Trong nghiên cứu này, chiết xuất lá chanh tây bằng methanol (MLL) đã được đánh giá về hoạt tính chống ung thư của nó trong tế bào gốc ung thư vú MCF-7-SC kháng anoikis. MLL gây ra sự chết tế bào (apoptosis) trong MCF-7-SC được chứng minh bằng sự gia tăng sự hình thành cơ thể apoptotic, tăng số lượng tế bào G1, tăng tế bào dương tính với Annexin V, tăng tỷ lệ Bax / Bcl-2, kích hoạt protein của caspase-9 và caspase- 3, và sự thoái biến của protein poly (ADP-ribose) polymerase (PARP).
Tạp chí Khoa học – Trường Đại học Phú Yên, Số 24 (2020), 11-19 11 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ VÚ CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CHANH TÂY (Citrus Limon L.) Nguyễn Thị Thảo Linh* Trường Đại học Phú Yên Ngày nhận bài: 06/05/2020; ngày nhận đăng: 04/06/2020 Tóm tắt Dịng tế bào gốc ung thư vú MCF-7-SC, phân lập từ tế bào ung thư vú MCF-7, cho thấy đặc điểm kháng anoikis Trong nghiên cứu này, chiết xuất chanh tây methanol (MLL) đánh giá hoạt tính chống ung thư tế bào gốc ung thư vú MCF-7-SC kháng anoikis MLL gây chết tế bào (apoptosis) MCF-7-SC chứng minh gia tăng hình thành thể apoptotic, tăng số lượng tế bào G1, tăng tế bào dương tính với Annexin V, tăng tỷ lệ Bax / Bcl-2, kích hoạt protein caspase-9 caspase- 3, thoái biến protein poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) Tóm lại, nghiên cứu chứng minh cho thấy chanh tây gây độc tính cho tế bào gốc ung thư vú kháng anoikis coi thuốc dùng để điều chế thuốc thực phẩm chức chống ung thư Từ khóa: Kháng anoikis Apoptosis Tế bào gốc ung thư Lá chanh tây Đặt vấn đề Các biện pháp can thiệp thông thường, chẳng hạn xạ trị hóa trị, loại bỏ phần lớn khối u, tế bào ung thư ác tính lại có khả đặc biệt để sống sót, tự tái tạo cải thiện khối u ác tính Gần đây, tế bào khối u cịn sót lại phát có đặc tính giống tế bào gốc gọi tế bào gốc ung thư (CSCs) (Siegel R, 2013) Do đó, việc tiêu diệt CSCs khối u bước quan trọng để ngăn chặn tiến triển tái phát bệnh Mặc dù nỗ lực không ngừng để chống lại ung thư nhiều thập kỷ, ung thư vú nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai phụ nữ (Reya T, 2001) tế bào gốc ung thư vú, đặc trưng biểu dấu hiệu bề mặt CD44high / CD24low, cho nguyên nhân tiến triển di ung thư vú (Al-Hajj M, 2003) Dòng tế bào MCF-7-SC phân loại từ tế bào ung thư vú người MCF-7 thơng qua việc tích lũy quần thể CD44high / CD24low (Phuc PV, 2010) MCF-7-SC báo cáo có chứa đặc điểm CSCs kháng thuốc xâm nhập (Tran TA, 2014) nghiên cứu để tìm kiếm mục tiêu cụ thể tế bào gốc ung thư vú (Tran TA, 2014) Nổi bật số chế kháng thuốc độ đặc hiệu rộng hệ thống vận chuyển họ ATP-binding cassette (ABC), bao gồm bao gồm P-glycoprotein (Chen CJ, 1986), liên quan đến đa kháng thuốc protein (Cole SPC, 1992) protein kháng ung thư vú (BCRP / MXR / ABCP / ABCG2) (Allen JD, 1999) Biểu mức hệ thống vận chuyển ABC tế bào ung thư dẫn đến đa kháng thuốc cách hạn chế tích lũy nội bào tác nhân gây độc tế bào thông qua việc loại bỏ tác nhân (Seamon JA, 2006) Anoikis dạng chết tế bào (apoptosis) tế bào tách rời * Email: thaolinh180989@gmail.com 12 Journal of Science – Phu Yen University, No.24 (2020), 11-19 tách khỏi môi trường ngoại bào xung quanh Kháng anoikis biết đến chế dẫn đến kháng thuốc Tuy nhiên, tìm kiếm hóa chất thực vật ức chế hoạt động tế bào gốc kháng anoikis chế thật chưa khám phá đầy đủ Trong nhiều năm, apoptosis cho chế tác nhân hóa trị liệu tiêu diệt tế bào Đây hình thức chết tế bào lập trình bảo tồn cao, điều chỉnh cân nội mô loại bỏ tế bào bị hư hỏng bị nhiễm bệnh Có hai đường apoptotic tồn tại: đường bên ngồi kích hoạt thụ thể gây chết đường bên kích hoạt ty thể (Morselli E, 2009) Những đường truyền tín hiệu apoptotic dẫn đến việc kích hoạt caspase, cysteine protease tách rời chất khác Con đường bên apoptosis kích hoạt điều kiện khác nhau, bao gồm tổn thương DNA, kích hoạt gây ung thư, kích thích oxy hóa, thiếu oxy dạng kích thích khác Những năm gần đây, thực vật xem nguồn hợp chất có hoạt tính sinh học quý giá cho người động vật, có tiềm lớn để sử dụng việc phát loại thuốc (Pellegrini NM, 2007) Trái có múi có hoạt tính chống oxy hố cao (Chun OKY, 2008) chứa nhiều flavonoid, vitamin C carotenoids (Xu G, 2008) Có nhiều bioflavonoids Chanh tây (Citrus limon) hesperidin, rutin naringin, chất kích hoạt hoạt động thuốc thể (Tripoli E, 2007) Trái họ cam quýt, đặc biệt Chanh tây khoa học chứng minh có nhiều lợi ích cho sức khoẻ hạn chế nguy mắc bệnh phong phú vitamin, khoáng chất thành phần khác (Peterson OA, 2006) Chanh tây trồng nhiều nơi giới để sản xuất nước ép chanh chứng minh có khả chống nấm chống ung thư (Viuda MM, 2008) (Arias BA, 2005) Trong hạt chanh tây vỏ chanh tây chứng minh hoạt tính chống oxy hố chống ung thư (Im JS, 2014) (Banjerdpongchai R, 2016), (Pagliara V, 2019) nghiên cứu dược tính chanh tây cịn hạn chế Do đó, mục đích nghiên cứu khảo sát tiềm chống ung thư, đặc biệt ung thư vú, chanh tây Kết cho thấy dịch chiết chanh tây methanol (MLL) ức chế sản sinh tế bào MCF-7-SC thông qua việc gây chết tế bào (apoptosis) Đồng thời, ức chế tăng sinh MCF-7-SC MLL cách hữu hiệu để tiêu diệt tế bào gốc kháng anoikis, tác nhân gây nên di ung thư vú Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Trích xuất chuẩn bị mẫu Lá chanh tây sấy khô (1200 g) nghiền thành bột, sử dụng máy xay chiết 80% methanol cách khuấy ngày nhiệt độ phịng Dịch chiết lọc, đặc thiết bị bay quay chân không áp suất giảm 40 oC đông khô để thu cao chiết metanol thô (27,0 g) Cao chiết làm lạnh (4ºC) trước sử dụng Cao chiết hòa tan DMSO (Dimethyl Sulfoxide) đến nồng độ 100 g/mL thí nghiệm 2.2 Ni cấy tế bào thuốc thử Tế bào gốc ung thư vú MCF-7-SC người chọn từ tế bào MCF-7 thơng qua việc tích lũy quần thể CD44high / CD24low sau phân loại tế bào (Phuc PV, 2010) MCF-7-SC nuôi cấy môi trường RPMI-1640 MCF-7 nuôi cấy hỗn hợp môi trường DMEM F-12K Môi trường nuôi cấy bổ sung 10% huyết bào thai bất Tạp chí Khoa học – Trường Đại học Phú Yên, Số 24 (2020), 11-19 13 hoạt nhiệt (FBS) 1% kháng sinh Tất tế bào trì 37oC tủ ấm độ ẩm với 5% CO2 Môi trường RPMI 1640, albumin huyết bò, axit trypsin /ethylenediaminetetraacetic, huyết bò bào thai (FBS) kháng sinh Antimycotic 100X, F-12K DMEM mua từ Invitrogen (Hoa Kỳ) Hoechst 33342, Dimethyl sulfoxide (DMSO), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), propidium iodide, RNase A, kháng thể kháng-actin mua từ Sigma Công ty (Hoa Kỳ) Cao chiết chanh tây methanol hòa tan DMSO Các kháng thể mua từ công ty Cell Signaling (Hoa Kỳ) Các màng polyvinylidene fluoride để làm thí nghiệm western blot mua từ Millipore (Hoa Kỳ) 2.3 Xét nghiệm kháng anoikis Để kiểm tra tính kháng anoikis tế bào, phương pháp lựa chọn tế bào kháng anoikis đề cập Su X et al (2009) áp dụng Sau đó, khả sống tế bào xác định cách ủ tế bào thuốc nhuộm Trypan Blue 0,4% đếm dụng cụ buồng đếm 2.4 Phản ứng chép chuỗi polymerase ngược (RT-PCR) Toàn RNA từ dòng tế bào chiết xuất thuốc thử TRIzol (Invitrogen) Sao chép ngược thực reverse transcription system (Promega, USA) Các mồi phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để khuếch đại sau: ABCG2, forward 5'CCGCGACAGCTTCCAATGACCT-3', reverse 5'-GCCGAAGAGCTGCTGAGAACT GTA-3'; GAPDH, forward 5'-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3', reverse 5'-AGTGA TGGCATGGACTGTGG-3' RT-PCR thực Taq polymerase (iNtRON Inc., Hàn Quốc) PCR bắt đầu cách ủ mẫu 95oC phút, sau 35 chu kỳ 40 giây denaturation 95oC, annealing 40 giây 57oC phút elongation 72oC Các mẫu phân tích điện di Gel agarose 1,2% chứa 0,002% thuốc nhuộm (RedSafeTM; Biotechnology Inc., Korea) 2.5 Xét nghiệm khả sống tế bào Các tế bào nuôi cấy đĩa 96 giếng 200 µL mơi trường chứa 10% FBS bất hoạt nhiệt Sau xử lý, 20 µL thuốc thử MTT (5 mg / mL) thêm vào tế bào ủ - Sau phần dịch phía loại bỏ khỏi giếng 150 µL DMSO thêm vào Tất thí nghiệm tiến hành bốn lần Khả sống tế bào xác định từ độ hấp thụ bước sóng 570nm, đo đầu đọc vi mạch Sunrise (Áo) Khả tồn tế bào hiển thị dạng phần trăm khả sống sót (trung bình ± SD) 2.6 Hình thái MCF-7-SC (3 × 104 tế bào / mL) gieo vào đĩa giếng xử lý thuốc thử 24 Sau 24 giờ, tế bào nhuộm 10 µM Hoechst acridine Orange (AO) sau quan sát kính hiển vi (Olympus, Essex, UK) 2.7 Phân tích tế bào học Để phân tích phân bố chu kỳ tế bào apoptosis, tế bào (3 × 104 tế bào / mL) nuôi cấy giếng xử lý MLL 24 Để phân tích chu kỳ tế bào, tế bào thu hoạch, rửa PBS, cố định 70% ethanol, bù nước mM EDTA-PBS (Axit Aminopolycarboxylic Phosphate-Buffered Saline Solution), xử lý RNase A (25 µg / mL) nhuộm màu PI (40 µg / mL) Một phát apoptosis Annexin V-FITC sử dụng để phát chuyển dịch 14 Journal of Science – Phu Yen University, No.24 (2020), 11-19 phosphatidylserine từ phía bên màng plasma sang phía bên ngồi theo cơng thức nhà sản xuất Tóm lại, tế bào rửa PBS, pha lỗng đệm liên kết annexin V có chứa annexin V PI, ủ 15 phút nhiệt độ phòng (RT) Các tế bào xử lý vòng Dữ liệu từ 10.000 mẫu phân tích với Phần mềm Cell-Quest (BD Bioscatics) Mỗi thí nghiệm lặp lặp lại ba lần 2.8 Western Blot Các tế bào ni cấy sau xử lý với nồng độ MLL định Sau đó, tế bào thu hoạch ly giải đệm RIPA giữ băng 30 phút Xét nghiệm BCA thực lượng mẫu protein nạp vào giếng Các phần lysate tách gel SDS-polyacrylamide chuyển đến màng PVDF cách sử dụng đệm chuyển glycine Sau ngâm với sữa không béo 5%, màng ủ qua đêm với kháng thể sau với kháng thể thứ cấp sữa có chứa nước muối Tris-buffered (TBS) 0,5% Tween 20 Tất kháng thể (với ngoại lệ kháng thể chống -actin) sử dụng với độ pha loãng 1: 1000 Các kháng thể thứ cấp chống -actin (Phịng thí nghiệm Vector, Hoa Kỳ) sử dụng với độ pha loãng 1: 10.000 Các dải protein phát WESTZOL® plus Western Blot Detection System (iNtRON, Hàn Quốc) Kết thảo luận 3.1 MCF-7-SC tế bào gốc kháng anoikis Bởi đặc điểm tế bào gốc báo cáo kháng anoikis, dòng tế bào mới, MCF-7-SC, thử nghiệm khả kháng anoikis MCF-7-SC hình thành cụm tế bào trôi bám vào thành nhiều cụm lớn MCF-7 đĩa ni cấy polyHema (Hình 1A B) Phương pháp lựa chọn tế bào kháng anoikis (Su X, 2009), áp dụng để kiểm tra loại bỏ tế bào chết, để lại nuôi cấy tế bào kháng anoikis Tỷ lệ tế bào chết giảm đáng kể xuống 6,42 6,67% MCF-7-SC thực chọn lọc chu kỳ thứ hai thứ ba (Hình 1C) Phát cho thấy MCF-7-SC tồn tốt tế bào MCF-7 môi trường nuôi cấy trôi cách bám vào Đặc trưng quan trọng tế bào kháng anoikis kháng thuốc Vì thế, kiểm tra mức độ mRNA ABCG2, điều dẫn đến kháng thuốc tế bào (Seamon JA, 2006) Nồng độ mRNA ABCG2 tế bào MCF-7-SC cao gấp lần tế bào MCF-7, MCF-7-SC dễ dàng kháng thuốc tế bào MCF-7 (Hình D) Những kết chứng minh dòng tế bào gốc ung thư vú MCF-7-SC có đặc tính kháng anoikis A B Tạp chí Khoa học – Trường Đại học Phú Yên, Số 24 (2020), 11-19 C 15 D Hình MCF-7-SC tạo thành tập hợp tế bào lớn có khả chống anoikis nhiều MCF-7 (A) Cùng số lượng tế bào (4 × 104 tế bào / mL) gieo vào đĩa ni cấy bình thường 24 sau tách trong đĩa ni cấy polyHema Hình thái tế bào kiểm tra kính hiển vi (độ phóng đại, 100X) (B) Số lượng tập hợp tế bào tách đĩa nuôi cấy polyHema tính cách sử dụng thiết bị buồng đếm (C) Các tế bào thu thập, cấy vào môi trường nuôi cấy đơn lớp phép phục hồi 24 sau 48 ủ polyHema Khả sống tế bào đánh giá nhuộm màu Trypan Blue sau chu kỳ (D) Mức độ mRNA ABCG2 phân tích RT-PCR Dữ liệu tương ứng với giá trị trung bình ± SD ba thí nghiệm độc lập Ý nghĩa thống kê, * p