Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8685-16:2017

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8685-16:2017 quy định qui trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn được sản xuất từ chủng vi khuẩn Bordetella bronchiseptica. Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung tiêu chuẩn.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-16:2017 QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 16: VẮC XIN VƠ HOẠT PHỊNG BỆNH VIÊM TEO MŨI TRUYỀN NHIỄM Ở LỢN Vaccine testing procedure - Part 16: Bordetella bronchiseptica vaccine, inactivated Lời nói đầu TCVN 8685-16:2017 Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm phần: - TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc; - TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt; - TCVN 8685-3 : 2011, Phần 3: Vắc xin E.coli lợn; - TCVN 8685-4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ gà; - TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán; - TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc; - TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2; - TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc; - TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1; - TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh Lở mồm long móng (FMD); - TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza); - TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đơng khơ phịng hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS); - TCVN 8685-13 : 2014, Phần 13: Vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn (PRRS); - TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh viêm phổi thể kính lợn; - TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh viêm phổi pasteurella multocida type D gây lợn; - TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn; - TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi lợn; - TCVN 8685-18 : 2017, Phần 18: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh newcastle; - TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh gumboro QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 16: VẮC XIN VƠ HOẠT PHỊNG BỆNH VIÊM TEO MŨI TRUYỀN NHIỄM Ở LỢN Vaccine testing procedure - Part 16: Bordetella bronchiseptica vaccine, inactivated Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định qui trình kiểm nghiệm vắc xin vơ hoạt phịng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn sản xuất từ chủng vi khuẩn Bordetella bronchiseptica Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8684 : 2011 “Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y - Phương pháp kiểm tra khiết” Nguyên tắc Vắc xin kiểm tra tiêu cảm quan, độ vô trùng phương pháp phân tích phịng thí nghiệm, tiêu tính an tồn tính hiệu lực đánh giá động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm giống gốc cơng cường độc 4.1 Lợn từ tuần tuổi đến tuần tuổi, khỏe mạnh, khơng có kháng thể Bordetella bronchiseptica 4.2 Chuột lang trọng lượng từ 350 g đến 400g, khỏe mạnh 4.3 Thỏ trọng lượng từ 1,8 kg đến kg, khỏe mạnh, khơng có kháng thể kháng Bordetella bronchiseptica 4.4 Chuột nhắt trắng trọng lượng từ 18 g đến 20 g, khỏe mạnh 4.5 Vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc 4.6 Vắc xin tham chiếu (Vắc xin chuẩn) Thiết bị, dụng cụ 5.1 Tủ ấm CO2 trì nhiệt độ 37°C 5.2 Tủ lạnh trì nhiệt độ từ 2°C đến 8°C 5.3 Tủ lạnh sâu trì nhiệt độ âm 80°C 5.4 Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm 5.5 Máy ly tâm, ly tâm với gia tốc 12 000 g 5.6 Nồi cách thủy trì nhiệt độ 100°C, 110 °C, 121°C thời gian 10 min, 15 min, 20 5.7 Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl 5.8 Micropipet đa kênh, dung tích từ μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl 5.9 Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tinh vô trùng 5.10 Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U 5.11 Bình tam giác 100 ml, 200 ml vô trùng 5.12 Dao, kéo, panh kẹp vô trùng 5.13 Bơm kim tiêm lần ml, 10 ml 5.14 Cân phân tích có dải đo từ g đến 30 g Lấy mẫu sản phẩm chuẩn bị động vật thí nghiệm 6.1 Lấy mẫu sản phẩm: Số lượng mẫu cần lấy: 12 mẫu (chai/lọ) 6.2 Chuẩn bị động vật thí nghiệm - Ít 10 lợn (4.1) - Ít 02 chuột lang (4.2) - Ít 152 chuột nhắt trắng (4.4) - Ít 05 thỏ (4.3) Cách tiến hành 7.1 Kiểm tra cảm quan Quan sát mắt thường, vắc xin đạt tiêu cảm quan lọ vắc xin đồng nhất, khơng đơng vón, khơng lắng cặn 7.2 Kiểm tra vô trùng 7.2.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Theo TCVN 8684 : 2011 7.2.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc Theo TCVN 8684 : 2011 7.3 Kiểm tra tính an toàn Chọn phương pháp sau: 7.3.1 Phương pháp trọng tài - Tiêm cho 02 lợn (4.1), 02 liều vắc xin ghi nhãn theo đường tiêm bắp Theo dõi lợn từ 10 -14 ngày Vắc xin coi đạt tiêu an tồn tất lợn thí nghiệm sống khỏe, phát triển bình thường khơng có biến đổi cục bộ, bất thường hay triệu chứng toàn thân 7.3.2 Phương pháp thay - Tiêm cho 02 chuột lang (4.2), ml vắc xin theo đường da - Tiêm cho 10 chuột nhắt trắng (4.4), 0,5 ml vắc xin theo đường da Theo dõi động vật thí nghiệm từ 10 ngày đến 14 ngày Vắc xin coi đạt tiêu an toàn tất chuột sống khỏe, phát triển bình thường khơng có biến đổi cục bộ, bất thường hay triệu chứng toàn thân 7.4 Kiểm tra hiệu lực Chọn phương pháp sau: 7.4.1 Phương pháp công cường độc lợn Lợn chia làm nhóm: - Nhóm 1: Tiêm bắp 05 lợn (4.1) tiêm liều vắc xin ghi nhãn - Nhóm 2: Tiêm bắp 03 lợn (4.1) nước sinh lý vô trùng với liều lượng tiêm vắc xin - 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn lợn nhóm tiêm mũi thứ hai với liều lượng đường tiêm mũi thứ - 21 ngày sau mũi tiêm thứ 2, tồn lợn nhóm nhóm thử thách với vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5), ml (tương đương với liều - x 10 CFU/ml) theo đường da - Theo dõi động vật thí nghiệm ngày đến 10 ngày - Vắc xin coi đạt nếu: + Ít 2/3 lợn nhóm chết có triệu chứng bệnh tích điển hình bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn + Ít 4/5 lợn nhóm khơng có triệu chứng bệnh tích bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn 7.4.2 Phương pháp công cường độc chuột nhắt trắng Chọn phương pháp sau: 7.4.2.1 Phương pháp tính hiệu lực tương đối Chuột chia thành nhóm: - Nhóm 1: Tiêm vắc xin cần kiểm tra theo đường da phúc xoang cho chuột nhắt trắng (4.4) với hàm lượng 1/6 liều ghi nhãn (1/6 coi độ pha loãng ban đầu) Pha loãng theo số nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, nồng độ tiêm chuột - Nhóm 2: Tiêm vắc xin tham chiếu (4.6) theo đường da phúc xoang cho chuột nhắt trắng (4.4) với hàm lượng 1/6 liều ghi nhãn (1/6 coi độ pha loãng ban đầu) Pha loãng theo số nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, nồng độ tiêm chuột - Nhóm 3: Tiêm nước sinh lý vô trùng theo đường da phúc xoang cho 10 chuột nhắt trắng (4.4) với liều lượng tiêm vắc xin cần kiểm tra - 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, tồn chuột nhóm tiêm mũi thứ hai với liều lượng đường tiêm mũi thứ - ngày sau mũi tiêm thứ tồn chuột nhóm chuột nhóm thử thách với vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5), 0,2 ml (tương đương với liều 108 - 109 CFU/0,2 ml) theo đường da - Theo dõi 10 ngày, vắc xin coi đạt Hiệu lực vắc xin (The relative potency of the bacterin) ≥ 0.5 Số nghịch đảo 50% độ pha loãng cuối vắc xin kiểm tra Hiệu lực = ≥ 0.5 vắc xin Số nghịch đảo 50% độ pha loãng cuối vắc xin tham chiếu 7.4.2.2 Phương pháp tính liều LD50 chuột nhắt trắng Chuột chia làm nhóm: - Nhóm 1: Tiêm vào phúc xoang 50 chuột nhắt trắng (4.4) tiêm 0,2 ml vắc xin cần kiểm tra - Nhóm 2: Tiêm nước sinh lý vô trùng vào phúc xoang 50 chuột nhắt trắng (4.4) với liều lượng tiêm vắc xin cần kiểm tra - 21 ngày sau, chuột nhóm thử thách với vi khuẩn cường độc Bordetella bronchiseptica (4.5) - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5) hoàn nguyên 0,2 ml nước thịt Lấy 0,2 ml canh trùng cường độc pha loãng với PBS theo số 10 để nồng độ từ 10 -1 đến nồng độ 10-10 - Ở nồng độ tiêm vào phúc xoang cho chuột với liều 0.1 ml/con - Theo dõi ngày, vắc xin coi đạt LD50 nhóm lớn nhóm 10 2.0 - Liều LD50 nhóm chuột tính tốn tính theo công thức Reed - Muench: LgLD50 = LgA + Xlgf Trong đó: X: Khoảng cách tỷ lệ A: Độ pha loãng vi khuẩn gây chết chuột nhắt trắng cận 50% A': Tỷ lệ % chuột nhắt trắng chết cận 50% B': Tỷ lệ % chuột nhắt trắng chết cận 50% f: Hệ số pha loãng vi khuẩn 7.4.3 Phương pháp huyết học Chọn phương pháp sau: 7.4.3.1 Đánh giá hiệu giá kháng thể phản ứng ELISA - Tiêm bắp 05 lợn (4.1), liều vắc xin ghi nhãn 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn lợn tiêm mũi thứ hai với liều lượng đường tiêm mũi thứ 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, lợn lấy máu, chắt huyết làm phản ứng ELISA - Tiêm bắp 05 thỏ (4.3), liều vắc xin ghi nhãn 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn thỏ tiêm mũi thứ hai với liều lượng đường tiêm mũi thứ 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, thỏ lấy máu, chắt huyết làm phản ứng ELISA - Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn 75 % mẫu huyết đạt giá trị dương tính 7.4.3.2 Đánh giá hiệu giá kháng thể phản ứng ngưng kết - Tiêm bắp 05 lợn (4.1), liều vắc xin ghi nhãn 14 ngày sau mũi tiêm thứ nhất, toàn lợn tiêm mũi thứ hai với liều lượng đường tiêm mũi thứ 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, lợn lấy máu, chắt huyết làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục) - Vắc xin coi đạt hiệu giá kháng thể 75 % mẫu huyết miễn dịch cho kết ≥ 1:16 Phụ lục A (Quy định) Kiểm tra hiệu giá kháng thể Bordetella bronchiseptica phản ứng ngưng kết chậm A.1 Chuẩn bị mơi trường hóa chất - Đĩa thạch chocolate bổ sung Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) % - Đĩa thạch máu đường kính 8-10 cm - Canh thang Brain heart infusion (BHI) đóng ống ml - Acid Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 1N - Formaldehyde solution 37 % (HCHO) - Dung dịch PBS: 1000ml pha theo công thức sau: Natri clorua (NaCl) 8g Kali clorua (KCI) 2g Natri hiđro photphat (Na2HPO4) 1,15 g Mono kali photphat (KH2PO4) 0,2 g Nước 1000 ml Chỉnh pH đến 7,2 dung dịch NaOH 1N dung dịch HCl 1N Hấp tiệt trùng nhiệt độ 121°C h Bảo quản nhiệt độ 4°C A.2 Chuẩn bị kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen - KN xử lý acid EDTA) A.2.1 Cấy 0,01 ml vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc (4.5) vào đĩa thạch chocolate bổ sung NAD % (A.1), ủ tủ ấm 37°C (5.1) 24 h A.2.2 Chọn khuẩn lạc điển hình môi trường thạch chocolate (A.2.1) cấy vào môi trường canh thang BHI (A.1) bổ sung NAD %, ủ tủ ấm 37°C (5.1) 24 h A.2.3 Láng ml canh trùng (A.2.2) lên đĩa thạch chocolate (A.1) ủ tủ ấm 37°C (5.1) 24 h A.2.4 Thu hoạch vi khuẩn sau láng mặt thạch chocolate (A.2.3) cách dùng 5ml PBS rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu vào ống nghiệm A.2.5 Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37 % (A.1) vào huyễn dịch vi khuẩn thu (A.2.4) ủ tủ ấm 37°C (5.1) 24 h, sau đem kiểm tra vơ trùng huyễn dịch vi khuẩn A.2.6 Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt tiêu vô trùng ly tâm máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm 20 nhiệt độ 4°C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại 20 ml EDTA %, lắc ủ tủ ấm 37°C (5.1) 24 h A.2.7 Sau tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.6) máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm 20 nhiệt độ 4°C, cặn thu rửa ml PBS có bổ sung 0,3 % Formaldehyde solution 37 % (A.1), lặp lại lần A.2.8 Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.7) máy ly tâm (5.5) với tốc độ 12000 rpm 20 nhiệt độ 4°C, cặn thu hoàn nguyên ml PBS để thu hoạch kháng nguyên A.2.9 Kiểm tra kháng nguyên (A.2.8) xem có tự ngưng kết khơng, kháng ngun đạt u cầu khơng có tượng ngưng kết A.3 Chuẩn bị huyết kiểm tra Lấy máu động vật (7.4.3.2) chắt lấy huyết Sau khử bổ thể cách đun nồi cách thủy (5.6) nhiệt độ 56°C 30 A.4 Cách tiến hành Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên O (kháng nguyên Somatic) thực đĩa 96 giếng đáy chữ U Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm - Thực thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm - Đối với giếng thí nghiệm: + Cho dung dịch PBS vào dãy giếng thí nghiệm đĩa 96 đáy chữ U (50 μl/giếng) + Thêm vào giếng 50 μl huyết pha loãng huyết theo số + Nhỏ vào giếng 50 μl kháng nguyên - Đối với giếng đối chứng: + Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl kháng nguyên + Đối chứng dương: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl huyết tối miễn dịch pha loãng theo số + 50 μl kháng nguyên - Lắc nhẹ cho dính băng dính để tủ ấm 37°C (5.1) qua đêm - Đọc kết quả: + Phản ứng âm tính: Kháng ngun lắng trịn đáy giếng + Phản ứng dương tính: Xảy tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm xung quanh giếng + Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết đánh giá độ pha lỗng cao cịn có phản ứng ngưng kết xảy Thư mục tài liệu tham khảo [1] ASEAN Standards for Aniamal Vaccines (Second Edition): Requirements for Bordetella bronchiseptica Bacterin  .. .TCVN 8684 : 2011 “Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y - Phương pháp kiểm tra khiết” Nguyên tắc Vắc xin kiểm tra tiêu cảm quan, độ vô trùng phương pháp phân tích phịng thí nghiệm, tiêu tính... đạt tiêu cảm quan lọ vắc xin đồng nhất, khơng đơng vón, khơng lắng cặn 7.2 Kiểm tra vô trùng 7.2.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Theo TCVN 8684 : 2011 7.2.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc Theo TCVN. .. phân tích có dải đo từ g đến 30 g Lấy mẫu sản phẩm chuẩn bị động vật thí nghiệm 6.1 Lấy mẫu sản phẩm: Số lượng mẫu cần lấy: 12 mẫu (chai/lọ) 6.2 Chuẩn bị động vật thí nghiệm - Ít 10 lợn (4.1) -