Bộ Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN Vl:2017 quy định các chỉ tiêu, yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm nghiệm, bảo quản và các yêu cầu có liên quan đến chất lượng đối với nguyên liệu hóa dược, thành phẩm hóa dược, dược liệu, vắc xin.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Vl:2017 BỘ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC (GỒM 64 TIÊU CHUẨN, CHIA THÀNH PHẦN) Set of national standards for medicines MỤC LỤC Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc chuyên mục Phụ lục 1.27 Thuật ngữ dạng thuốc theo mơ hình giải phóng (phóng thích) dược chất Phụ lục 4.6 Phổ khối - plasma cảm ứng (ICP- MS) Phụ lục 4.7 Phổ huỳnh quang tia X Phụ lục 4.8 Phổ Raman Phụ lục 12.24 Lỗ khí số lỗ khí Phần 2: Nguyên liệu hóa dược Abacavir sulfat Arginin Arginin aspartat Attapulgit Bisoprolol fumarat Calcitriol Cefdinir Cefepim hydroclorid monohydrat Celecoxib Esomeprazol magnesi trihydrat Felodipin Glutathion Histidin Histidin hydroclorid monohydrat Isoleucin Lopinavir Lycin acetat Nifuroxazid Nitrazepam Penicilamin Quinapril hydroclorid Sucrafat Sulfasalazin Sultamicilin Sultamicilin tosilat dihydrat Terbutalin sulfat Tinh bột biến tính natri glycolat typ A Tinh bột biến tính natri glycolat typ B Tinh bột biến tính natri glycolat typ C Tramadol hydroclorid Thành phẩm hóa dược Bột pha hỗn dịch uống cefaclor Bột pha hỗn dịch uống cefdinir Bột pha hỗn dịch uống cefpodoxim Bột pha tiêm ceftazidim Nang ambroxol hydroclorid Nang cefdinir Nang cefpodoxim Nang indinavir Nang itraconazol Nang mềm calcitriol Nang oseltamivir Nang tan ruột esomeprazol Viên nén ambroxol hydroclorid Viên nén atovastatin Viên nén bao tan ruột esomeprazol Viên nén bao tan ruột pantoprazol Viên nén glimepirid metformin Viên nén losartan kali Viên nén lovastatin Viên nén perindopril tert-butylamin Viên nén simvastatin Viên nén telmisartan Dược liệu Bán biên liên Cao đặc diệp hạ châu đắng Cao khô huyết giác Côn bố Ngoi (Lá) Vắc xin Vắc xin phế cầu Vắc xin phế cầu cộng hợp Lời nói đầu Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc TCVN VI:2017 xây dựng nguyên tắc nối tiếp Bộ TCVN I:2017, Bộ TCVN II:2012, Bộ TCVN III:2014, Bộ TCVN IV:2015 Bộ TCVN V:2017 Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc TCVN VI:2017 Hội đồng Dược điển Việt Nam biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Tiêu chuẩn quốc gia thuốc văn kỹ thuật tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm chất lượng thuốc Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc gồm 64 tiêu chuẩn, chia thành phần sau: - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc chuyên mục, gồm tiêu chuẩn; - Phần 2: Nguyên liệu hóa dược, gồm 30 tiêu chuẩn; - Phần 3: Thành phẩm hóa dược, gồm 22 tiêu chuẩn; - Phần 4: Dược liệu, gồm tiêu chuẩn; - Phần 5: Vắc xin, gồm tiêu chuẩn Danh pháp, thuật ngữ Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc viết theo quy định Hội đồng Dược điển Việt Nam, Bộ Y tế Các thuật ngữ dược phẩm viết dựa nguyên tắc việt hóa tên chung quốc tế Latin (DCI Latin) cách hợp lý nhằm giữ ký tự cho sát với thuật ngữ quốc tế Tên hợp chất hữu viết theo danh pháp Hiệp hội quốc tế hóa học túy ứng dụng (I.U.P.A.C) quy định Trong số trường hợp cá biệt, thuật ngữ tiếng Việt quen dùng số nguyên tố, hóa chất hay tên dược liệu tiếp tục sử dụng BỘ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC Set of national standards for medicines Phạm vi áp dụng Bộ tiêu chuẩn quy định tiêu, yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm nghiệm, bảo quản yêu cầu có liên quan đến chất lượng nguyên liệu hóa dược, thành phẩm hóa dược, dược liệu, vắc xin Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn có ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi bổ sung (nếu có) TCVN 1-1:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; có 18 Phụ lục sau: Phụ lục 1: Từ phụ lục 1.1 đến phụ lục 1.24; Phụ lục 2: Từ phụ lục 2.1 đến phụ lục 2.5; Phụ lục 3: Từ phụ lục 3.1 đến phụ lục 3.6; Phụ lục 4: Từ phụ lục 4.1 đến phụ lục 4.4; Phụ lục 5: Từ phụ lục 5.1 đến phụ lục 5.7; Phụ lục 6: Từ phụ lục 6.1 đến phụ lục 6.11; Phụ lục 7: Từ phụ lục 7.1 đến phụ lục 7.11; Phụ lục 8: Từ phụ lục 8.1 đến phụ lục 8.3; Phụ lục 9: Từ phụ lục 9.1 đến phụ lục 9.10; Phụ lục 10: Từ phụ lục 10.1 đến phụ lục 10.19; Phụ lục 11: Từ phụ lục 11.1 đến phụ lục 11.8; Phụ lục 12: Từ phụ lục 12.1 đến phụ lục 12.20; Phụ lục 13: Từ phụ lục 13.1 đến phụ lục 13.10; Phụ lục 14: Phụ lục 15: Từ phụ lục 15.1 đến phụ lục 15.41; Phụ lục 16: Từ phụ lục 16.1 đến phụ lục 16.2; Phụ lục 17: Từ phụ lục 17.1 đến phụ lục 17.8; Phụ lục 18: TCVN I-2:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 2: Nguyên liệu hóa dược TCVN II:2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm phụ lục sau: phụ lục 1.25; phụ lục 4.5; phụ lục 6.12; phụ lục 12.21 phụ lục 12.22 TCVN III:2014, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm phụ lục sau: phụ lục 15.42 phụ lục 15.43 TCVN IV:2015, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; có phụ lục 10.20 TCVN V:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc chuyên mục; gồm 13 phụ lục hướng dẫn sau: phụ lục 1.26, phụ lục 6.13, phụ lục 10.21, phụ lục 10.22, phụ lục 11.9, phụ lục 11.10, phụ lục 12.23, phụ lục 13.11, phụ lục 15.44, phụ lục 15.45, phụ lục 15.46 (có phụ lục hướng dẫn), phụ lục 15.47 Ký hiệu chữ viết tắt Ký hiệu in nghiêng tên hóa chất, thuốc thử biểu thị thuốc thử phải đạt yêu cầu quy định Phụ lục Chữ viết tắt: CĐ: Chuẩn độ TT: Thuốc thử TT1, TT2, TT3 : Thuốc thử 1, thuốc thử 2, thuốc thử tt/tt: thể tích thể tích kl/tt: khối lượng thể tích PHẦN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ CHUYÊN MỤC PHỤ LỤC (Quy định) THUẬT NGỮ DẠNG THUỐC THEO MƠ HÌNH GIẢI PHĨNG (PHĨNG THÍCH) DƯỢC CHẤT Dạng thuốc giải phóng quy ước (conventional-release dosage form): Là dạng thuốc không dùng giải pháp đặc biệt thuộc thiết kế công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất để tác động đến giải phóng dược chất khỏi dạng thuốc Với dạng thuốc rắn, đồ thị hòa tan phụ thuộc chủ yếu vào tính chất vốn có dược chất Khi thử độ hòa tan, dược chất thường giải phóng khỏi dạng thuốc, dạng thuốc giải phóng quy ước cịn gọi dạng thuốc giải phóng tức thời (immediate-release form) Dạng thuốc giải phóng biến đổi (modified-release dosage form): Là dạng thuốc áp dụng giải pháp đặc biệt thuộc thiết kế công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất để làm thay đổi tốc độ hoặc/và nơi giải phóng dược chất so với dạng thuốc giải phóng quy ước có đường dùng Dạng thuốc giải phóng biến đổi bao gồm dạng thuốc giải phóng kéo dài, giải phóng muộn giải phóng theo chương trình Dạng thuốc giải phóng kéo dài (prolonged-release dosage form, extended-release dosage form): Là dạng thuốc giải phóng biến đổi, giải pháp đặc biệt thiết kế công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất áp dụng để làm chậm kéo dài q trình giải phóng dược chất nhằm kéo dài tác dụng điều trị thuốc (thuốc tác dụng kéo dài) Dạng thuốc giải phóng muộn (delayed-release dosage form): Là dạng thuốc giải phóng biến đổi, giải pháp thuộc công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất áp dụng để trì hỗn giải phóng dược chất sau khoảng thời gian tiềm tàng định Dạng thuốc giải phóng muộn bao gồm dạng thuốc bao tan ruột (bao kháng dịch vị) dạng thuốc giải phóng theo nhịp (pulsatilerelease dosage form) Dạng thuốc giải phóng theo chương trình (programmed-release dosage form): Là dạng thuốc giải phóng biến đổi, giải pháp đặc biệt thiết kế công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất áp dụng để kiểm sốt q trình giải phóng dược chất khỏi dạng thuốc theo chương trình định sẵn Hệ điều trị (therapeutic systems) chế phẩm giải phóng dược chất theo mơ hình PHỤ LỤC (Quy định) PHỔ KHỐI - PLASMA CẢM ỨNG (ICP-MS) Phổ khối-plasma kết hợp cảm ứng, gọi tắt Phổ khối-plasma cảm ứng (ICP-MS) phương pháp phổ khối với nguồn ion hóa plasma kết hợp cảm ứng (inductively-coupled plasma-ICP) Nguyên lý hình thành ICP mô tả đây: Plasma cảm ứng ICP nguồn khí trơ (thường khí argon) ion hóa cao độ, có số ion số electron trì trường điện từ tần số radio (RF) Khi mẫu thử tiếp xúc với ICP, nhiệt độ cao plasma khử dung mơi, hóa hơi, kích thích ion hóa ngun tử mẫu Giới hạn phát phương pháp ICP-MS đạt tới cỡ nanogam/lít Plasma hình thành dịng khí mang chạy “ngọn đèn" hay “torch" gồm ống đồng tâm thạch anh Một cuộn dây kim loại quanh đầu đèn nối với nguồn phát tần số radio Cuộn dây cấp công suất thường 700-1500 W, tạo nên từ trường cảm ứng dao động ứng với tần số nguồn tần số radio, thường 27 MHz, 40 MHz Plasma hình thành khí mang kích thích nguồn phóng điện, sinh ion electron mầm Trong từ trường cảm ứng, phần tử tích điện (ion electron) bị ép chạy qua đường hình vành khun khép kín Do cản trở dịng chảy chúng, q trình sinh nhiệt xảy tạo thêm ion Quá trình hình thành plasma xảy tức thời plasma đạt tồn cường độ kích thước Sự dao động với tần số radio công suất đặt cuộn dây tạo điện trường từ trường khu vực phía phần đầu đèn Khi tia lửa điện (được tạo ống Tesla hay thiết bị kích thích khác) tác động lên luồng khí mang qua đèn, số electron bị bứt khỏi nguyên tử khí mang Các electron bắt gặp từ trường cảm ứng tăng tốc Sự tăng lượng cho electron nhờ cuộn dây điện gọi kết hợp cảm ứng (inductive coupling) Các electron lượng cao lại va đập với nguyên tử khí mang khác làm bật thêm nhiều electron Sự ion hóa (do va đập) khí mang tiếp tục xảy theo phản ứng dây chuyền, làm cho khí mang biến thành thực thể plasma bao gồm nguyên tử, electron, ion khí mang Plasma trì phạm vi đèn cuộn dây nhờ lượng có tần số radio liên tục truyền cho plasma qua trình kết hợp cảm ứng ICP thấy plasma hình lơng chim mạnh mẽ sáng chói Phần đáy plasma có hình vịng xuyến, gọi vùng cảm ứng, vùng có trình truyền lượng cảm ứng từ cuộn dây cho plasma Mẫu thử đưa qua vùng cảm ứng vào trung tâm plasma Trong ICP-MS, plasma ion hóa nguyên tố có mẫu Các ion đưa vào máy phổ khối tách theo tỷ số khối/điện tích (m/z) Hầu hết máy phổ khối có hệ tứ cực nam châm Các ion từ plasma qua phận giao diện {gồm côn lấy mẫu (sampler cone) côn gạn lọc (skimmer cone)} tới quang học ion Bộ quang học ion gồm có thấu kính tĩnh điện, thấu kính đưa ion từ vùng có áp suất khí sang phận lọc khối có chân khơng trì mức 10-8 Pa nhỏ hơn, nhờ bơm turbo phân tử Sau lọc, ion có tỷ số khối/điện tích chọn tới detector (là nhân quang, cốc Faraday hay dynod), dịng ion chuyển thành tín hiệu điện Ngun tố định lượng dựa số ion tới detector tạo xung điện đơn vị thời gian Trong máy phổ ICP-MS cịn có hệ thống nạp mẫu xử lý liệu máy phổ ICPAES Thiết bị Một máy ICP-MS bao gồm thành phần chủ yếu sau: • Bộ nạp mẫu gồm bơm nhu động để bơm dung dịch đến phận phun sương với tốc độ dịng khơng đổi; • Bộ sinh tần số radio; • Bộ đèn plasma (plasma torch); • Giao diện có hai để chuyển ion đến quang học ion; • Máy phổ khối; • Detector; • Bộ thu nhận liệu Yếu tố ảnh hưởng Vấn đề nhiễu khối lượng, đặc biệt khoảng dải khối (ví dụ 40-80 đơn vị a.m.u), phần tử có khối lượng che phủ đáng kể tín hiệu khối ion phân tích Tổ hợp ion nguyên tử dẫn đến nhiễu đa nguyên tử hay nhiễu phân tử (như ảnh hưởng 40Ar16O lên 56Fe hay 40Ar40Ar lên 80Se) Nền mẫu ảnh hưởng lên số chất phân tích Một số mẫu có tác động lên hình thành giọt sương hay lên nhiệt độ ion hóa plasma Những tượng làm tín hiệu chất phân tích Có thể tránh ảnh hưởng vật lý cách sử dụng phương pháp chuẩn nội hay thêm chuẩn Nguyên tố dùng làm chuẩn nội tùy thuộc vào ngun tố cần đo: ví dụ dùng 59Co 115ln làm chuẩn nội Đặc tính hàng đầu thiết bị ICP-MS độ phân giải, tức hiệu lực tách hai khối gần Về mặt này, máy dùng tứ cực máy dùng nam châm Tiến hành Chuẩn bị mẫu nạp mẫu Việc chuẩn bị mẫu thường có bước phá hủy mẫu phương pháp phù hợp dùng lò vi sóng Ngồi cần đảm bảo nồng độ chất phân tích nằm khoảng làm việc máy (bằng cách pha loãng hay làm đậm đặc dung dịch mẫu) đảm bảo dung dịch mẫu phun sương ổn định Nhiều hệ thống nạp mẫu cho phép sử dụng acid đậm đặc, acid sulfuric acid phosphoric ảnh hưởng đến đường Vì nên dùng acid nitric acid hydrocloric Nếu có nạp mẫu đèn plasma làm vật liệu chịu acid hydrofluoric (như polymer perfluoroalkoxy) dùng acid hydrofluoric Khi lựa chọn phương pháp nạp mẫu, cần tính đến yêu cầu độ nhạy, độ ổn định, tốc độ, cỡ mẫu, khả chống ăn mòn chống bị tắc Một phun sương phun ngang kết hợp với buồng phun đèn plasma đáp ứng với hầu hết yêu cầu Dung dịch mẫu thường bơm bơm nhu động với tốc độ khoảng 20 -1000 μl/min Khi có sử dụng dung mơi hữu đưa oxygen vào phải tránh lớp dung môi hữu Chọn điều kiện làm việc Cần tuân theo điều kiện thao tác chuẩn nhà sản xuất thiết bị đưa Thơng thường, có nhóm điều kiện thao tác khác cho dung dịch nước dung dịch dung môi hữu Cần lựa chọn thông số làm việc: • Lựa chọn vật liệu thích hợp (cơn lấy mẫu gạn lọc); • Lựa chọn tốc độ dịng khí mang (các ống ngồi, đèn); • Lựa chọn cơng suất dịng tần số radio (RF); • Lựa chọn tốc độ bơm; • Lựa chọn hay nhiều đồng vị nguyên tố cần đo Lựa chọn đồng vị Có nhiều tiêu chí để lựa chọn chất đồng vị Để đạt độ nhạy tối đa, chọn đồng vị có mật độ cao Ngoài ra, nên chọn đồng vị chịu ảnh hưởng phần tử khác mẫu khí mang Trong phần mềm nhà sản xuất thiết bị ICP-MS thường có sẵn thơng tin ảnh hưởng phần tử có khối lượng ion đa nguyên tử thuộc nhiều loại khác hydrid, oxyd, clorid, v.v Kiểm tra hiệu máy Tính phù hợp hệ thống Trước chạy mẫu, phải chỉnh máy để theo dõi điều chỉnh phép đo Kiểm tra độ khối, dùng dung dịch chứa nhiều đồng vị phủ kín thang khối, ví dụ dung dịch có chứa 9Be, 59 Co, 89Y, 115ln, 140Ce 209Bi Ghi lại độ nhạy, độ ổn định ngắn hạn dài hạn Tối ưu hóa thơng số máy (điều kiện plasma, thấu kính ion, thơng số tứ cực) để thu số lần đếm cao Chỉnh độ phân giải trục khối (sử dụng dung dịch Li, Y TI) để đạt đáp ứng chấp nhận dải khối rộng Phải đánh giá hiệu lực phân hủy oxyd plasma để giảm thiểu ảnh hưởng oxyd Tỷ số Ce/CeO và/hay Ba/BaO thị tốt số cần nhỏ khoảng 3% Giảm thiểu hình thành ion hai điện tích với Ba Ce Tỷ số tín hiệu ion hai điện tích nguyên tố phân tích phải nhỏ 2% Kiểm tra độ ổn định dài hạn cách chạy dung dịch chuẩn trước sau chạy chuỗi dung dịch mẫu kiểm tra xem muối đọng có làm giảm tín hiệu đo q trình chạy hay khơng Thẩm định phương pháp Các phương pháp mô tả chuyên luận phải có hiệu đạt yêu cầu kiểm tra định kỳ với khoảng cách thời gian thích hợp Độ tuyến tính Chuẩn bị chạy dung dịch chuẩn nằm khoảng hiệu chuẩn mẫu trắng Với dung dịch làm lặp lại lần Đường chuẩn tính tốn phương pháp hồi quy bình phương tối thiểu, dựa tất liệu thu Đường hồi quy, trị giá trung bình, liệu đo, khoảng tin cậy phải ghi lại Phương pháp có giá trị sử dụng khi: • Hệ số hồi quy đạt tối thiểu 0,99; • Các điểm thực nghiệm thu nồng độ chuẩn phải phân bố ngẫu nhiên hai bên đường chuẩn Tính trị giá trung bình độ lệch chuẩn tương đối mức nồng độ chuẩn thấp cao Nếu tỷ số hai độ lệch chuẩn tính nhỏ 0,5 hay lớn 2,0 tính lại theo phương pháp hồi quy tuyến tính hữu trọng (hay hồi quy tuyến tính có trọng số - weighted linear regression) để có đường chuẩn xác Áp dụng hai hàm hữu trọng bậc bậc để biết dùng hàm thích hợp Nếu trị giá trung bình so với đường chuẩn cho thấy có độ lệch khỏi tuyến tính phải dùng phép hồi quy tuyến tính hai chiều Độ Nên kiểm tra độ cách sử dụng chất đối chiếu có chứng (CRM) Nếu khơng thể làm việc tiến hành thử độ thu hồi Độ thu hồi Với phép thử định lượng, cần đạt độ thu hồi 90% đến 110% Khi xác định lượng vết nguyên tố, phải đạt độ thu hồi từ 80% đến120% trị giá lý thuyết Có thể xác định độ thu hồi dung dịch đối chiếu (dung dịch mẫu) có cho thêm lượng biết chất phân tích (khoảng nồng độ có phải phù hợp với mẫu đem phân tích) Độ lặp lại Độ lặp lại (độ lệch chuẩn tương đối) không lớn 3% phép định lượng 5% phép thử xác định tạp chất Giới hạn định lượng Kiểm tra để đảm bảo giới hạn định lượng nhỏ giá trị cần đo (ví dụ dùng phương pháp 10 σ) 4.7 PHỔ HUỲNH QUANG TIA X Khi nguyên tử nguyên tố nhận lượng chùm tia X chiếu vào (tia X sơ cấp), nguyên tử electron lớp (ví dụ lớp K) bị ion hóa, để lại chỗ khuyết (trong lớp K) Trong khoảng thời gian ngắn sau đó, electron lớp ngồi (có lượng cao hơn) rơi vào chỗ khuyết lớp phát tia X khác, tia X huỳnh quang Phổ huỳnh quang tia X kỹ thuật phân tích dựa việc đo cường độ xạ huỳnh quang phát nguyên tố có ngun tử số từ 11 đến 92 kích thích xạ tia X sơ cấp liên tục Cường độ huỳnh quang nguyên tố không phụ thuộc vào nồng độ nguyên tố có mẫu mà phụ thuộc vào hấp thụ xạ tới xạ huỳnh quang mẫu Ở mức nồng độ vết, đường chuẩn tuyến tính, cường độ xạ huỳnh quang phát nguyên tố mẫu xác định, bước sóng xác định, tỷ lệ thuận với nồng độ nguyên tố tỷ lệ nghịch với hệ số hấp thụ khối (mass absorption coefficient) mẫu bước sóng Tiến hành Chuẩn bị sử dụng thiết bị theo hướng dẫn nhà sản xuất Các mẫu lỏng đặt trực tiếp vào máy; mẫu rắn phải ép thành viên trước, mẫu rắn phải trộn thêm với chất kết dính trước ép viên Để xác định nồng độ nguyên tố có mẫu, cần đo tốc độ xung thật (net impulse rate) tạo nên hay nhiều mẫu chuẩn có hàm lượng biết nguyên tố mẫu xác định tính đo hệ số hấp thụ khối mẫu cần phân tích Hiệu chuẩn Từ dung dịch hay dãy dung dịch hiệu chuẩn nguyên tố phân tích mẫu khác nhau, ta tính độ dốc b0 đường chuẩn theo phương trình sau: b0 ICN C M đó: μM hệ số hấp thụ mẫu M, tính hay đo; ICN tốc độ xung thật; C nồng độ nguyên tố cần định lượng dung dịch chuẩn Hệ số hấp thụ khối mẫu Nếu biết công thức phân tử mẫu phân tích, tính hệ số hấp thụ khối dựa thành phần nguyên tố bảng hệ số hấp thụ khối nguyên tố Nếu khơng biết thành phần ngun tố, đo cường độ lU tia X tán xạ (tán xạ Compton) tính hệ số hấp thụ khối mẫu μMP theo phương trình: MP đó: μMP hệ số hấp thụ khối mẫu, a bIU IU cường độ tia X tán xạ Xác định tốc độ xung thật nguyên tố phân tích mẫu N Tính tốc độ xung thật IEP nguyên tố phân tích dựa cường độ vạch huỳnh quang cường độ vạch (hay vạch) tạp nhiễm có ống Tính hàm lượng vết nguyên tố Nếu nồng độ nguyên tố nằm phần tuyến tính đường chuẩn ta tính nồng độ C ngun tố theo cơng thức sau: C N IEP b0 f MP đó: f hệ số pha loãng 4.8 PHỔ RAMAN Phổ Raman phổ dao động nên có liên quan đến phổ hồng ngoại (IR) cận hồng ngoại hay hồng ngoại gần (NIR) Hiệu ứng Raman kết thay đổi độ phân cực liên kết phân tử kiểu dao động xác định đo dạng tia tán xạ không đàn hồi Ta thu phổ Raman kích thích mẫu phân tích lên đến trạng thái ảo nguồn sáng đơn sắc, đặc biệt nguồn laser Tia tán xạ đàn hồi (khơng có thay đổi bước sóng) gọi tán xạ Rayleigh khơng quan tâm phổ Raman, trừ việc dùng để đánh dấu bước sóng tia laser Tuy vậy, mẫu từ trạng thái kích thích rơi mức lượng dao động khác với ban đầu tia tán xạ có chuyển dịch lượng (có thay đổi bước sóng) Sự chuyển dịch trùng với hiệu lượng trạng thái lượng dao động đầu cuối Đây tia “tán xạ không đàn hồi” gọi tán xạ Raman Chỉ có khoảng số 106 - 108 photon tới cho tán xạ Raman Vì thế, tia laser sử dụng phổ kế Raman Nếu photon tán xạ Raman có lượng thấp gọi tán xạ Stokes Nếu có lượng cao gọi tán xạ đối Stokes Trên thực tế, tất phép đo có ý nghĩa mặt phân tích sử dụng tán xạ Raman chuyển dịch Stokes Một phổ Raman trông giống phổ hồng ngoại tuyến tính độ hấp thụ Cường độ tia Raman (số photon Raman đếm được), vẽ đối chiếu với độ chuyển dịch lượng Trục hoành thường ghi "Chuyển dịch Raman/cm-1" hay "Số sóng/cm-1" Độ chuyển dịch Raman thường biểu thị theo số sóng giá trị tuyệt đối hiệu số sóng pic số sóng tia laser Phổ Raman biện giải theo cách với phổ hồng ngoại tương ứng Các vị trí số sóng (chuyển dịch Raman) cho kiểu dao động xác định với số sóng dải tương ứng phổ hấp thụ hồng ngoại Tuy nhiên, pic mạnh phổ Raman lại ứng với pic yếu phổ hồng ngoại, ngược lại Vì thế, hai kỹ thuật phổ Raman hồng ngoại thường cho hai kỹ thuật bổ sung cho Kỹ thuật phổ Raman có ưu điểm thường cho kết đo nhanh mà không cần phải phá hủy mẫu không cần chuẩn bị mẫu cần chuẩn bị tối thiểu; mẫu chất rắn, nửa rắn, lỏng đơi chất khí Phổ Raman cung cấp thông tin kiểu dao động phân tử mẫu thử mà nhờ ta hiểu thêm mẫu thử lẫn q trình chế biến Tín hiệu chủ yếu nằm vùng khả kiến cận hồng ngoại, nên ghép nối có hiệu với sợi quang học Điều có nghĩa thu nhận tín hiệu từ mơi trường suốt tia laser, thủy tinh, chất dẻo, hay mẫu môi trường nước Hơn nữa, phổ Raman thường dùng tia khả kiến hay cận hồng ngoại để kích thích, nên phận quang học làm thạch anh thủy tinh thường Về mặt thiết bị, hệ thống máy đại dễ sử dụng cho kết phân tích đáng tin cậy nhanh, thời gian tính giây đến phút Tuy thế, cần ý tia laser lượng cao, vùng cận hồng ngoại, nguy hiểm, khơng nhìn vào Các đầu dò sợi quang cần sử dụng thận trọng, tuân thủ quy định hành tia laser loại laser Bên cạnh phổ Raman “thường”, cịn có nhiều kỹ thuật Raman chun biệt khác Raman cộng hưởng (RR), phổ Raman nhạy bề mặt (SERS), phổ Raman quang hoạt (ROA) nhiều kỹ thuật khác Các kỹ thuật dùng ngành dược nên không đề cập đến CÁC PHÉP ĐO RAMAN ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG Có hai nhóm phép đo thường thực kỹ thuật phổ Raman định tính định lượng Định tính phổ Raman Phổ Raman cho thơng tin nhóm chức hóa học có mẫu Vì phổ Raman đặc trưng cho hợp chất định nên phép đo Raman định tính dùng phép thử định tính chất dùng để suy đoán cấu trúc phân tử chất Định lượng phổ Raman Sử dụng thiết bị có detector đo cơng suất quang (như máy quang phổ Raman chuyển dạng Fourier, FT-Raman), định lượng phổ Raman dựa mối quan hệ tín hiệu Sv số sóng cho v, nồng độ chất phân tích C: Sv = Kσv(vL - vβ)4 P0C đó: K số phụ thuộc vào đường kính chùm tia laser, hệ thu quang, thể tích mẫu nhiệt độ; σv mặt cắt ngang Raman kiểu dao động định; vL số sóng tia laser; vβ số sóng kiểu dao động; P0 cơng suất tia laser Mặt cắt ngang σv đặc trưng cho chất kiểu dao động định Thể tích mẫu xác định kích thước tiêu điểm chùm tia laser mẫu, phần quang học dùng để hội tụ, tính chất quang học thân mẫu Kích thước điểm chiếu laser mẫu thay đổi từ μm cho vi đầu dò đến mm cho hệ mẫu diện tích lớn Với phổ kế Raman đo số photon giây (như phổ kế Raman có ghép-thay đổi (change-coupled device [CCD]-Raman spectrometers) dùng phương trình sau: Sv = KσvvL(vL - vβ)3 P0C Từ phương trình nêu trên, ta thấy tín hiệu pic tỷ lệ thuận với nồng độ Mối quan hệ tuyến tính sở cho đa số áp dụng định lượng phổ Raman CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VIỆC ĐỊNH LƯỢNG Các yếu tố mẫu Các yếu tố thuộc mẫu quan trọng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc định lượng phổ Raman huỳnh quang, làm nóng mẫu, hấp thụ mẫu hay thân mẫu ảnh hưởng phân cực Nếu mẫu có chất huỳnh quang tín hiệu đo thường có phần đóng góp huỳnh quang Chỉ quan sát huỳnh quang bước sóng tia laser kích thích xen phủ lên dải hấp thụ chất huỳnh quang Huỳnh quang quan sát thấy rộng dốc nằm đường cong phổ Raman Sự huỳnh quang làm cho đường bị chênh làm giảm tỷ số tín hiệu nhiễu Khoảng bước sóng cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần hóa học vật liệu huỳnh quang Vì huỳnh quang thường có hiệu suất mạnh so với tán xạ Raman, nên chút tạp huỳnh quang làm cho tín hiệu Raman suy giảm đáng kể Có thể làm giảm ảnh hưởng huỳnh quang cách sử dụng nguồn kích thích có bước sóng dài 785 nm 1064 nm (bước sóng dài số sóng nhỏ hơn) Tuy nhiên, nên nhớ cường độ tín hiệu Raman tỷ lệ với (vL - vβ)4 ưu điểm việc sử dụng tia laser kích thích có bước sóng dài để làm giảm thiểu huỳnh quang bù trừ phần cho làm yếu tín hiệu Raman bước sóng dài Tỷ số tín hiệu nhiễu lớn đạt cách cân yếu tố loại bỏ huỳnh quang, cường độ tín hiệu đáp ứng detector Huỳnh quang chất rắn đơi làm yếu cách phơi mẫu xạ laser khoảng thời gian trước đo Sự giảm huỳnh quang không rõ rệt lượng chất huỳnh quang dạng vết mẫu chất lỏng Sự làm nóng mẫu tia laser tạo số hiệu ứng khác nóng chảy, thay đổi trạng thái thù hình, cháy mẫu Mẫu dễ bị nóng điểm chiếu mẫu có kích thước nhỏ tức dùng vi đầu dị Nóng mẫu thường vấn đề vật liệu có màu, có tính hấp thụ mạnh hay hạt nhỏ có khả truyền nhiệt thấp Ảnh hưởng làm nóng mẫu thường quan sát dạng thay đổi phổ Raman theo thời gian, kiểm tra mẫu mắt Để giảm thiểu nóng mẫu tia laser, bên cạnh việc làm giảm luồng laser, sử dụng nhiều phương pháp khác di chuyển mẫu hay di chuyển tia laser đo hay cải thiện truyền nhiệt từ mẫu cách nhúng vào chất lỏng Tín hiệu Raman hấp thụ mẫu thân mẫu Điều xảy nhiều với hệ máy FT-Raman bước sóng dài Ở đây, tín hiệu Raman xen phủ với dải hấp thụ hòa cao (overtone) NIR Hiệu ứng phụ thuộc vào quang hệ thống cách trình bày mẫu, khác kích thước hạt chất rắn Dù sao, hiệu ứng không nghiêm trọng phổ NIR Cuối cùng, nên biết xạ laser phân cực phổ Raman chất kết tinh mẫu định hướng khác khác đáng kể, phụ thuộc vào cách mẫu định vị Nếu máy phổ Raman cho xạ phân cực phẳng mẫu nên dùng trộn (scrambler) phân cực việc phân tích mẫu hàng ngày Các yếu tố lấy mẫu Thuật ngữ lấy mẫu hiểu phương cách lấy thông tin từ mẫu Kỹ thuật phổ Raman kỹ thuật khơng, nghĩa khơng có mẫu tín hiệu detector khơng Trong phổ hấp thụ ngược lại, khơng có mẫu tín hiệu detector lại cực đại (T = 100%) Các kỹ thuật không vốn nhạy, thay đổi nhỏ nồng độ chất mẫu có thay đổi cường độ tín hiệu theo tỷ lệ tương ứng Các nguồn sáng khác (như tia lạc) làm thay đổi tín hiệu đo Ngồi ra, tín hiệu lớn huỳnh quang tạo làm tăng mức nhiễu Vì thế, việc dùng tín hiệu Raman tuyệt đối để xác định trực tiếp chất phân tích khó khăn Các yếu tố khác thay đổi độ đục độ không đồng mẫu, thay đổi công suất laser chiếu lên mẫu thay đổi vị trí mẫu Có thể giảm thiểu ảnh hưởng cách lấy mẫu cách ổn định, có tính đại diện Thiết kế cẩn thận thiết bị giảm bớt khơng thể loại bỏ hồn tồn ảnh hưởng Có nhiều cách để hạn chế dao động kết thăng giáng cường độ tuyệt đối gây nên Cách thông dụng hiệu thêm chất chuẩn nội sử dụng pic tách khỏi chất chuẩn đó; dùng dải hình thành phần phân tử vịng thơm mà mặt cắt ngang Raman không thay đổi theo cách chuẩn bị mẫu Với phổ dung dịch, sử dụng pic dung mơi tách biệt dung mơi tương đối thay đổi từ mẫu sang mẫu khác Cũng vậy, với chế phẩm, dùng pic tá dược pic đáng kể so với pic chất phân tích Với giả thiết thay đổi định hướng tia laser hay mẫu có ảnh hưởng đồng lên tồn phổ, tồn phổ sử dụng phổ đối chiếu Một yếu tố quan trọng thứ hai lấy mẫu cần xem xét tạp nhiễm phổ Tán xạ Raman hiệu ứng yếu, bị che lấp số yếu tố bên Các nguồn tạp nhiễm thông thường dị biệt giá mẫu (như bình chứa hay giá thể/cơ chất) ánh sáng môi trường xung quanh Những vấn đề xác định giải qua thực nghiệm thận trọng THIẾT BỊ Các phận Tất thiết bị phổ Raman đại có q trình đo bao gồm việc chiếu chùm tia laser lên mẫu, thu nhận tia tán xạ, loại bỏ tia tán xạ Rayleigh, tách tia Raman theo bước sóng, cho kết phổ Raman Để thực cơng việc trên, tất máy phổ Raman thị trường có phận sau đây: • Nguồn laser kích thích • Bộ phận lấy mẫu • Bộ phận lọc/loại bỏ tán xạ bước sóng laser • Bộ xử lý bước sóng • Detector mảng điện tử Nguồn laser kích thích Bảng nhiều nguồn laser thông dụng ngành Dược phổ Raman Các laser UV dùng cho ứng dụng chuyên biệt khác, chúng có điểm bất lợi cho phép đo phân tích Vì ngày có nhiều áp dụng laser UV đưa ra, có khả chúng dùng kỹ thuật phổ Raman Bảng Các nguồn laser ứng dụng ngành Dược Laser λ, nm (số ngun gần nhất) Loại Cơng Dải bước sóng (Vùng suất Stokes, độ dịch nguồn chuyển 100 cm-1 đến laser 3000 cm-1) Chú thích Laser cận hồng ngoại (NIR) 1064 Hộp trọn Cho đến (Nd:YAG) W 1075-1563 Thường dùng máy chuyển dạng Fourier 830 Diod Cho đến 300 mW 827 - 980 Điền hình có giới hạn đến 2000 cm1 ; chuyển dịch Raman đáp ứng phổ CCD; phổ biến laser khác 785 Diod Cho đến 500 mW 791 -1027 Nguồn laser tán sắc sử dụng rộng rãi Hỗn hợp dung môi: Thêm 3,0 ml acid acetic băng (TT) vào 900 ml nước đựng cốc dung tích lít, điều chỉnh đến pH 4,0 dung dịch natri hydroxyd M (TT), trộn Chuyển vào bình định mức, thêm nước vừa đủ 1000 ml Trộn 20 thể tích dung dịch thu với 80 thể tích acetonitril (TT) Lắc Dung dịch chuẩn: Hòa tan simvastatin chuẩn hỗn hợp dung môi để dung dịch có nồng độ xác khoảng 0,1 mg/ml Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên nghiền thành bột mịn Cân xác lượng bột viên tương ứng 20 mg simvastatin cho vào bình định mức 200 ml, thêm 120 ml dung hỗn hợp dung môi, lắc, siêu âm 15 min, để nguội đến nhiệt độ phịng, thêm hỗn hợp dung mơi vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm) Nhiệt độ cột: 45 oC Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 238 nm Tốc độ dịng: 1,5 ml/min Thể tích tiêm: 10 µl Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn Phép thử có giá trị hệ số dung lượng k’ khơng nhỏ 3,0 Hiệu lực cột không nhỏ 4500 đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng pic simvastatin nhỏ 2,0; độ lệch chuẩn tương đối pic simvastatin không 2,0 % Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn dung dịch thử Tính hàm lượng simvastatin,C 25H38O5, chế phẩm dựa vào diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng C25H38O5 simvastatin chuẩn Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng, để nơi nơi khơ mát nhiệt độ phịng Loại thuốc Chống tăng lipid máu Hàm lượng thường dùng mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg VIÊN NÉN TELMISARTAN Tabellae Telmisartani Là viên nén chứa telmisartan Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu chuyên luận “Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) yêu cầu sau đây: Hàm lượng telmisartan, C33H30N4O2, từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi nhãn Định tính A Trong phần Độ hòa tan, phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1) dung dịch thử phải tương ứng với phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch chuẩn B Trong phần Định lượng, thời gian lưu pic sắc ký đồ dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu pic telmisartan sắc ký đồ dung dịch chuẩn Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) Pha động A: Hòa tan 0,5 g kali dihydrophosphat (TT) 1000 ml nước, thêm ml triethylamin (TT), điều chỉnh đến pH 3,2 acid phosphoric (TT) Pha động B: Acetonitril (TT) Dung mơi pha mẫu: Hịa ml triethylamin (TT) 800 ml nước, thêm 200 ml methanol (TT) Dung dịch thử: Cân 20 viên, nghiền thành bột mịn Phân tán lượng bột viên tương ứng với 100 mg telmisartan 100,0 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm khoảng 45 lọc Dung dịch đối chiếu: Dung dịch có chứa telmisartan chuẩn dung mơi pha mẫu, nồng độ 0,005 mg/ml Điều kiện sắc ký Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C (5 µm) Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 298 nm Tốc độ dịng: 1,8 ml/min Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung mơi sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt)) Pha động B (% tt/tt) 78 22 80 20 70 30 15 60 40 25 60 40 26 40 60 35 20 80 40 78 22 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu, phép thử có giá trị số đĩa lý thuyết không nhỏ 3000, hệ số đối xứng không lớn độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic từ lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu không lớn 5,0 % Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, sắc ký đồ thu được, pic phụ khơng có diện tích lớn diện tích pic sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (0,5 %) Tổng diện tích pic phụ khơng lớn lần diện tích pic sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2,0 %) Bỏ qua pic có diện tích nhỏ 0,1 lần diện tích pic sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (0,05 %) Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy Mơi trường hịa tan: 900 ml dung dịch đệm pH 7,5 Tốc độ quay: 75 r/min Thời gian: 30 Dung dịch đệm pH 7,5: Hòa tan 13,61 g kali dihydrophosphat (TT) 800 ml nước, điều chỉnh đến pH 7,5 dung dịch natri hydroxyd M (TT), thêm nước đến vừa đủ 1000 ml Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy phần dịch hòa tan lọc, loại bỏ dịch lọc đầu Pha lỗng dịch lọc với mơi trường hịa tan để thu dung dịch có nồng độ telmisartan khoảng 0,011 mg/ml Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 44 mg telmisartan chuẩn chuyển vào bình định mức 100 ml Thêm ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) pha loãng với methanol (TT) vừa đủ thể tích Pha lỗng dung dịch với mơi trường hịa tan để thu dung dịch có nồng độ telmisartan khoảng 0,011 mg/ml Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) dung dịch thu bước sóng cực đại khoảng 296 nm, cốc đo dày cm, dùng mơi trường hịa tan làm mẫu trắng Tính hàm lượng telmisartan, C33H30N4O2, hòa tan viên dựa vào độ hấp thụ đo dung dịch chuẩn, dung dịch thử hàm lượng C33H30N4O2 telmisartan chuẩn u cầu: Khơng 75 % lượng telmisartan, C 33H30N4O2, so với lượng ghi nhãn hòa tan 30 Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) Dung dịch đệm: Hòa tan 2,72 g kali dihydrophosphat (TT) vừa đủ 1000 ml nước, thêm ml triethylamin (TT) chỉnh đến pH 2,4 acid phosphoric (TT) Pha động: Dung dịch đệm - acetonitril (60: 40) Dung mơi pha mẫu: Hịa ml triethylamin (TT) 800 ml nước, thêm 200 ml methanol (TT) Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 40 mg telmisartan chuẩn, hịa tan pha lỗng dung mơi pha mẫu vừa đủ 100,0 ml Pha lỗng 5,0 ml dung dịch thu thành 50,0 ml dung mơi pha mẫu Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên nghiền thành bột mịn Cân xác lượng bột viên tương ứng với 40 mg telmisartan vào bình định mức 100 ml, thêm 80 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm khoảng 45 Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm dung mơi pha mẫu vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 50,0 ml với dung mơi pha mẫu Điều kiện sắc ký Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C (5 µm) Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 298 nm Tốc độ dịng: ml/min Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, phép thử có giá trị số đĩa lý thuyết không nhỏ 3000, hệ số đối xứng pic telmisartan không lớn 2,0; độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic từ lần tiêm lặp lại không lớn 2,0 % Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn dung dịch thử Tính hàm lượng telmisartan, C33H30N4O2, viên dựa vào diện tích pic telmisartan thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng C 33H30N4O2 telmisartan chuẩn Bảo quản Để nơi mát, đồ đựng kín, tránh ánh sáng Loại thuốc Đối kháng thụ thể angiotensin II (loại AT1) Hàm lượng thường dùng 20 mg; 40 mg; 80 mg PHẦN DƯỢC LIỆU BÁN BIÊN LIÊN Herba Lobeliae chinensis Tồn phơi hay sấy khơ Bán biên liên (Lobelia chinensis Lour.), họ Hoa chuông (Campanunlaceae) Mô tả Thường với tạo thành khối Thân rễ có màu vàng nâu nhạt, mặt ngồi nhẵn có nếp nhăn dọc nhỏ, đường kính mm đến mm Rễ nhỏ mảnh, màu vàng, mang nhiều rễ phụ Thân nhỏ, mảnh, phân nhánh nhiều, màu lục xám, có nhiều nốt sần nhỏ, đơi mang rễ sợi Lá mọc so le, khơng cuốn, phiến hình giáo hẹp, dài cm đến 2,5 cm, rộng cm đến cm, mép có cưa nông, thưa, thường xoăn lại, màu nâu lục Hoa nhỏ có cuống mảnh, mọc đơn độc, tràng hoa dính liền thành ống phần dưới, xẻ thùy phần trên, quay sang phía, màu đỏ tím nhạt, có lơng tơ mịn mặt ống tràng Mùi nhẹ, vị ngọt, cay Bột Màu lục vàng xám màu vàng nâu nhạt Tế bào biểu bì có thành lồi lên, uốn lượn, lỗ khí kiểu hỗn bào có tế bào đến tế bào kèm Mạch xoắn, mạch lưới có đường kính µm đến 34 µm Bó tinh thể calci oxalat thường thấy bên bó mạch, đơi xếp thành hàng, ống nhựa mủ chứa giọt dầu Tế bào mô mềm hình chữ nhật, thành dày lên, chứa hạt inulin Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel G Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (9:1) Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 50 ml methanol (TT), siêu âm 30 min, để nguội, lọc Bay dịch lọc tới khơ hịa tan cắn ml methanol (TT) dung dịch chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Bán biên liên (mẫu chuẩn), tiến hành chiết dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol (TT), sấy mỏng 105 oC đến vết rõ Quan sát mỏng ánh sáng ban ngày ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết giá trị R f màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Độ ẩm Không 10,0 % (Phụ lục 9.6, g, h) Chất chiết dược liệu Khơng 12,0 % tính theo dược liệu khô kiệt Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (Phụ lục 12.10) dùng ethanol 96 % (TT) làm dung môi Chế biến Thu hái vào mùa hạ, loại bỏ tạp chất, rửa sạch, cắt đoạn, phơi sấy khơ Bảo quản Để nơi khơ, mát Tính vị, quy kinh Vị ngọt, cay, tính hàn Vào kinh tâm, tiểu tràng, phế Công năng, chủ trị Thanh tâm, giải độc, lợi tiểu, tiêu sưng Chủ trị: Ung nhọt sưng đau, côn trùng rắn độc cắn, bụng chướng to, phù thũng, viêm gan vàng da, eczema Liều lượng, cách dùng Ngày dùng g đến 15 g, dạng thuốc sắc, hãm; thường phối hợp với vị thuốc khác CAO ĐẶC DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG Extractum Phyllanthi amari spissum Cao đặc diệp hạ châu bào chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) phương pháp thích hợp để chế phẩm có hàm lượng hoạt chất ổn định Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu chuyên luận “Cao thuốc” (Phụ lục 1.1) yêu cầu sau đây: Mô tả Thể chất mềm, dẻo, đồng Màu nâu sẫm đến đen Mùi hăng đặc biệt Vị đắng Định tính A Lấy 0,5 g chế phẩm, thêm 50 ml ethanol 90 % (TT), lắc đều, đun hồi lưu cách thủy 30 Lọc, bay dịch lọc cách thủy đến khoảng 10 ml, chuyển vào ống nghiệm, ống ml dịch chiết để làm phản ứng sau đây: Ống 1: Thêm - giọt acid hydrocloric (TT), thêm bột magnesi (TT), xuất màu đỏ Ống 2: Thêm - giọt dung dịch sắt (III) clorid % (TT), xuất màu xanh tím B Lấy 0,1 g chế phẩm, thêm ml nước, đun sôi vài lọc Để nguội, lấy ml dịch lọc thêm - giọt dung dịch gelatin % (TT), xuất tủa trắng C Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (7: 3) Dung dịch thử: Lấy 0,5 g chế phẩm, hịa tan 20 ml nước nóng, để nguội, kiềm hóa amoniac (TT) đến pH -10, lắc dung dịch thu với cloroform (TT) lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết cloroform, bay cách thuỷ đến khoảng ml, dùng làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Lấy g Diệp hạ châu đắng (mẫu chuẩn), thêm 100 ml nước, đun sôi nhẹ 30 min, để nguội, lọc Cơ dịch lọc cách thủy đến cịn 20 ml, để nguội, kiềm hóa amoniac (TT) đến pH - 10, lắc dung dịch thu với cloroform (TT) lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết cloroform, bay cách thủy đến khoảng ml, dùng làm dung dịch đối chiếu Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 20 µl dung dịch Sau triển khai, lấy mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí phun thuốc thử Dragendorff (TT) Sắc ký đồ thu dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu D Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Dung môi khai triển: n-Hexan - ethyl acetat (2:1) Dung dịch thử: Lấy 0,4 g chế phẩm, hòa tan 20 ml nước nóng, để nguội, lắc kỹ dung dịch thu với cloroform (TT) lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết cloroform, bay cách thủy đến cắn, hòa tan cắn ml ethanol (TT), dùng làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu (1): Lấy g Diệp hạ châu đắng cắt nhỏ (mẫu chuẩn), thêm 100 ml nước, đun sôi nhẹ 30 min, để nguội, lọc Cô dịch lọc cách thủy đến 20 ml, để nguội, lắc dịch thu với cloroform (TT) lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết cloroform, bay cách thuỷ đến cắn, hòa tan cắn ml ethanol (TT) Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan phyllanthin chuẩn ethanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai, lấy mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí phun dung dịch acid sulfuric 10 % (TT) Sấy mỏng 120 o C đến rõ vết Quan sát mỏng ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ thu dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị R f với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (1) (2) Mất khối lượng làm khô Không 20,0 % (Phụ lục 9.6, g, 85 oC, h) Tro tồn phần Khơng 10,0 % (Phụ lục 9.8) Tro không tan acid hydrocloric Không 0,15 % (Phụ lục 9.7) Cắn khơng tan nước Hịa tan 1,0 g chế phẩm 50 ml nước cất nóng, lọc qua giấy lọc cân bì, rửa cắn giấy lọc nước cất nước rửa không màu, sấy cắn giấy lọc 100 oC đến 105 oC h, lấy để nguội bình hút ẩm 30 min, cân nhanh để xác định khối lượng cắn Lượng cắn khơng q 1,0 % tính theo chế phẩm khô kiệt pH Dung dịch chế phẩm 1,0 % nước phải có pH từ 6,0 đến 7,0 (Phụ lục 6.2) Kim loại nặng Không 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8) Lấy g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp Dùng ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) Pha động: Pha động A: Methanol (TT) Pha động B: Dung dịch acid phosphoric 0,1 % (TT) Dung dịch chuẩn: Hòa tan phyllanthin chuẩn methanol (TT) để dung dịch có nồng độ xác khoảng 30 µg/ml Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,2 g chế phẩm xác định độ ẩm vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm ml nước, lắc kỹ để phân tán mẫu Thêm 30 ml methanol (TT), lắc siêu âm 30 Để nguội, bổ sung methanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C (5 µm) Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt bước sóng 230 nm Tốc độ dịng: 1,3 ml/min Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0-25 65 35 25-26 65 → 80 35 → 20 26-34 80 20 34-35 80 → 65 20 → 35 35-45 65 35 Tiêm dung dịch chuẩn, dung dịch thử Ghi sắc ký đồ Tính hàm lượng phyllanthin chế phẩm dựa vào diện tích pic sắc ký đồ thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng C24H34O6 phyllathin chuẩn Hàm lượng phyllanthin (C24H34O6) không 0,5 % tính theo chế phẩm khơ kiệt Bảo quản Bảo quản bao bì hút chân khơng, chống ẩm Để nơi khơ, mát CAO KHƠ HUYẾT GIÁC Extractum Dracaenae siccus Cao khô Huyết giác điều chế từ phần gỗ có chứa nhựa Huyết giác Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep Dracaena cochinchinensis (Lour.) S.C.Chen, họ Huyết giác (Dracaenaceae) cách chiết ethanol 96 % hay dung mơi thích hợp khác Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu chuyên luận “Cao thuốc” (Phụ lục 1.1) yêu cầu sau đây: Mô tả Bột màu nâu đỏ, mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị chát Không tan nước, ether dung dịch acid loãng; tan methanol, ethanol dung dịch kiềm lỗng Định tính A Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel HF254 chứa 0,3 % natri carboxymethylcelulose, hoạt hóa 105 oC 30 Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (99: 1) Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,5 g chế phẩm, thêm 25 ml ether dầu hỏa (40 oC đến 60 oC) (TT) lắc siêu âm 15 Để nguội, lọc, giữ lại cắn cho phép thử B Cô dịch lọc cách thủy đến cạn, hòa cắn ml cloroform (TT) dung dịch chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Huyết giác (mẫu chuẩn) cho vào bình nón, thêm 20 ml ethanol 96 % (TT), lắc siêu âm 15 min, lọc Cô dịch lọc cách thủy đến cạn Thêm vào cắn 25 ml ether dầu hỏa (40 oC đến 60 oC) (TT) lắc siêu âm 15 Để nguội, lọc, giữ lại cắn cho phép thử B Cơ dịch lọc cách thủy đến cạn, hịa cắn ml cloroform (TT) dung dịch chấm sắc ký Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi được khoảng 12 cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol, sấy mỏng 110 oC đến rõ vết Quan sát mỏng đèn tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu B Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel HF254 chứa 0,3 % natri carboxymethylcellulose hoạt hóa 105 oC 30 Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa (40 oC đến 60 oC) - ethyl acetat (10: 1) Dung dịch thử: Lấy cắn thu phần dung dịch thử phép thử A, để cách thủy cho bay hết ether dầu hỏa, thêm 25 ml ethyl acetat (TT), lắc siêu âm 15 min, để nguội, lọc Cô dịch lọc cách thủy đến khoảng ml, để nguội chuyển lên cột thủy tinh đường kính khoảng 10 mm có chứa g chất nhồi polyamid xử lý, kích thước hạt 14 - 20 µm, nhồi ướt Rửa giải 100 ml ethanol 50 % (TT) với tốc độ 1,5 ml/min, loại bỏ dịch rửa giải Tiếp tục rửa giải 50 ml ethanol (TT) với tốc độ 1,5 ml/min, gộp dịch rửa giải, cô cách thủy đến cạn, hòa cắn ml cloroform (TT) dung dịch chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu: Lấy cắn thu phần dung dịch đối chiếu phép thử A, tiến hành chiết mô tả phần Dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 12 cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol (TT) Sấy mỏng 110 oC đến rõ vết Quan sát mỏng đèn tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Xử lý polyamid: Lấy polyamid vào cốc có mỏ, thêm ethanol 96 % (TT) ngập bề mặt, khuấy đều, sau hết bọt khí chuyển tồn hỗn hợp vào cột thủy tinh có khóa, đường kính thích hợp (từ 10 mm trở lên), dùng ethanol 90-95 % (TT) để rửa dịch rửa suốt Rửa tiếp hỗn hợp dung dịch natri hydroxyd % - nước cất (2,5: 1) có chứa 2,5 % acid acetic (TT), cuối rửa nước cất đến nước rửa trung tính, lấy polyamid rửa để khơ nhiệt độ phòng C Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel 60F254, hoạt hóa 105 oC 30 Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (9: 1) Dung dịch thử: Hòa tan 0,15 g chế phẩm 10 ml ethanol 96 % (TT) dung dịch chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Huyết giác (mẫu chuẩn) cho vào bình nón, thêm 10 ml ethanol 96 % (TT), lắc siêu âm 10 min, lọc, dùng dịch lọc làm dung dịch chấm sắc ký Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 12 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol (TT) Sấy mỏng 110 oC đến rõ vết Quan sát mỏng ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu D Trong phần định lượng, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu với thời gian lưu pic loureirin B sắc ký đồ dung dịch chuẩn Độ hấp thụ Cân xác khoảng 20 mg chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml ethanol (TT), lắc kỹ để hòa tan, thêm ethanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc Loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu, hút xác 5,0 ml dịch lọc sau vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu (Phụ lục 4.1) bước sóng 284 nm, mẫu trắng ethanol (TT) Độ hấp thụ đo không 0,40 Cắn không tan ethanol Không 1,5 % Cân xác khoảng 1,0 g chế phẩm vào bình nón nút mài 100 ml, thêm 50 ml ethanol (TT), ngâm 30 min, tiếp tục lắc mạnh để hòa tan 20 Lọc qua giấy lọc (đã sấy 105 oC h cân trước), rửa cắn ethanol (TT) đến dịch lọc không màu Sấy giấy lọc cắn 105 o C h Để nguội bình hút ẩm 30 cân nhanh Tính hàm lượng phần trăm chất không tan ethanol theo chế phẩm khô kiệt Tro tồn phần Khơng q 1,0 % (Phụ lục 9.8, phương pháp 1) Kim loại nặng Không 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8) Lấy g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp Dùng ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu Mất khối lượng làm khô Không 7,0 % (Phụ lục 9.6) (1 g; 100 oC; h) Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) Pha động: Dung dịch acid acetic %- acetonltril (61: 39), điều chỉnh tỷ lệ cần Dung dịch thử: Cân xác khoảng 3,5 g chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml methanol (TT), lắc siêu âm 15 min, để nguội, thêm methanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc Lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu, hút xác 5,0 ml dịch lọc sau vào bình định mức 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch chuẩn: Hòa tan Loureirin B chuẩn methanol (TT) để dung dịch có nồng độ xác khoảng 0,45 mg/ml Hút xác 5,0 ml dung dịch vào bình định mức 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lọc qua màng 0,45 µm Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (250 mm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm) tương đương Cột Inertsil ODS-3 thích hợp Tốc độ dịng: 1,0 ml/min Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 276 nm Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn dung dịch thử Tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu, ghi lại thời gian lưu, diện tích pic loureirin B Dựa vào diện tích pic loureirin B sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng C 18H20O5 loureirin B chuẩn để tính hàm lượng loureirin B chế phẩm Hàm lượng loureirin B (C18H20O5) chế phẩm khơng 0,45 % tính theo chế phẩm khơ kiệt Bảo quản Đựng bao bì kín, để nơi khơ ráo, thống mát, tránh ánh sáng CƠN BỐ Laminariae Thallus Tồn phơi sấy khơ Tảo dẹt (Laminaria japonica Aresch.) Eckolonia kurome Okam, họ Côn bố (Laminariaceae) Mô tả Laminaria japonica: Thường cuộn bết lại với thành bó, thành khối Dược liệu có màu lục nhạt, màu nâu ánh lục màu nâu đen, bên ngồi có lớp bột màu trắng Phần gốc có dạng sợi hình trụ, mang nhiều sợi nhỏ, màu nâu đen Sau ngâm nước, trương nở thành dải, dài 50 cm đến 150 cm, rộng 10 cm đến 40 cm, dày lên phần giữa, mỏng và uốn lượn mép Chất dai Mùi rong biển, vị mặn Eckolonia kurome: Thường cuộn, xoắn lại thành khối trịn khơng Dược liệu có màu đen Sau ngâm nước, trương nở thành dạng lá, dài rộng từ 16 cm đến 26 cm, dày 1,6 mm; hai mặt có gân dạng chân vịt, thùy dẹt mỏng, mép có cưa nguyên Chất xốp trơn mượt Định tính A Khi ngâm nước trương nở, dày lên, mặt ngồi nhẵn, có dịch nhớt chất nhày suốt Khi ngón tay, khơng cuộn thành nhiều lớp (đối với L japonica) cuộn lại (đối với E kurome) B Ngâm khoảng 10 g dược liệu cắt thành mảnh nhỏ 200 ml nước vài giờ, lọc cô dịch lọc đến khoảng 100 ml Lấy ml đến ml dịch thu được, thêm giọt acid nitric (TT) vài giọt dung dịch bạc nitrat % (TT), tủa keo màu vàng tạo thành, tủa khó tan amoniac (TT) khơng tan acid nitric (TT) Định lượng Cân xác khoảng 10 g dược liệu cắt thành mảnh nhỏ, cho vào chén nung, sấy nhiệt độ 100 o C 10 min, nung 400 oC đến 500 oC 40 Để nguội chuyển cắn nung vào cốc có mỏ, thêm 100 ml nước, đun sơi khoảng lọc Làm cắn thêm lần nữa, lần 100 ml nước, gộp dịch lọc, rửa cắn lần, lần nước nóng Gộp dịch rửa dịch lọc, đến khoảng 80 ml Để nguội, chuyển dịch thu vào bình định mức 100 ml pha lỗng nước đến vạch Lấy xác ml dịch thu cho vào bình thủy tinh có nắp, thêm 50 ml nước giọt dung dịch đỏ methyl (TT), thêm giọt dung dịch acid sulfuric loãng (TT) đến màu đỏ tạo thành Thêm ml dung dịch brom vừa pha (TT), đun sôi, thêm ml dung dịch natri format 20 % dọc theo thành bình đựng, đun sơi 10 đến 15 Rửa thành bình nước nóng, để nguội, thêm ml dung dịch acid sulfuric loãng (TT) ml dung dịch kali iodid 15 % (TT), chuẩn độ dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) tới dung dịch chuyển màu vàng nhạt, thêm ml dung dịch hồ tinh bột (TT), tiếp tục chuẩn độ hết màu xanh ml dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (TT) tương đương với 0,2115 mg I Chế phẩm phải chứa khơng 0,35 % I (đối với L japonica) khơng 0,20 % I (đối với E kurome), tính theo dược liệu khô kiệt Chế biến Thu hoạch vào mùa hè mùa thu, vớt lấy tồn cây, phơi sấy khơ Trước dùng, loại bỏ tạp chất, rửa sạch, để nước, cắt thành sợi rộng, phơi khô Bảo quản Nơi khơ mát Tính vị, quy kinh Vị mặn, tính hàn Vào kinh can, vị, thận Công năng, chủ trị Nhuyễn kiên, hành thủy Chủ trị: Bướu cổ, tràng nhạc, sán khí, phù thũng Cách dùng, liều lượng Ngày dùng g đến 12 g dạng thuốc sắc hoàn tán Thường phối hợp với vị thuốc khác NGOI (Lá) Folium Solani erianthi Cà ngoi Lá phơi hay sấy khô Ngoi (Solanum erianthum D Don), họ Cà (Solanaceae) Mô tả Lá phơi hay sấy khô có màu xanh xám Cuống phủ lớp lơng mịn hình sao, dài 1,5 cm đến 5,5 cm Phiến thn hình trứng hay elip, dài 10 cm đến 29 cm, rộng từ cm đến 12 cm Mùi hắc, khai; vị đắng, cay Vi phẫu Vi phẫu có thiết diện đối xứng qua trục Cấu tạo gồm có phần: Gân lá: Mặt lồi, mặt lồi Biểu bì gồm tế bào hình chữ nhật xếp thành lớp Tế bào biểu bì mang lơng che chở đa bào hình (5 đến 11 tế bào) lông tiết dầu đa bào (4 đến tế bào), chân đa bào (2 tế bào) Mô dày gồm đến dãy tế bào thành dày Bó libe-gỗ hình cung xếp gân lá, gồm cung libe bao quanh cung gỗ Mô mềm gồm tế bào hình trịn hay nhiều cạnh, thành mỏng, nằm mơ dày bó libe, tế bào chứa tinh thể calci oxalat dạng cát nằm rải rác Phiến lá: Biểu bì biểu bì gồm lớp tế bào mang lông che chở đa bào lơng tiết đa bào Nằm sát lớp biểu bì mơ giậu, cấu tạo tế bào hình chữ nhật xếp đứng cạnh Dưới mô giậu mô mềm cấu tạo tế bào không đều, thành mỏng Bột Bột có màu xanh xám, xốp Quan sát kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì mang lỗ khí; mảnh mạch xoắn; tinh thể calci oxalat hình cầu gai; lơng che chở đa bào; lơng tiết chân tế bào, đầu đa bào Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel G Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (10: 1) Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 70 ml dung dịch acid acetic %, ngâm qua đêm Lọc dịch chiết qua giấy lọc Kiềm hóa dịch lọc amoniac (TT) đến pH 9,5 -10, chiết lần với cloroform (TT), lần 30 ml Gộp dịch chiết cloroform, thu hồi dung môi đến cắn, hòa tan cắn ml methanol (TT) dung dịch chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Ngoi (mẫu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần Dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng để khơ khơng khí, phun thuốc thử Dragendorff (TT) Sắc ký đồ dung dịch thử quan sát ánh sáng thường phải có vết chính, có màu từ xanh đến xanh tím, màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Độ ẩm Không 13,0 % (Phụ lục 9.6, g, 100 oC, h) Tạp chất Không 1,0% (Phụ lục 12.11) Tỷ lệ vụn nát Qua rây có kích thước mắt rây mm: Không % (Phụ lục 12.12) Tro tồn phần Khơng q 14,0 % (Phụ lục 9.8) Định lượng Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1) Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 0,05 g solasodin chuẩn, cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol (TT), lắc cho tan hết solasodin, thêm tiếp methanol (TT) đến vạch lắc Dung dịch thử: Cân xác khoảng 1,0 g bột dược liệu (qua rây 1,25 mm), đun hồi lưu cách thủy h với 50 ml dung dịch acid acetic % methanol Để nguội, lọc, rửa bã dược liệu lần, lần 30 ml dung dịch acid acetic % methanol Gộp dịch lọc dịch rửa, thu hồi dung môi cô chân không 50 0C tới khô Dùng methanol (TT) để hịa tan chuyển tồn cắn vào bình định mức 25 ml, thêm methanol (TT) đến vạch Đậy nút lắc Lọc Cách tiến hành: Lần lượt cho vào bình gạn dung tích 50 ml dung dịch sau: Dung dịch sử dụng Dung dịch đệm phosphat 0,1 M pH 8,0 (TT) Bình dung dịch chuẩn (ml) Bình Bình mẫu trắng dung dịch thử (ml) (ml) 5 Dung dịch xanh bromothymol 0,2 % (Hòa tan 0,2 g xanh bromthymol (TT) ethanol 20 % (TT), thêm ethanol 20 % vừa đủ 100 ml) 0,5 0,5 0,5 Dung dịch solasodin chuẩn (0,5 mg/ml) 0,5 0 Dung dịch thử 0,5 Methanol (TT) 0 0,5 Cloroform (TT) 10 10 10 Lắc kỹ bình 15 min, sau để yên khoảng 30 cho phân lớp Gạn lấy lớp cloroform vào bình gạn khác Lắc lớp cloroform với 10 ml dung dịch natri hydroxyd 0,05 N (TT) Để yên 30 cho phân lớp Gạn lấy dung dịch kiềm màu xanh Đo độ hấp thụ bước sóng 616 nm (Phụ lục 4.1) dung dịch kiềm thu Tính hàm lượng glycoalcaloid mẫu thử theo solasodin dựa vào độ hấp thụ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng C27H43NO2 solasodin chuẩn Hàm lượng glycoalcaloid toàn phần dược liệu khơng 0,45 % tính theo solasodin (C27H43NO2) theo dược liệu khô kiệt Chế biến Thu hái quanh năm, phơi hay sấy khô nhiệt độ 50 oC đến 60 oC Có thể dùng tươi Bảo quản Để nơi khơ, thống mát Tính vị, qui kinh Vị đắng, cay, tính ấm, có độc Cơng năng, chủ trị Thanh nhiệt tiêu thũng, sát trùng, huyết, hành khí thống, sinh thu liễm Chủ trị: Đau dày, phong thấp tê bại, mụn nhọt ung độc, đòn ngã tổn thương, gẫy xương, bệnh bạch cầu hạt mạn tính Dùng ngồi trị viêm da có mủ, lòi dom, hắc lào, lao hạch Cách dùng, liều lượng Ngày dùng 10 g đến 15 g, dạng thuốc sắc Dùng ngồi: Lượng thích hợp, rửa sạch, đập dập, nóng, đắp vào chỗ đau PHẦN VẮC XIN VẮC XIN PHẾ CẦU Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum Định nghĩa Vắc xin phế cầu (dạng polysacharid) chế phẩm gồm 23 kháng nguyên vỏ polysaccharid tinh khiết pha với tỷ lệ chủng phế cầu S pneumoniae (gọi tắt kháng nguyên phế cầu): 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17A 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F Vắc xin phế cầu chế phẩm dạng lỏng, suốt không màu Sản xuất Chủng gốc chủng sản xuất Sản xuất vắc xin phải dựa vào hệ chủng giống cho loại typ Chủng S pneumoniae dùng để sản xuất vắc xin phế cầu polysacharid phải quan Kiểm định quốc gia chấp thuận Mỗi chủng phải có khả sản sinh polysaccharid typ huyết tương ứng với sản lượng ổn định, đủ đáp ứng miễn dịch an toàn cho người Mỗi chủng gốc phải có hồ sơ chủng (nguồn gốc chủng, kết kiểm tra xác định đặc tính, sinh lý, sinh hóa, huyết học di truyền chủng ) Canh trường nuôi cấy chủng sản xuất phải có đặc tính giống chủng gốc: vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào, quan sát kính hiển vi có hình thái điển hình S pneumonia, phát triển thích hợp 37 oC, khuẩn lạc trơn có vịng tan máu alpha; bị ly giải muối mật, lên mem inulin, nhạy cảm với optochin, dương tính với phản ứng Quellung Phương pháp sản xuất phải thẩm định để chứng minh sản phẩm đạt yêu cầu an toàn theo tiêu chuẩn vắc xin huyết miễn dịch dùng cho người Nuôi cấy gặt Các chủng sản xuất nuôi cấy môi trường không chứa thành phần tạo tủa tinh chế polysaccharid, thành phần nhóm máu polysaccharid có phân tử lượng lớn Sự khiết vi khuẩn trước tách, chiết thu polysaccharid phải kiểm tra theo phương pháp thích hợp Nếu có nhiễm tạp, canh trường ni cấy bị hủy bỏ Bán thành phẩm đơn giá Sau bất hoạt phenol, polysaccharid tách tinh chế phương pháp tủa phân đoạn, thủy phân enzym siêu lọc, rửa, làm khô điều kiện chân khơng cho có độ ẩm thích hợp cho tính ổn định polysacharid bảo quản điều kiện thích hợp để tránh bị ẩm Độ ẩm tồn dư xác định cách làm khô áp xuất giảm nhiệt phải đạt yêu cầu so với mẫu đối chiếu Polysaccharid tinh chế phải đạt tiêu sử dụng để pha chế bán thành phẩm cuối cùng: Nhận dạng: Dùng phương pháp huyết học (khuyếch tán miễn dịch kép điện di miễn dịch); dương tính với kháng nguyên phế cầu Thành phần polysaccharid: Theo tiêu chuẩn nhà sản xuất Được xác định dựa khối lượng khô polysaccharid phần trăm nitrogen tổng số, phosphorus, acid uronic, hexosamin, methyl pentose nhóm O-acetyl cách sử dụng phương pháp so màu sắc ký trao đổi ion Protein tạp chất: Không 3,0 % so với khối lượng polysaccharid Xác định phương pháp Lowry Acid nucleic tạp chất: Không 2,0% so với khối lượng polysaccharid Xác định cách đo độ hấp thụ acid nucleic bước sóng 260 nm phương pháp khác thẩm định Kích thước phân tử: Theo tiêu chuẩn nhà sản xuất Xác định phương pháp sắc ký lọc gel sắc ký trao đổi ion Hằng số phân bố KD xác định cách đo phân bố theo kích thước phân tử polysacharid đỉnh (pic) đường cong phân tách Vơ khuẩn: Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7) Độ đặc hiệu: Khơng có phản ứng chéo kháng ngun phế cầu với tất kháng huyết đặc hiệu kháng kháng ngun phế cầu cịn lại có vắc xin phế cầu Bán thành phẩm cuối Bán thành phẩm cuối điều chế cách trộn bột polysachrid typ khác điều kiện vơ trùng Hỗn hợp đồng hịa vào dung dịch đẳng trương thích hợp liều dùng cho người chứa 25 µg typ polysacharid Bán thành phẩm cuối phép pha chế thành thành phẩm đạt yêu cầu sau: Vô khuẩn: Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7) Vắc xin thành phẩm Nhận dạng: Phải dương tính với kháng nguyên phế cầu Sử dụng phương pháp miễn dịch học Vô khuẩn: Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7) Hàm lượng polysaccharid: Trong khoảng ± 30,0 % hàm lượng polysaccharid ghi nhãn Xác định hàm lượng polysacharid kháng nguyên phế cầu hàm lượng polysacharid tổng số phương pháp miễn dịch học hay phương pháp khác thẩm định Chất bảo quản: Chất bảo quản kháng khuẩn: Trong khoảng 85 % - 115 % hàm lượng ghi nhãn Tiến hành theo phương pháp thích hợp thẩm định Phenol: Khơng q 2,5 g/l Xác định phương pháp thích hợp Chất gây sốt: Đạt chất gây sốt (Phụ lục 15.12) Tiến hành thỏ với liều tiêm tĩnh mạch tai thỏ 2,5 µg kháng nguyên phế cầu/mL/kg thỏ An tồn khơng đặc hiệu: Vắc xin đạt u cầu an tồn khơng đặc hiệu tất chuột thử nghiệm sống sót tăng cân sau ngày theo dõi (Phụ lục 15.11) pH: 4,5 - 7,4 (Phụ lục 15.33) Cảm quan: Quan sát mắt thường vắc xin khơng có dấu hiệu bất thường: lỏng nút, nắp, hàn khơng đạt u cầu, nứt, vỡ, có vật thể lạ Đóng gói Phải tuân thủ theo GMP quy định hành Nhãn, hộp Những thông tin ghi nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng yêu cầu quy định hành đặc biệt phải ghi đủ thông tin tên, hàm lượng polysaccharid hàm lượng polysaccharid tổng số Bảo quản Trong bao bì kín, nhiệt độ từ oC đến oC Hạn sử dụng Các tuyên bố hạn sử dụng, nhiệt độ bảo quản phải dựa kết nghiên cứu tính ổn định vắc xin phải quan quản lý phê chuẩn VẮC XIN PHẾ CẦU CỘNG HỢP HẤP PHỤ Vaccinum pneumococcale polysacharidicum coniugatum adsorbatum Định nghĩa Vắc xin phế cầu cộng hợp hấp phụ gồm kháng nguyên vỏ tinh khiết polysacharid typ huyết phế cầu S pneumoniae (gọi tắt kháng nguyên phế cầu), kháng nguyên phế cầu liên kết cộng hợp riêng rẽ với protein mang (carrier protein) Vắc xin phế cầu hấp phụ với chất hấp phụ tá chất phù hợp (thường hấp phụ với nhôm phosphat) Sản xuất Phương pháp sản sản xuất phải tạo vắc xin phế cầu cộng hợp đảm bảo tính an tồn tính sinh miễn dịch người Qui trình sản xuất polysacharid chất mang phải dựa sở hệ thống chủng giống Phương pháp sản xuất phải thẩm định để chứng minh sản phẩm đạt yêu cầu an toàn theo tiêu chuẩn vắc xin huyết miễn dịch dùng cho người Chủng gốc chủng sản xuất Mỗi chủng gốc phải có hồ sơ chủng (nguồn gốc chủng, kết kiểm tra xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa, huyết học di truyền chủng, ) Chủng S pneumoniae dùng để sản xuất vắc xin phế cầu cộng hợp phải quan Kiểm định quốc gia chấp thuận Mỗi chủng phải có khả sản sinh polysacharid typ huyết tương ứng với sản lượng ổn định, đủ đáp ứng miễn dịch an toàn cho người Canh trường ni cấy chủng sản xuất phải có đặc tính giống chủng gốc: vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào, quan sát kính hiển vi có hình thái điển hình S pneumonia, phát triển thích hợp 37 oC, khuẩn lạc trơn có vịng tan máu alpha; bị ly giải muối mật, lên men inulin, nhạy cảm với optochin, dương tính với phản ứng Quellung Ni cấy gặt Các chủng sản xuất nuôi cấy môi trường không chứa thành phần tạo tủa tinh chế polysacharid Sự khiết vi khuẩn trước tách chiết thu polysacharid phải kiểm tra theo phương pháp thích hợp ni cấy mơi trường thạch đĩa phù hợp Nếu có nhiễm tạp, mơi trường ni cấy bị hủy bỏ Tinh chế polysacharid Mỗi typ huyết S pneumonia nuôi cấy riêng biệt môi trường lỏng không chứa polysacharid khối lượng phân tử cao, thành phần ni cấy có chứa thành phần nhóm máu qui trình sản xuất phải thẩm định để chứng minh sau tinh chế loại bỏ chất Sau bất hoạt, polysacharid tách tinh chế phương pháp tủa phân đoạn, sắc ký, xử lý enzyme siêu ly tâm Polysacharid tinh chế phải đạt tiêu sử dụng để pha chế bán thành phẩm cộng hợp: Nhận dạng: Phải dương tính với typ kháng nguyên phế cầu Xác định phương pháp huyết học quang phổ cộng hưởng từ 1H (hoặc 13C) Thành phần polysacharid: Được xác định dựa khối lượng khô polysacharid phần trăm nitrogen tổng số, phosphorus, acid uronic, hexosamin, methyl pentose O-acetyl nhóm cách sử dụng phương pháp so màu sắc ký trao đổi ion Tiêu chuẩn phải quan quản lý quốc gia chấp thuận Độ ẩm: Nếu polysacharid bảo quản dạng đông khô, hàm lượng ẩm phải kiểm tra nằm giới hạn tiêu chuẩn quan quản lý quốc gia chấp thuận Protein tạp chất: Không 3,0 % so với khối lượng polysacharid Xác định phương pháp Lowry Acid nucleic tạp chất: Không 2,0 % so với khối lượng polysacharid Xác định cách đo độ hấp thụ acid nucleic bước sóng 260 nm phương pháp khác thẩm định Chất gây sốt: Đạt yêu cầu chất gây sốt (Phụ lục 15.12) Sử dụng phương pháp xác định chất gây sốt thỏ Nội độc tố vi khuẩn: Xác định nội độc tố theo Phụ lục 13.2 Hàm lượng nội độc tố 0,5 lU/µg polysacharid Kích thước phân tử: Theo tiêu chuẩn nhà sản xuất Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel sắc ký trao đổi ion Hằng số phân bố KD xác định cách đo phân bố theo kích thước phân tử polysacharid đỉnh (pic) đường cong phân tách Hoạt hóa polysacharid Polysacharid hoạt hóa phương pháp hóa học trước cộng hợp Trước q trình hoạt hóa phương pháp hóa học, polysacharid chia thành đơn phân (partially depolymerized) Các polysacharid hoạt hóa đạt tiêu sử dụng q trình cộng hợp: Kích thước phân tử: Kích thước phân tử kháng nguyên phế cầu nằm tiêu chuẩn quan quản lý quốc gia chấp thuận Xác định phương pháp sắc ký lọc gel phương pháp khác thẩm định Protein mang Protein mang sử dụng để tăng khả đáp ứng miễn dịch tế bào T Chủng sản xuất protein mang (cộng hợp) phải có hồ sơ chủng bao gồm nguồn gốc chủng, đặc tính sinh lý, sinh hóa, tính an tồn Sự phát triển chủng phải cho thấy có tính ổn định cách giám sát tỷ lệ mọc vi khuẩn, pH nuôi cấy sản lượng Độ tinh khiết canh trường nuôi cấy phải kiểm tra, canh trường nuôi cấy bất hoạt tinh chế phương pháp thích hợp Các protein mang thường sử dụng là: giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu, protein CRM 197, protein D - protein bề mặt tế bào vi khuẩn khơng điển hình Haemophilus influenza Protein mang đạt yêu cầu sử dụng để pha chế bán thành phẩm cộng hợp: Nhận dạng: Phải cho phản ứng dương tính Xác định phương pháp huyết học Vô khuẩn: Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7) Nội độc tố vi khuẩn: Khơng q 1,0 IU/µg protein Hàm lượng protein: Khơng 90 % hàm lượng protein tổng số Được xác định phương pháp phù hợp thẩm định Bán thành phẩm đơn giá Sự cộng hợp xảy có polysacharid hoạt hóa gắn với protein mang qua liên kết cộng hóa trị nhiều phương pháp khác nhau, phụ thuộc vào nhà sản xuất Quy trình tinh chế sản phẩm cộng hợp nhằm loại bỏ hóa chất tồn dư q trình cộng hợp phương pháp thích hợp Chỉ bán thành phẩm đơn đạt yêu cầu pha chế thành bán thành phẩm cuối Nhận dạng: sử dụng phương pháp huyết học, phản ứng dương tính với kháng ngun phế cầu Hóa chất tồn dư: Khơng có hóa chất tồn dư Xác định phương pháp sắc ký khối phổ phương phác khác thẩm định Tỷ lệ polysacharid - protein: Từ 0,3 đến 3,0 kháng nguyên phế cầu Thực cách xác định hàm lượng polysacharid hàm lượng protein xác định trực tiếp tỷ lệ cách sử dụng phương pháp quang phổ cộng hưởng từ 1H phương pháp khác thẩm định Polysacharid cộng hợp polysacharid tự do: Theo tiêu chuẩn nhà sản xuất Xác định phương pháp thích hợp thẩm định Hàm lượng protein: Theo tiêu chuẩn nhà sản xuất typ kháng nguyên Xác định phương pháp thích hợp thẩm định phương pháp sắc ký lỏng, sắc ký mao quản,… Vô khuẩn: Đạt yêu cầu vơ khuẩn (Phụ lục 15.7) Tính độc đặc hiệu protein mang: Khơng có tính độc Áp dụng với protein mang giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu; tiến hành theo phương pháp thẩm định Nội độc tố: Không lớn 0,75 lU/µg polysacharid Sử dụng phương pháp LAL test Bán thành phẩm cuối Tá dược, chất bảo quản bổ sung với lượng thích hợp bán thành phẩm cộng hợp kháng nguyên phế cầu để bán thành phẩm cuối Bán thành phẩm cuối phép pha chế thành thành phẩm đạt yêu cầu sau: Vô khuẩn: Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 5.7) Vắc xin thành phẩm Nhận dạng: Phải dương tính với kháng nguyên phế cầu Xác định phương pháp miễn dịch học Vô khuẩn: Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7) Hàm lượng polysacharid: Trong khoảng ± 30,0 % hàm lượng polysacharid ghi nhãn Xác định hàm lượng polysacharid kháng nguyên phế cầu polysacharid tổng số phương pháp miễn dịch học hay phương pháp khác thẩm định Độ ẩm tồn dư: Không 2,5 % khơng có lọ q 3,0 % (Phụ lục 15.35) Áp dụng cho vắc xin phế cầu dạng đông khô Nội độc tố vi khuẩn: Đạt theo tiêu chuẩn đăng ký với quan Kiểm định quốc gia Phương pháp xác định theo Phụ lục 13.2 Nhôm: Không 1,25 mg liều đơn dùng cho người (Phụ lục 15.27) Hàm lượng chất bảo quản: Tiến hành theo phương pháp thích hợp thẩm định, tiêu chuẩn phải quan Kiểm định quốc gia chấp thuận An tồn khơng đặc hiệu: vắc xin đạt u cầu an tồn khơng đặc hiệu tất chuột thử nghiệm sống sót tăng cân sau ngày theo dõi (Phụ lục 15.11) pH: Đối với vắc xin chế phẩm dạng lỏng: giá trị pH nằm khoảng mà cho thấy an toàn hiệu thử nghiệm lâm sàng nghiên cứu tính ổn định (Phụ lục 15.33) Đối với vắc xin chế phẩm đông khô: Tiến hành đo pH sau hồn ngun với dung dịch thích hợp; giá trị pH nằm khoảng mà cho thấy an toàn hiệu thử nghiệm lâm sàng nghiên cứu tính ổn định (Phụ lục 15.33) Cảm quan: Quan sát mắt thường vắc xin khơng có dấu hiệu bất thường: lỏng nút, nắp, hàn không đạt yêu cầu, nứt, vỡ, khơng có vật thể lạ Đóng gói Phải tuân thủ theo GMP quy định hành Nhãn, hộp Những thông tin ghi nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng yêu cầu quy định hành đặc biệt phải ghi đủ thông tin hàm lượng polysacharid; tên hàm lượng protein mang liều sử dụng cho người; tên, hàm lượng chất hấp phụ; điều kiện sử dụng, bảo quản vắc xin (lắc trước dùng, không để đông băng) Bảo quản Trong bao bì kín, nhiệt độ từ oC đến oC Hạn sử dụng Các tuyên bố hạn sử dụng, nhiệt độ bảo quản phải dựa kết nghiên cứu tính ổn định vắc xin phải đệ trình lên quan quản lý quốc gia phê chuẩn ... đầu Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc TCVN VI:2017 xây dựng nguyên tắc nối tiếp Bộ TCVN I:2017, Bộ TCVN II:2012, Bộ TCVN III:2014, Bộ TCVN IV:2015 Bộ TCVN V:2017 Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc TCVN VI:2017... cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Tiêu chuẩn quốc gia thuốc văn kỹ thuật tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm chất lượng thuốc Bộ tiêu chuẩn quốc gia. .. phụ lục 17.1 đến phụ lục 17.8; Phụ lục 18: TCVN I-2:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 2: Nguyên liệu hóa dược TCVN II:2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm