Xây dựng quy trình phân tích một số đa hình gen n acetyltransfarase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở người bệnh lao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC KIỀU HỒNG NHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID Ở NGƯỜI BỆNH LAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Hà Nội – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC KIỀU HỒNG NHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID Ở NGƯỜI BỆNH LAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Khóa Người hướng dẫn : QH 2013.Y : PSG.TS Đinh Đoàn Long ThS Phạm Thị Hồng Nhung Hà Nội – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành q trình nghiên cứu khóa luận này, lời tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy hướng dẫn trực tiếp, dạy nhiệt tình, tỉ mỉ truyền đạt cho tơi nhiều kiến thức kinh nghiệm suốt trình thực khóa luận Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS Vũ Thị Thơm – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội - cố vấn khoa học, người thầy tận tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu, sẵn sàng giải đáp thắc mắc để tơi hồn thành khóa luận Đồng thời, xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thu Hà, thành viên nhóm nghiên cứu ln tích cực giúp đỡ, dạy tơi nhiều q trình thực nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin cảm ơn Bộ Khoa học công nghệ Chương trình Newton Fund Việt Nam tài trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu KHCN cấp nhà nước (Mã số HNQT/SPĐP/01.16) PGS.TS Lê Thị Luyến chủ trì, mà nhánh đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện 74 Trung Ương cung cấp mẫu phẩm phục vụ cho nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô, bạn thực tập Phịng thí nghiệm – Bộ mơn Y Dược học sở nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, toàn thể thầy cô giáo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn u thương tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn trình thực hi ệ n khóa luận Hà Nội, ngày 13 tháng năm 2019 Tác giả Kiều Hồng Nhung DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFB CYP2E1 ddNTP DHPLC DILI DNA EDTA INH NAT1 NAT2 NAT2 OD PCR Vi khuẩn kháng axit (Acid Fast Bacillus) Cytochrom P450 2E1 Dideoxynucleotide Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography) Tổn thương gan thuốc (Drug-induced liver injury) Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid) Chất chống đông Ethylene Diamine Tetra acetic Acid Isoniazid Gen N-Acetyltransferase Gen N- Acetyltransferase Enzym N- Acetyltransferase Mật độ quang học (Optical Density) Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase chain Reaction) SNP Dược di truyền học (Pharmacogenetics/-nomics) Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) Đa hình di truyền đơn nucleotit (Singles nucletotide STD WHO polymorphisms) Liều điều trị tiêu chuẩn (Standard Treatment Dose) Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) PGx RFLP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Ảnh hưởng kiểu hình acetyl hóa tới chuyể n hóa số thuốc Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng Một số SNP phổ biến ge 1.Thành phần điều kiện c 1.Thành phần điều kiện 2.Kết phân tích kiể u ge 3.Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trê DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1 Một số phản ứng chuyển hóa xúc tác NAT2 Hình Cấu trúc vị trí gen NAT2 nhiễm sắc thể số Hình Ảnh hưởng mức độ phân tử SNP NAT2 Hình Tỉ lệ mắc bệ nh lao t ại số khu vực giới năm 2017 Hình Chuyể n hóa isoniazid gan 12 Hình Số lượng người gặp tác dụng phụ isoniazid từ 1997-2018 13 Hình Các bước tiến hành nghiên cứu 20 Hình 2 Nguyên lý tách DNA tổng số kit 21 Hình Trình tự đoạn gen NAT2 nhân dịng để xác định kiểu alen .22 Hình Kết dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 NAT2*7 23 Hình Kết DNA tổng điện di gel agarose 1,2% 26 Hình Kết tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 gel agarose 1,5% 27 Hình 3 Kết nhân dịng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu 28 Hình Phân tích kiểu gen NAT2 dựa vào PCR - RFLP 28 Hình Kết xác định kiểu gen NAT2 BioEdit version 7.1.9 .30 Hình Các tần số phân bố alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 số vùng khu vực giới 34 Hình Sự phân bố kiể u hình acetyl hóa chậm 99 quần thể giới 35 Hình Nồng độ INH sau gi kiểu hình acetyl hóa .36 Hình 4 Tỷ lệ tổn thường gan INH gây (INH-DILI) theo thời gian số 172 người bệnh 37 MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan enzym N-Acetyltransferase (NAT2) 1.2 Tổng quan gen N-Acetyltransferase 1.2.1 Vị trí, c ấu trúc vai trò gen NAT2 .5 1.2.2 Đa hình gen N-Acetyltransferase .6 1.3 Đặc điểm chung bệnh lao vai trò isoniazid điều trị lao 1.3.1 Đặc điểm chung bệnh lao 1.3.2 Điều trị dự phòng lao .10 1.3.3 Isoniazid điều trị lao 11 1.3.3.1 Dược lý, chuyể n hóa c isoniazid 11 1.3.3.2 Độc tính INH với thể 12 1.3.4 Gen liên quan đến chuyển hóa isoniazid người .14 1.4 Các nghiên cứu đa hình di truyền NAT2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid người bệ nh lao .15 1.5 Các phương pháp phân tích đa hình NAT2 16 CHƯƠNG ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Vật liệu nghiên cứu .19 2.1.1 Đối tượ ng nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa ch ất 19 2.1.3 Thi ế t bị .19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Thu mẫu sinh phẩm .21 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số .21 2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 PCR 22 2.2.4 Tinh s ạch sản phẩm PCR 23 2.2.5 Xác định kiể u gen NAT2 PCR-RFLP 23 2.2.6 Xác định kiể u gen NAT2 phương pháp giải trình tự 24 2.2.7 Xác định tần số SNP dự đốn kiểu hình acetyl hóa 24 2.3 Đạo đức nghiên cứu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .26 3.1 Tách chiết DNA tổng số 26 3.2 Nhân dòng đoạn gen NAT2 PCR 26 3.2.1 Tối ưu quy trình PCR 26 3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 c 100 mẫu nghiên cứu 27 3.3 Xác định kiể u gen NAT2 PCR-RFLP 28 3.4 Xác định kiể u gen NAT2 giải trình tự 29 3.5 Kết phân bố tần số alen t ỷ lệ kiể u gen, kiểu hình NAT2 30 CHƯƠNG BÀN LUẬN .32 4.1 Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyề n NAT2 32 4.1.1 Phương pháp PCR-RFLP 32 4.1.2 Phương pháp giải trình t ự 32 4.2 Về đa hình di truyền NAT2 33 4.2.1 Tần số alen t ỷ lệ kiể u hình acetyl hóa 33 4.2.2 Về mối liên quan gi ữ a NAT2 số bệnh khác 39 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis bệnh nhiễm trùng mạn tính phổ biến người Bệnh gây nên triệu chứng chủ yếu đường hô hấp, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe sống ngườ i bệnh Theo công bố Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam đứng thứ 16/30 nước có gánh nặng bệnh lao cao giới với số lượng người mắc năm 2017 124.000 người 12.840 người tử vong lao [40] Sau chẩn đoán mắc bệnh lao, người bệnh thường điều trị theo phác đồ Chương trình Chống lao Quốc gia [1] Theo thuốc chống lao hàng gồm có thuốc: Isoniazid (INH), Rifampicin, Ethambutol, Pyrazinamid, Streptomycin [1] Trong đó, Isoniazid thuốc then chốt điều trị dự phòng lao hiệu lực kìm diệt vi khuẩn lao cao Đối với người bệ nh lao mắc không đa kháng thuốc, hầu hết đáp ứng điều trị tốt với phác đồ hàng 1, nhiên tỷ lệ gặp phải tác dụng khơng mong muốn, phần khác thất bại điều trị Nhiều trường hợp điều trị thất bại gặp tác dụng phụ số nghiên cứu giới trước liên quan đến đột biến gen N- Acetyltransferase (NAT2) gây kiểu hình acetyl hóa chậm Tùy vào vị trí đột biến mà làm biến đổi hoạt tính, cấu trúc độ bền enzym làm ảnh hưởng đến khả chuyển hóa isoniazid thuốc chuyển hóa NAT2 hydralazin, procainamid, aminoglutethimid, sufasalazin, nitrazepam, dapson [24] Ki ể u gen NAT2 quy định kiểu hình acetyl hóa với kiểu hình acetyl hóa acetyl hóa nhanh, acetyl hóa trung bình acetyl hóa chậm [44] Một số nghiên cứu chứng minh, người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy tổn thương gan, gặp tác dụng phụ tỉ lệ thất bại điều trị với thuốc chuyển hóa NAT2 cao kiểu hình cịn lại [23, 46] NAT2 ngồi liên quan đến chuyển hóa s ố thuốc nêu trên, cịn đóng vai trị quan trọng chuyển hóa số hợp chất gây ung thư Một số nghiên cứu liên quan kiểu hình acetyl hóa nguy ung thư vú, ung thư bàng quang, ung thư đại trực tràng [10, 35] Trong đột biến liên quan đến kiểu hình acetyl hóa, alen NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 (c.481C>T), NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) ghi nhận phổ biến nghiên cứu nhiều số quần thể giới [36, 37] Việc xác định đột biến gen NAT2 nhằm tìm hiểu mối liên quan biến đổi di truyền đáp ứng thuốc giúp bác sĩ lâm sàng cân nhắc điều chỉnh liều điều trị INH, hạn chế tác dụng phụ thuốc, qua nâng cao hiệu điều trị cho người bệnh Đây xu hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền phác đồ điều trị phát triển mở rộng ứng dụng nhanh chóng giới Tuy vậy, Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng quy trình phân tích kiểu gen NAT2 vào thực hành lâm sàng bắt đầu Từ nhu cầu lâm sàng tính cấp thiết việc tích hợp xét nghiệm gen NAT2 liệu trình chẩn đốn, điều tr ị người bệnh mắc lao, nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phân tích số đa hình gen N-acetyltransferase liên quan đến đáp ứng điều tr ị isoniazid người bệnh lao” với mục tiêu nội dung nghiên cứu sau: Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng quy trình phân tích số đa hình di truyền gen NAT2 người bệnh mắc lao Việt Nam - Áp dụng quy trình tối ưu để bước đầu đánh giá mức độ đa hình di truyền gen NAT2 100 mẫu người bệnh lao Việt Nam Nội dung nghiên cứu: - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dịng đoạn gen mã hóa enzym NAT2 - Xác định kiểu gen NAT2 phương pháp PCR-RFLP giải trình tự - Khảo sát tần số kiểu gen tần số alen liên quan đến đa hình SNP gồm NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 (c.481C>T), NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) nhóm người bệnh tham gia nghiên cứu NAT2*5I NAT2*5J e NAT2*5K 47 NAT2*5KAf NAT2*5L NAT2*5M NAT2*5N NAT2*5O NAT2*5P NAT2*5Qf NAT2*5Rf NAT2*5Sf NAT2*5Tf NAT2*5TAf NAT2*5Uf NAT2*5Vf NAT2*5VAf NAT2*5Wf NAT2*5Xf NAT2*5Yf NAT2*5Zf NAT2*6A NAT2*6B NAT2*6C NAT2*6D NAT2*6E NAT2*6F NAT2*6G NAT2*6H NAT2*6I NAT2*6J NAT2*6K NAT2*6L NAT2*6M NAT2*6N NAT2*6Of NAT2*6Pf NAT2*6Qf NAT2*6Rf NAT2*6Sf NAT2*6Tf NAT2*6Uf NAT2*6Vf NAT2*7A NAT2*7B NAT2*7C NAT2*7D NAT2*7Ef NAT2*7Ff NAT2*7Gf NAT2*10 NAT2*11A NAT2*11B NAT2*12A NAT2*12B NAT2*12C NAT2*12D NAT2*12E NAT2*12F NAT2*12G NAT2*12H NAT2*12I NAT2*12J NAT2*12Kf NAT2*12Lf NAT2*12Mf NAT2*12Nf NAT2*12Of NAT2*12Pf NAT2*13A NAT2*13B NAT2*13Cf NAT2*13Df NAT2*13Ef NAT2*13Ff NAT2*13Gf NAT2*14A NAT2*14B NAT2*14C 52 NAT2*14D NAT2*14E NAT2*14F NAT2*14G NAT2*14H NAT2*14I NAT2*14Jf NAT2*14Kf NAT2*14Lf NAT2*17 NAT2*18 NAT2*19 NAT2*20 NAT2*21 NAT2*22 f NAT2*23f NAT2*24f NAT2*25f NAT2*26f NAT2*27 PHỤ LỤC Giá trị đo hấp thụ quang mẫu DNA tổng số Nồng độ STT DNA ng/µl 62,3 41,2 26,2 128,8 46,1 102,8 33,1 54,4 36,2 10 37,7 11 29,8 12 36,8 13 229,8 14 133,3 15 24,6 16 66,4 17 51,5 18 132,2 19 29,6 20 61,3 21 22,1 22 112,6 23 26,3 24 44,1 25 146,1 26 20,4 27 89,7 28 68,7 29 113,9 30 26,7 31 50,00 32 23,50 33 30,75 34 48,20 ... N? ??I KHOA Y DƯỢC KIỀU HỒNG NHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PH? ?N TÍCH MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N- ACETYLTRANSFARASE LI? ?N QUAN Đ? ?N ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID Ở NGƯỜI BỆNH LAO KHÓA LU? ?N TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH... Bảng Kết ph? ?n tích ki ểu gen t? ?n số đa hình NAT2 SNP NAT2*5 NAT2*6 NAT2*7 NAT2*11 NAT2* 12 NAT2*13 Bảng 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam Kiểu hình 31 CHƯƠNG B? ?N LU? ?N. .. nghi? ?n cứu chúng tơi ti? ?n hành đề tài ? ?Xây dựng quy trình ph? ?n tích số đa hình gen N- acetyltransferase li? ?n quan đ? ?n đáp ứng điều tr ị isoniazid người bệnh lao? ?? với mục tiêu n? ??i dung nghi? ?n cứu