylase, α and β Department of Chemistry, University of Warwick, United Kingdom Page: 149 - 159 Coleman, G and W H Elliott 1965 Extracellular ribonuclease formation in Bacillus subtilis and its stimulation by actinomycin Edinberg University Page: 699 706 Fisher, E H and Stein, E A (1960) α-Amylase, In: The Enzyme Academic Press Inc New York Page: 313 - 143 Manas R S., Shaktimay K., Gourikutti P and Ramesh C R (2006) Partial characterization and optimization of production of extractcellular amylase from B.subtilis isolated from culturable cow dung microflora Polish Fournal of microbiology, Vol.55, No Page: 289 - 296 Priest, F.G and Grigorova, R (1991) Method for studying the ecology of endospore – forming bacteria Laboratory of Renewable Resources Engineering and Department of Agricultural and Biological Engineering, Purdue University, West Lafayette, USA Page: 565 – 591 Reyed, M R (1940) Biosynthesis and Properties of Extracellular Amylase by Encapsulation Bifidobatrium bifidum in Batch Culture Faculty of Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics, National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, Bangalore, India Rosovitz, M J., Voskuil, M I., Chambliss, G H (1998) Bacillus In: A Balows and B I Duerden (Eds), Systematic Bacteriology Arnold Press, London: 709 – 720 Schallemey, M., Singh, A., and Ward, O P (2004) Developments in these of Bacillus species for industrial production Can J Microbiol 50, – 17 40 PHỤ LỤC Bảng phụ lục Bảng 1: Bảng phân tích phương sai so sánh mật độ vi khuẩn nghiệm thức mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 83,333 27,778 19,608 0,0005 Sai số 11,333 1,477 Tổng cộng 11 94,667 CV = 5,83% Bảng 2: Bảng phân tích phương sai so sánh mật độ vi khuẩn nghiệm thức môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 94,250 31,417 23,562 0,0003 Sai số 10,667 1,333 Tổng cộng 11 104,917 CV = 6,30% Bảng 3: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng protein nghiệm thức môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,008 0,003 7,596 0,0100 Sai số 0,003 0,001 Tổng cộng 11 0,011 CV = 5,67% xv Bảng 4: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng protein nghiệm thức mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,005 0,002 5,370 0,0255 Sai số 0,003 0,001 Tổng cộng 11 0,008 CV = 6,18% Bảng 5: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng protein nghiệm thức môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,005 0,002 5,370 0,0255 Sai số 0,003 0,001 Tổng cộng 11 0,008 CV = 6,18% Bảng 6: Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme nghiệm thức mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,476 0,159 115,076 0,0632 Sai số 0,011 0,001 Tổng cộng 11 0,487 CV = 6,22% xvi Bảng 7: Bảng phân tích phương sai so sánh hoạt tính enzyme nghiệm thức mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,707 0,236 404,424 0,0001 Sai số 0,005 0,001 Tổng cộng 11 0,713 CV = 3,66% Bảng 8: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng protein nghiệm thức ngày môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,002 0,002 6,556 0,0626 Sai số 0,001 0,001 Tổng cộng 0,003 CV = 5,65% Bảng 9: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng protein nghiệm thức ngày môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa -Nghiệm thức 0,002 0,002 34,894 0,0041 Within 0,000 0,001 -Tổng cộng 0,002 CV = 2,62% xvii Bảng 10: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng protein nghiệm thức ngày môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,008 0,008 15,969 0,0162 Sai số 0,002 0,001 Tổng cộng 0,01 CV = 6,47% Bảng 11: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng protein nghiệm thức 11 ngày môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa -Nghiệm thức 0,001 0,001 1,943 0,2358 Sai số 0,002 0,001 -Tổng cộng 0,003 CV = 5,20% Bảng 12: Bảng phân tích phương sai so sánh mật độ vi khuẩn nghiệm thức ngày mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa -Nghiệm thức 2,667 2,667 4,000 0,1161 Sai số 2,667 0,667 -Tổng cộng 5,333 CV = 3,62% xviii Bảng 13: Bảng phân tích phương sai so sánh mật độ vi khuẩn nghiệm thức ngày mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa -Nghiệm thức 32,667 32,667 12,250 0,0249 Sai số 10,667 2,667 -Tổng cộng 43,333 CV = 4,84% Bảng 14: Bảng phân tích phương sai so sánh mật độ vi khuẩn nghiệm thức ngày môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 2,667 2,667 2,286 0,2051 Sai số 4,667 1,167 Tổng cộng 7,333 CV = 3,46% Bảng 15: Bảng phân tích phương sai so sánh mật độ vi khuẩn nghiệm thức 11 ngày môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 1,500 1,500 1,500 0,2879 Sai số 4,000 1,000 Tổng cộng 5,500 CV = 6,18% xix Bảng 16: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng tinh bột bị thủy phân nghiệm thức ngày mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,026 0,026 31,578 0,0049 Sai số 0,003 0,001 -Tổng cộng 0,029 CV = 4,83% Bảng 17: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng tinh bột bị thủy phân nghiệm thức ngày mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,124 0,124 133,785 0,0003 Sai số 0,004 0,001 Tổng cộng 0,128 CV = 4,59% Bảng 18: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng tinh bột bị thủy phân nghiệm thức ngày môi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,123 0,123 143,028 0,0003 Sai số 0,003 0,001 Tổng cộng 0,126 CV = 4,27% xx Bảng 19: Bảng phân tích phương sai so sánh hàm lượng tinh bột bị thủy phân nghiệm thức 11 ngày mơi trường Nguồn Độ Tổng Trung bình Mức biến động tự bình phương bình phương F-tính ý nghĩa Nghiệm thức 0,112 0,112 92,942 0,0006 Sai số 0,005 0,001 -Tổng cộng 0,117 CV = 5,57% xxi Hình phụ lục Hình 1: Đồ thị đường chuẩn đo hàm lượng theo phương pháp Folin – Lowry Hình 2: Đồ thị đường chuẩn hấp thụ theo nồng độ tinh bột khác xxii Cân Máy đo pH Máy ly tâm lạnh phân tích Máy quang phổ UV-vis Túi thẩm tích Máy đơng Máy lắc Hình 3: Một số thiết bị dùng phịng thí nghiệm xxiii Cách pha hóa chất * Dung dịch đệm Na2HPO4 - KH2PO4 theo Sorensen (pH =7) Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15 M: 23,9 g Na2HPO4.12H2O hoà tan dẫn nước đến 1000 ml dung dịch a Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15 M: 9,07 g KH2PO4 hoà tan dẫn nước đến 1000 ml dung dịch b Dung dịch đệm phosphate có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) pH a b 612 388 (Nguyễn Văn Mùi, 2001) * Dung dịch HCl 0,25N: Cho vao bình định mức 100ml 8,4ml HCl đặc 37%, thêm nước cất đến vạch, lắc dung dịch HCl 1M Từ dung dịch HCl 1M pha với nước theo tỉ lệ 1:3 * Dung dịch I2 10mM: Hòa tan 0,254g I2 0,5g KI lượng nhỏ nước, lắc nhẹ Chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml, dùng nước cất dẫn thể tích đến vạch dung dịch Iodine gốc 10mM * Hồ tinh bột 1‰: Hòa tan 0,1g tinh bột (theo chất khô tuyệt đối) với 50ml nước cất bình định mức 100ml, lắc Đặt vào bếp cách thủy sôi, lắc liên tục tinh bột hịa tan hồn tồn Bổ sung nước đến vạch mức, lắc Chuẩn bị dung dịch tinh bột dùng ngày * Folin 0,25N: hòa tan Folin 1N với nước tỉ lệ 1:3 Phương pháp phân tích protein tổng phương pháp Folin-Lowry Nguyên tắc: Cơ sở việc định lượng protein theo phương pháp Lowry dựa vào phản ứng màu protein với thuốc thử Folin tạo thành phức chất có màu xanh hấp thu cực đại bước sóng 750 nm Cường độ màu dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein Phương pháp có độ nhạy cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục microgram protein Hố chất: xxiv - Dung dịch albumin huyết bị (BSA – bovine serum albumin) mg /ml pha dung dịch NaCl 0,9% - Dung dịch A: Na2CO3 2% NaOH 0,1N - Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5% kali natri tartrat 1% - Dung dịch C: Pha dung dịch A B theo tỉ lệ thể tích 50:1 trước dùng - Thuốc thử Folin 1N: + Natri tungstate (NaWO4¬.2H2O): 100g + Natri molypdate (Na¬2MoO4.2H2O): 25g + Nước cất: 700 ml Cho vào bình cầu đun cho tan bổ sung thêm: + Acid phosphoric 85%: 50 ml + Acid chlohydric đậm đặc: 100 ml Đun sôi hỗn hợp ống sinh hàn 10 Dung dịch trở thành màu vàng hay xanh thẫm Tiếp tục cho thêm: + Liti sulphat LiSO4: 150 g + Brom: giọt + Nước cất : 50 ml Đun sơi 15 phút Dung dịch thu có màu vàng sáng Nếu dung dịch có màu xanh phải xử lý với brom lần thứ hai Sau làm nguội thêm nước cất đến lít Xác định lại nồng độ thuốc thử Folin cách chuẩn độ với NaOH 1N với thị phenolphtalein Chứa dung dịch chai nâu, bảo quản tủ lạnh Dung dịch gốc có nồng độ 1N, trước dùng phải pha lỗng thuốc thử nước cất đến nồng độ 0,5N (Nguyễn Văn Mùi, 2001) xxv Cách sử dụng máy đo quang phổ (Thermospectronic Heλios α) Bước 1: Khởi động máy tính, bật phần mềm Version Bước 2: Bật cơng tắc máy quang phổ trước đo mẫu 15 phút Bước 3: Chọn cơng cụ phân tích (Scan - Fixed – Quant – Rate) Bước 4: Nhấp double vào vị trí cell hình để chọn “ON” Bước 5: Cài đặt thông số tương ứng với công cụ chọn bước (bước sóng, số lượng mẫu đo, số lần lặp lại) Bước 6: Đặt mẫu vào vị trí để cell máy quang phổ Bước 7: Nhấp “RUN” “CALIBRATE” để đo mẫu xxvi ... từ vi khuẩn Bacillus subtilis? ?? cần thiết nhằm phân lập thử nghiệm khả sản xuất amylase từ vi khuẩn B subtilis từ tự nhiên Nhằm phân lập đánh giá khả tạo amylase B subtilis, đề tài thực phân lập. .. khả tạo amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis? ?? cần thiết nhằm mục đích phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis đánh giá khả tổng hợp α -amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập CHƯƠNG I LƯỢC... chứa enzyme amylase, hoạt tính amylase đánh giá qua khả phản ứng thủy phân hồ tinh bột Kết phân lập tách ròng vi khuẩn B subtilis từ mẫu đất rễ cà chua Ly trích enzyme amylase từ vi khuẩn B subtilis