Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Khóa: QH 2012.Y Người hướng dẫn: ThS Phạm Thị Hồng Nhung ThS BS Vũ Vân Nga HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy ln hướng dẫn bảo tận tình, cho tơi nhiều ý kiến nhận xét quý báu truyền đạt cho tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc q trình tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thị Thơm – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy tận tâm giúp đỡ trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận l ợi sẵn sàng giải đáp thắc mắc để tơi hồn thành khóa luận Để thực tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn tài trợ Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã s ố QG.16.23 Trong trình học tập, làm việc thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ thầy cô bạn sinh viên làm việc thực tập Phịng thí nghiệm Bộ mơn Y dược học sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, tồn thể thầy giáo Khoa Y dượ c - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2018 Nguyễn Thị Thùy Linh DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) ADN Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotide triphosphate DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng cao áp biến tính) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) HCTH Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát Kb kilobase (= 1000 bp) NCBI National Center for Biot chnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ S h học Quốc gia – Mỹ) NPHS2 Gen mã hóa cho prote n podocin NHLBI National Heart, Lung and Blood Instiute (Viện tim, phổi máu quốc gia) OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotit) SSCP Single strand conformation poly morphism (Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) STR Short Tandem Repeat (Các đoạn lặp ngắn) TAE Đệm Tris base/axit acetic/ EDTA UTR Untranslated region (Vùng không dịch mã) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng Trình tự mồi nhân dịng gen NPHS2 20 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR gen NPHS2 30 Bảng Tổng hợp SNP thuộc gen NPHS2 149 bệnh nhân 32 Bảng Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 nghiên cứu .33 Bảng Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 nghiên cứu 33 Bảng Tần số kiểu gen tần số alen SNP xuất alen đột biến 34 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư số nước Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH Hình 1.3 Gen NPHS2 protein podocin Hình 1.4 Tế bào biểu mơ có chân màng đáy cầu thận tương tác protein cấu tạo nên tế bào Hình 1.5 Các đột biến protein podocin mã óa gen NPHS2 10 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu 23 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số gel agarose 0,7% 25 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi exon gen NPHS2 27 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi exon gen NPHS2 28 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác exon gen NPHS229 Hình 3.5 Kết điệ n di s ản phẩm PCR exon gen NPHS2 sau tối ưu Hình 3.6 29 Một số kết giải trình tự gen NPHS2 31 Hình 3.7 Số lượng đột biến exon gen NPHS2 31 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT .3 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học 1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học 1.1.3 Biến chứng liệu pháp corticosteroid điều trị HCTHTP 1.1.4 Tổng quan gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát 1.2 TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trò gen NHPS2 .8 1.2.2 Đa hình di truyền gen NPHS2 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP .11 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN NUCLEOTIT 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Thiết bị 19 2.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Thu thập bảo quản mẫu sinh phẩm .20 2.2.2 Tách chiết kiểm tra chất lượng ADN tổng số .20 2.2.3 Nhân dòng exon gen NPHS2 PCR 21 2.2.4 Xác định kiểu gen exon gen NPHS2 giải trình tự 23 2.2.5 Xác định tần số SNP thuộc gen NPHS2 .23 2.3 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ .26 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ .26 3.2 NHÂN DÒNG EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR .26 3.3 XÁC ĐỊNH KIỂU GEN EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ .30 3.4 TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG NGHIÊN CỨU 33 CHƯƠNG BÀN LUẬN 34 VỀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH EXON ĐẦU CỦA GEN NPHS2 .34 4.2 VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TRÊN EXON …36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1 KẾT LUẬN 40 4.2 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) bệnh cầu thận mạn tính thường gặp trẻ em yếu tố nguy dẫn đến suy gi ả m chức thận [14, 65] Cho đến nay, phương pháp điều trị bệnh chủ yếu liệu pháp corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch ghép thận Theo tiêu chuẩn lâm sàng, HCTH phân loại dựa vào đáp ứng bệnh nhân với liệu pháp corticosteroid gồm hai nhóm: nhạy cảm kháng corticosteroid [14, 38] Phần lớn bệnh nhân mắc HCTHTP thường cảm thụ với liệu pháp này, nhiên việc điều trị kéo dài corticosteroid gây nhiều tác dụng phụ hội chứng Cushing, tăng huyết áp, đục thủ y tinh thể, glaucoma, loãng xương, chậm phát triển thể chất [12] Bên cạ h đó, tỉ lệ khơng nhỏ (10 – 20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP kháng corticosteroid có nguy cao tiến triển thành bệnh thận giai đoạn cuối [58] Nhiều trường hợp kháng corticosetorid chứng minh đột biến gen gây ảnh hưởng tới chức biệt hóa tế bào podo yte (tế bào biểu mơ có chân màng đáy cầu thận) Bệnh có tỷ lệ tái phát cao, diễn biến điều trị lâu dài tạo lo lắng, chán nản tiêu tốn nhiều tiền cho bệnh nhân gia đình người bệnh [6] Trên giới, nhi ều cơng trình nghiên cứu HCTHTP thực để xác định nguyên nhân, chế biểu bệnh tính di truyền bệnh Những nghiên cứu áp dụng tiến di truyền học phân tử vài năm qua chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng corticosteroid, đột biến gen NPHS2 mã hóa cho protein podocin đóng vai trị quan trọng [49, 60] Các nhà khoa học xác định tổng cộng 89 đột biến điểm exon củ a gen NPHS2, 56 đột biến tập trung từ exon đến exon ch ứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP [41] Vì vậy, việc xác định đột biến gen NPHS2 nhằm tìm hiểu mối liên quan di truyền vớ đáp ứng thuốc hỗ trợ bác sĩ lâm sàng định phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân, hạn chế nhiều biến chứng thuốc giảm chi phí điều trị [43] Đây xu hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền học phác đồ điều trị bệnh nhân Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu đa hình thái gen NPHS2 quy trình phân tích gen Từ nhu cầu lâm sàng tính cấp thiết nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đoán, điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, tiến hành đề tài “Phân tích gen NPHS2 mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát” Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền nằm exon đến exon thuộc gen NPHS2 bệnh nhân nhi mắ c HCTHTP Việt Nam Xác định tần số đa hình gen NPHS2 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việ t N m Nội dung nghiên cứu: Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dịng exon đến exon thuộc gen NPHS2 Giải trình tự xác định đa hình gen NPHS2 Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen tần số alen 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam nephrin tính tồn vẹn màng lọc cầu thận [37] Nghiên cứu chúng tơi tìm thấy xuất đột biến Các đột biến gen mã hóa protein podocin giữ lại mạng lưới nội chất đượ c chứng minh đột biến sai nghĩa khác như: p.P118L (c.353C> T), p.D160G (C.479A> G), p.R168S (c.502C> A), p.R168C (c.502C> T), p.R168H (C.503G> A), p.V260E (c.779T> A) [62] Mặt khác, số đột biến sai nghĩa dẫn đến đột biến podocin nhắm mục tiêu vào màng tế bào Các đột biến gây hại việc ảnh hưởng trực tiếp đến chức protein làm thay đổi đặc tính báo hiệu và/ thay đổi tương tác với protein khác màng lọc cầu thận [57] Các đột biến sai ng ĩa không giới hạn vài exon cụ thể mà phân bố suốt chiều ài gen Do đó, miền chức khác podocin bị ả h hưở ng [62] Trong số đột biến sai nghĩa, đột biến công b ố tro g sở liệu giải trình tự p.V290M (C.868G> A) p.V180M (c.538G> A) với tần suất 1/13006 alen (0.008%), p.R138Q (c.413G> A) với tần số 8/13006 (0.06%), cho thường gặp đột biến sau bệnh nhân [20] Nhóm đột biến thứ hai xác định gen NPHS2 đột biến vô nghĩa Tổng hợp từ nghiên cứu trước, mười bảy đột biến vô nghĩa mô tả, có đột bi ến (p.S46X [c.137C> A], p.Q219X [c.655C> T], p.R229X [C.685C> T], p.L270X [c.809T> A]) Các đột biến khác mô tả trước là: p.Q39X (c.115C> T), p.R71X (c.211C> T), P.E87X (c.259G> T), p.W122X (c.366G> A), p.Q129X (c.385C> T) P.R138X (c.412C> T), p.Y162X (c.486C> A), p.R196X (c.586C> T) P.Q215X (c.643C> T), p.E237X (c.709G> T), p.E264X (c.790G> T) P.K289X (c.865A> T), p.R322X (c.964C> T) Xét nghiệm invitro protein đột biến p.R138X (c.412C> T) gây khả giữ lại nephrin màng đáy cầ u th ận [37] Mặt khác, phản ứng khuếch đại gen sinh thiết thận bệnh nhân mang đột biến p R138X (C.412C> T) phát sản phẩm chứng tỏ đột biến làm phân hủy mRNA [20, 21] Nghiên cứu Karim Bouchireb cộng (năm 2013) cập nhật đột biến gen NPHS2 liên quan đến HCTH kháng corticosteroid, đột biến thêm hay bớt nucleotit xác định bao gồm 11 đột biến chèn 37 thêm 26 đột biến xóa đoạn gen ngắn Trong số có đột biến gây lệch khung đọc Đột biến thêm nucleotit rải rác toàn chiều dài gen mã hóa podocin, nhiên, đột biến nucleotit tập trung vùng PHB đầu C-terminal Chỉ có đột biến nucleotit là: p.Pro89ArgfsX13 (c.264 265del), (p.P45RfsX54 [C.134del], p.E56GfsX43 [c.167del], p.L84WfsX15 [c.249del]) exon có ảnh hưởng đến đầu N podocin Nghiên cứu không thấy xuất đột biến này, kích thước quần thể nghiên cứu đột biến có tần số thấp đột biến liên qu n đến chủng tộc địa dư mà chưa chứng minh rõ Ngoài đột biến thuộc exon đầu, nhiều nghiên cứu khác đột biến thuộc vùng intron đột biến mã kết thúc xác định Mười sáu đột biến làm thay đổi vị trí cắt mơ tả nghiên cứu bao gồm: 275-1G> C, 275-2A> C, 378> 1G> A, 378> 5G> A, 379-1G> C, 451 + 2T> A, 451 + 3A> T, 452-2A> C, 534 + 1G> T, 535-1G> T, 794 + 5G> T, 873 + 5G> A, 873 + 2T> A, 873> 1G> A, 874-1G> C, 874-2A> G Tuy nhiên cho nguyên nhân gây bệnh Phần lớn đột biến vị trí cắt ảnh hưởng đến intron (58% tất đột biến vị trí cắt) Đột biến p.X384QextX7 (c.1150T>C) tìm thấy gần nghiên cứu Bouchireb Trong đột bi ến này, thay base đơn lẻ stop codon tạo khung đọc mở dài hơn, kết tạo protein với 390 axit amin dẫn đến biểu mức podocin tế bào chân giả Vì vậy, nghiên cứu thực nghiệm tương lai cần thiết để đánh giá hậu chức đột biến đơn lẻ Việc xác định tần số kiểu gen tần số alen đa hình di truyền xuất hi ện alen đột biến góp phần vào việc xác định SNP tiềm cho mối liên quan đa hình di truyền gen NPHS2 với HCTHTP kháng corticoid quẩn thể người Việt Nam Trong 149 bệnh nhân nghiên cứu, n oài hai đột biến nằm exon exon 3, chúng tơi thấy có SNP có tính đa hình exon - rs1079292, rs758564490, rs3738423, rs200437667, rs12401711, rs12401708 Rs528833893; exon 5, có tính đồng hình Kết tương đồng với nghiên cứu Hasan Otukesh 38 20 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng corticoid bệnh viện Ali Asghar (Iran) nghiên cứu Maruyama exon 36 trẻ em hật Bản mắc HCTH kháng corticosteroid [32, 50] Trong nghiên cứu Yu năm 2005 23 bệnh nhân người Trung Quốc, có trường hợp đột biến dị hợp tử đa hình: 51G>T, 288C>T, IVS3-46C>T, IVS3-21C>T, IVS774G>C, 954T>C 1038A>G xảy với bệnh nhân nhóm đối chứng [67] Nghiên cứu HCTH kháng corticosteroid ột số nhóm người châu Âu cho thấy tỉ lệ xuất đột biến gen NPHS2 từ 12-19% [26, 58, 65] nghiên cứu khác, đột biến gen NPHS2 phổ biến trẻ em Ai Cập mắc HCTH kháng corticosteroid khơng có tiền sử gia đình đưa khả giải thích cho tiên lượng thuận lợi đố i với bệnh nhân [16] Nghiên cứu 484 bệnh nhân mắc hội ch ứng thận hư Nam Ấn Độ phát đột biến gen NPHS2 G92C, P118L, R138Q D160G nhóm kháng corticoid (chiếm 18,5%) cịn nhóm nhạy cảm với corticoid khơng thấy đột biến xuất [39] Azocar M cộng phân tích gen NPHS2 34 trẻ em Chile mắ hộ chứng thận hư kháng corticoid, phát bệnh nhân có đột biến (chiếm 21%) bệnh nhân dị hợp tử Ở đột biến R229Q bệnh nhân đột biến A284V [15] Nội dung khóa luận phần thuộ c nghiên cứu lớn Đây bước đầu việc xác định SNP có ý nghĩa quần thể người Việt Nam mắc HCTHTP, từ tìm hiểu mối liên quan di truyền đặc điểm lâm sàng số hóa sinh 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết đạt được, đưa số kết luận sau: Chúng xây dựng quy trình phân tích gen cho exon đến thuộc gen NPHS2 sử dụng mẫu máu toàn phần với điều kiện tối ưu hóa cho phản ứng PCR: nhiệt độ gắn mồi 56oC, nồng độ mồi 0,3 pmol/µl nồng độ ADN khn khoảng 50 - 100 ng/µl Áp dụng thành cơng quy trình phân tích gen 149 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát Qua xác định 251 SNP đột biến Tần số alen SNP xuất đột biến thống kê so sánh với tần số lý thuyết theo định luật Hardy – Wei berg cho giá tri p > 0,05 4.2 KIẾN NGHỊ Thực nghiên cứu tiếp th o đánh giá mối liên quan đa hình di truyền gen NPHS2 với đáp ứ g thuốc corticosteroid điều trị hội chứng thận hư Xây dựng quy trình phân tích gen với exon cịn lại vùng khơng mã hóa protein gen NPHS2 để xác định thêm đa hình có khả ảnh hưởng đến đáp ứng thuốc corticosteroid 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bệnh viện Nhi Trung Ương (2006), "Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trẻ em" BioMedia Việt Nam Đa hình đơn nucleotide – Cơng cụ sử dụng di truyền học người, truy cập ngày 01 - 03-2018, trang web http://www.biomedia.vn/review/da-hinh-don-nucleotide-cong-cu-sudung-trong-di-truyen-hoc-o-nguoi.html Đinh Đồn Long and Đỗ Lê Thăng (2008), " hân tích gen sản phẩm gen", Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 325-355 Hà Phan Hải An (2015), "Hội chứng thậ hư", Bệnh học nội khoa, tập 1, Nhà xuất Y học Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001), Sinh h ọc phân tử, Nhà xuất Y học Hoàng Hà Kiểm (2010), "Thận học lâm sàng", Nhà xuất Y học Khuất Hữu Thanh (1997), "Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen", Nhà xuất KHKT HN Lê Nam Trà (2009), "Hội chứng thận hư tiên phát", Bài giảng Nhi khoa, tập 2, Nhà xuất Y học Lê Thị Nhiên (2016), Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 bệnh nhân đặt Stent động mạch vành qua da, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Dượ c Hà Nội 10 Nguyễn Gia Khánh (2013), "Bài giảng Nhi khoa", tập 11 Nguyễn Ngọc Sáng (1987), Nhận xét đặc điểm lâm sàng sinh học qua 52 trường hợp HCTHTP thể kháng thuốc trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú bệnh viện, Trường Đại học Y Hà Nội 12 Trần Đình Long (1995), "Một số biến chứng liệu pháp corticoid điều trị hội chứng thận hư trẻ em", Tạp chí Nhi khoa, (2&3), tr 50 -51 Tiếng Anh 13 Andolino TP and Reid-Adam J (2015), "Nephrotic syndrome", Pediatrics in Review, 36(3), pp 117–126 14 Arbeitsgemeinschaft fur Pädiatrische Nephrologie (1988), "Short versus standard prednisone therapy for initial treatment of idiopathic nephrotic syndrome in children", Lancet, 1, pp 380 –383 18 15 Azocar M, Vega A et al (2016), "NPHS2 Mutation analysis study in children with steroid-resistant nephrotic syndrome", Rev Chil Pediatr, 87(1), pp 31-6 16 Bakr A Yehia S, El-Ghannam D and et al (2008), "NPHS2 mutations", Indian J Pediatr, 75, pp 135-8 17 Basiratnia M., Yavarian M and Torabinezhad S (2013), "NPHS2 Gene in Steroid-resistant Nephrotic Syndrome Prev len e, Clinical Course, and Mutational Spectrum in South-West Ir ni n Children", Iran J Kidney Dis, 7(5), pp 357-62 Berdeli A, M.S et al ( 2007), "NPHS2 (podocin) utations in Turkish children with idiopathic nephritic syndrome", Pedi tr Nephrol, 22, pp 2031-2040 19 Bernward Hinkes, C.V et al (2008), "Specific Podocin mutations correlate with age of onset in Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 19, pp 365-371 20 Bouchireb K, Boyer O and Gribouv l O (2013), "NPHS2 mutations in steroid-resistant nephrotic syndrome: a mutation update and the associated phenotypic spectrum", Hum Mutat, 35(2), pp 17886 21 Boute N, Gribouval O and Ros lli S (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome", Nat Genet, 24(4), pp 349-54 22 Budowle B., Adams D.E and Allen R.C (1994), "Fragmentlength polymorphisms for for nsic science applications", Methods in nucleic acids research, pp 181-202 23 Buscher AK and Weber S ( 2012), "Educational paper: the podocytopathies", Eu J Pediatr, 171 (8), pp 1151-60 24 Butler J.M (2001), "Biology and Technology behind STR marker", Forensic DNA Typing, Academic Press, London 25 Caridi G, Bertelli R and Carrea A (2001), "Prevalence, genetics, and clinical features of patients carrying podocin mutations in steroidresistant nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", J Am Soc Nephrol, 12 (12), pp 2742-6 26.Caridi G, Bertelli R et al (2003), "Broadening the spectrum of diseases related to podocin mutations", J Am Soc Nephrol, 14, pp 1278‐86 27 Chanchlani R and Parekh RS (2016), "Ethnic differences in childhood nephrotic syndrome", Front Pediatrics, DOI: 10.3389/fped.2016.00039 28 Dedi Rachmadi, A.M and Leo Monners (2015), "Gene Mutation and Polymorphisms in Indonesian Chhildren with SteroidResistant Nephrotic Syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5, pp 2733 29 Dusel JA, Burdon KP and Hicks PJ (2005), "Identification of podocin (NPHS2) gene mutations in African Americans with nondiabetic end-stage renal disease", Kidney Int, 68(1), pp 256-62 30 Eddy AA and Symons JM (2003), "Nephrotic syndrome in childhood", Lancet, 362(9384), pp 629–639 31 HabibR (1993), "Nephrotic syndrome in the st year of life", Inserm U, Hospital Necker – Enfant Malades, Paris, France, 7(4), pp 347-353 37 32 Hasan Otukesh, B.G et al (2009), "NPHS2 Mutations in Children with Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", Irani n Journal of Kidney Diseases, 3, pp 99-102 33 Hee Gyung Kang and H.I.C (2015), "Nephrotic syndrome: What’s new, what’s hot?", Korean J Pediatr 58, pp 275 -282 34 Hee Yeon Cho, Joo Hoon Lee and Hyun Jin Choi (2008), "WT1 and NPHS2 mutations in Korean children with steroid resistant nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 23, pp 63-70 35 Hinkes B, Wiggins RC et al (2006), "Positional cloning uncovers mutations in PLCE1 responsible for a nephrotic syndrome variant that may be reversible", Nat Genet, 38, pp 1397–1405 36 Hinkes BG, Mucha B and ) Vla gos CN (2007), "Nephrotic syndrome in the first year of life: Two th rds of cases are caused by mutations in genes (NPHS1, NPHS2, WT1, and LAMB2)", Pediatrics, 119, pp 907–919 Huber TB, Simons and Hartleben B (2003), "Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains", Hum Mol Genet, 15;12(24), pp 3397-405 38 International Study of Kidney Disease in Children (1981), Primary nephrotic syndrome in children: Clinical significance of histopat ol gic variants of minimal change and of diffuse mesangial hypercellularity, A Report of the International Study of Kidney Disease in Children 39 Jaffer A, Unnisa W et al (2014), "NPHS2 mutation analysis and primary nephrotic syndrome in southern Indians", Nephrology, 19(7), pp 398-403 40 Joshi S, A.R et al (2013), "Genetics of steroid resistant nephritic syndrome: a review of mutation spectrum and suggested approach for genetic testing", Acta Paediatr, 102(9) 41 Kalman Tory, Dora K Menyhard et al ( 2013), "Mutation dependent recessive inheritance of NPHS2 associated steroid resistant nephritic syndrome", Nature Genetics, 46(3), pp 299-304 42 Karle SM, Uetz B and Ronner V (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13(2), pp 388-93 43 Karle SM, Uetz B et al (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13 pp 388 –393 44 Kitamura A, Tsukaguchi H et al (2006), "Genetics and Clinical Features of 15 Asian Families with Steroid-Resist nt Nephrotic Syndrome.", HealthNephrology Dialysis Transplantation, 21, pp 31333138 45 Kosskimies O, V.J et al (1982), "Long-termoutcome of primary nephrotic syndrome", Archives of Diseasein C il ood 57, pp 544-548 46 Kruglyak L and Nickerson D.A (2001), "Variation is the spice of life", Nature Genetics, 27, pp 234–236 47 Kwok PY and Chen X (2003), "Detection of single nucleotide polymorphisms", Curr Issues Mol Biol , 5(2), pp 43-60 48 Lombel R M., Hodson E M and Gipson D S (2012), "Treatment of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelaines from KDIGO", Pediatr Nephrol, 2304(8) 49 Maddalena Gigante, Matteo P emontese et al (2011), "Molecular and Genetic Basic of Inherited nephrotic syndrome ", International Journal of Nephrology, 2011, pp 1-15 50 Maruyama K, Iuima K t al (2003), "NPHS2 mutations in sporadic steroid‐resistant nephrotic syndrome in Japanese children", Pediatr Nephrol, 18, pp 412 ‐6 51 Mitra Basiratnia, M.Y et al (2013), "NPHS2 gene in Steroid resistant nephritic syndr me Prevelance, clinical course, and mutational spectrum in S uth West Iranian children", IJKD, 7, pp 357-362 52 Nelson (2000), "Nephrosis", Textbook of Pediatrics, 1129-1133 53 Nephrotic Syndrome: Pathophysiology, Treatment, Complications, Differential Diagnoses (2017), accessed 01 - 03-2018, from web https://www.healthdiseaseblog.com/2017/09/nephroticsyndrome-treatment-pathophysiology-complications-differentialdiagnosis.html 54 Patrick Niaudet (2004), "Podocin and Nephrotic Syndrome: Implications for the Clinician", Journal of the American society of Nephrology, 15, pp 832-834 55 Pereira AC, Pereira AB and Mota GF (2004), "NPHS2 R229Q functional variant is associated with microalbuminuria in the general population", Kidney Int, 65(3), pp 1026-30 56 Ren Q and Y.S (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid-resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal 4, pp 30-33 62 57 Roselli S, Moutkine I and Gribouval O (2004), "Plasma membrane targeting of podocin through the classical exocytic pathway: effect of NPHS2 mutations", Traffic, 5(1), pp 37-44 58 Ruf RG, Lichtenberger A and Karle SM et al (2004), "Patients with mutations in NPHS2 (podocin) not respond to standard steroid treatment of nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol 15, pp 722 –732 59 Schumacher V, Scharer K et al (1998), "Spectrum of early onset nephrotic syndrome associated with WT1 missense ut tions", Kidney Int, 53, pp 1594–1600 60 Severine Roselli, Imane Moutkine et al (2004), "Plasma membrane targeting of Podocin through the classical exocytic pathway: Effect of NPHS2 mutations", TRafic, 5, pp 37-44 61 Snustad D P and Simmons M J (2012), "The human Hapmap project", Principle of genetics, John Wiley & Sons, Inc, 414-415 Stefanie Weber, Oliver Gribouval a Ernie L (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid-resistant nephrotic syndrome and low post -transplant recurrence", Kidney International, 66(2004), pp 571–579 63 Tsukaguchi H, Yager H and Dawborn J (2000), "A locus for adolescent and adult onset familial fo al segmental glomerulosclerosis on chromosome 1q25-31", J Am Soc Nephrol, 11(9), pp 1674-80 64 A Vignal and et al (2002), "A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genetics, selection, evolution: GSE, 34(3), pp 275-305 65 Weber S Gribouval O, Esquivel EL and et al (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid resistant nephritic syndrome and l w post transplant recurrence", Kidney International Supplements, 66(2), pp 571-579 66 What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)? , accessed 03 - 01-2018, from web https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp 67 Yu Sy Ren Q (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid-resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal, 4(3033) 68 Zenker M, Tralau T et al (2004), "Congenital nephrosis, mesangial sclerosis, and distinct eye abnormalities with microcoria: An autosomal recessive syndrome", Am J Med Genet A, 130, pp 138–145 69 Zihua Yu, Jianping Huang et al (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroid – resistant nephrotic syndrome in Chinese children", Nephrol Dial Transplant, 20, pp 902-908 PHỤ LỤC Phụ lục Quy trình tách chiết ADN tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit Rã đông mẫu máu đá để hóa chất nhiệt độ phịng Lắc ống máu Chuyển 250 µl mẫu vào ống ly tâm vơ trùng Thêm 25 µl OB Protease Solution 250 µl BL Buffer Vortex 10 giây Ủ 65oC 10 phút Chú ý: Sau ủ phút, vortex 15 giây Thêm 260 µl Ethanol 100%, vortex 20 giây Ly tâm 1000 vòng/ phút 15 giây để đả m bảo mẫu khơng dính thành nắp ống Chèn HiBind ADN Mini Column vào Collection Tube 2ml Chuyển toàn mẫu vào cột (để pip t mức 790 µl) Ly tâm 14.000 vịng/ phút phút 10 Bỏ dịch lọc Collection Tube 11 Lắp HiBind ADN Mini Column vào Collletion Tube 2ml 12 Thêm 500 µl HBC Buff r 13 Ly tâm 14.000 vòng/ phút phút 14 Bỏ dịch lọc s dụng lại Colletion Tube 15 Thêm 700 µl ADN Wash Buffer 16 Ly tâm phút 10.000g 17 Bỏ dịch lọc sử dụng lại Colletion Tube 18 Lặp lại ác bước 14 đến 16 cho bước rửa thứ với ADN Wash Buffer 19 Ly tâm HiBind ADN Mini Column 14.000 vòng/ phút phút để làm khô cột 20 Chuyển HiBind ADN Mini Column vào ống ly tâm 2ml o o 21 Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 65 C) Ủ 65 C phút 22 Ly tâm 14.000 vòng/ phút phút 23 24 Thêm 50 µl Elution Buffer phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14.000 vòng/ phút phút 25 Thu vào bảo quản ADN -20oC Phụ lục Quy trình kiểm tra chất lượng ADN thơng qua điện di Bước 1: Chuẩn bị gel agarose Pha Agarose bột đệm TAE 1X để đạt nồng độ dung dịch gel agarose 1,5% Đun lò vi sóng cho agarose tan hồn tồn, sau để nguội đến 50 – 60oC đổ vào khay điện di có cài sẵn lượ để tạo giếng nhỏ Sau khoảng 30 phút, gel đông, gỡ lược đặt gel vào bể điện di tư nằm ngang Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1- mm Bước 2: Tra mẫu ADN Mẫu ADN trộn với ADN dye 6X (ch ấ t chứa hai chất nhuộm màu khác nhau: bromophenol xanh xylene cyanol FF để theo dõi trực quan di chuyển gel điện trường, 5µl ADN mẫu 5µl ADN thang chuẩn Lambda/Hind III Marker tra vào giếng Bước 3: Chạy điện di Quá trình chạy điện di tiế hành hiệu điện 70V 60 phút ADN di chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát di chuyển màu để biết dừng điện di Bản gel lấy nhẹ khỏi khuôn soi ghi hình ánh sáng tử ngoại Phụ lục Kết đo OD mẫu ADN STT OD 85,6 89,95 186 62,55 58,05 59 35,4 57,05 88 10 49,4 11 72,1 12 64,1 13 66,8 14 83,5 15 34,9 16 75,3 17 129,7 18 55,7 19 105,9 20 65 21 123,9 22 119,3 23 125,7 24 65,1 25 31,7 26 160,3 27 61,35 28 68,55 29 87,2 30 125,2 31 115,9 32 120,9 33 77,4 34 34,65 35 74,95 36 105,3 37 282,3 38 92,45 39 157,3 40 184,9 41 91,55 42 189,3 43 126,8 44 128,1 45 145,5 46 60,6 47 95,7 48 63,05 49 112,2 50 146,4 ... THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Khóa: QH 2012.Y Người hư? ??ng dẫn: ThS... exon exon Trên giới, có nhi? ??u cơng bố giải trình tự tồn exon gen NPHS2, nhi? ? , lần cơng bố giải trình tự tồn exon gen NPHS2 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc hội chứng thận hư tiên phát Nghiên... NPHS2 mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát? ?? Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền nằm exon đến exon thuộc gen NPHS2 bệnh nhân nhi mắ c HCTHTP Việt