Định lượng đồng thời amoxicilin và sulbactam trong thuốc bột pha tiêm vimotram bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TRỌNG ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMOXICILIN VÀ SULBACTAM TRONG THUỐC BỘT PHA TIÊM VIMOTRAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TRỌNG 1501521 ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMOXICILIN VÀ SULBACTAM TRONG THUỐC BỘT PHA TIÊM VIMOTRAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Mai Hương Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Mai Hương, giảng viên mơn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, dành nhiều tâm huyết truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô mơn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian em làm thực nghiệm môn Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt kiến thức giúp đỡ em suốt hành trình năm học trường Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Đức Trọng MỤC LỤC Lời cảm ơn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan amoxicilin sulbactam 1.1.1 Đặc điểm amoxicilin sulbactam 1.1.2 Cơ chế tác dụng định 1.1.3 Một số dạng bào chế kết hợp 1.2 Tình hình nghiên cứu cần thiết tiến hành nghiên cứu 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.2 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.3.1 Nguyên tắc HPLC 1.3.2 Cấu tạo hệ thống HPLC 10 1.3.3 Một số thông số đặc trưng trình rửa giải 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên vật liệu 13 2.1.2 Thiết bị 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Chuẩn bị mẫu 14 2.3.2 Xác định điều kiện sắc ký 15 2.3.3 Thẩm định phương pháp 15 2.3.4 Đánh giá độ ổn định dung dịch chuẩn gốc AM chuẩn gốc SB 16 2.3.5 Xác định hàm lượng AM SB thuốc bột pha tiêm Vimotram 17 2.3.6 Xử lý số liệu 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 18 3.1.1 Lựa chọn bước sóng phát 18 3.1.2 Lựa chọn điều kiện pha động 19 3.2 Thẩm định phương pháp 24 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 24 3.2.2 Độ chọn lọc 25 3.2.3 Khoảng tuyến tính 26 3.2.4 Độ 29 3.2.5 Độ lặp lại độ xác trung gian 31 3.3 Đánh giá độ ổn định dung dịch chuẩn gốc AM chuẩn gốc SB 33 3.4 Định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram 34 3.5 Bàn luận 36 3.5.1 Lựa chọn bước sóng phát 36 3.5.2 Lựa chọn điều kiện pha động 36 3.5.3 Đánh giá độ ổn định dung dịch chuẩn gốc AM chuẩn gốc SB 39 3.5.4 Định lượng AM SB thuốc bột pha tiêm Vimotram 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AM Amoxicilin AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích thống (Assosiation of Official Analytical Chemists) CDER Trung tâm Đánh giá Nghiên cứu thuốc (Center for Drug Evaluation and Research) DAD Detector mảng diod (Diode Array Detector) DĐVN Dược điển Việt Nam HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) ICH Hội đồng hòa hợp quốc tế (International Conference on Harmonisation) MeOH Methanol P.t.l Phân tử lượng RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự SB Sulbactam TB Trung bình UV – VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Đặc điểm AM SB Bảng 1.2 Một số dạng bào chế kết hợp AM SB Bảng 1.3 Định lượng số chế phẩm đa thành phần chứa kháng sinh HPLC theo DĐVN V Bảng 1.4 Một số nghiên cứu định lượng đồng thời AM SB HPLC Bảng 3.1 Kết khảo sát sơ điều kiện pha động 19 Bảng 3.2 Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống hai hệ pha động A B 24 Bảng 3.3 Kết thẩm định khoảng tuyến tính – hệ pha động A 26 Bảng 3.4 Kết thẩm định khoảng tuyến tính – hệ pha động B 27 Bảng 3.5 Kết thẩm định độ – hệ pha động A 29 Bảng 3.6 Kết thẩm định độ – hệ pha động B 30 Bảng 3.7 Kết thẩm định độ lặp lại, độ xác trung gian – hệ pha động A 31 Bảng 3.8 Kết thẩm định độ lặp lại, độ xác trung gian – hệ pha động B 32 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ ổn định dung dịch chuẩn gốc AM, chuẩn gốc SB 33 Bảng 3.10 Kết định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram – hệ pha động A 34 Bảng 3.11 Kết định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram – hệ pha động B 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, sơ đồ, đồ thị Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo AM Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo SB Hình 1.3 Thuốc bột pha tiêm Vimotram Hình 1.4 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC 10 Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại AM 18 Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại SB 18 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp AM SB khảo sát sơ với hệ pha động khác 20 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp AM 100 µg/mL SB 50 µg/mL – hệ pha động A 22 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp AM 100 µg/mL SB 50 µg/mL – hệ pha động B 23 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu thẩm định độ chọn lọc – hệ pha động A 25 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu thẩm định độ chọn lọc – hệ pha động B 25 Đồ thị 3.1 Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ AM SB – hệ pha động A 27 Đồ thị 3.2 Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ AM SB – hệ pha động B 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Amoxicilin kháng sinh nhóm beta-lactam có phổ tác dụng rộng vi khuẩn Gram âm Gram dương Tuy nhiên, amoxicilin dễ bị bất hoạt betalactamase vi khuẩn tiết Sulbactam chất ức chế beta-lactamase phối hợp với amoxicilin nhằm tạo tác dụng hiệp đồng diệt khuẩn, giúp mở rộng phổ tác dụng amoxicilin vi khuẩn sinh beta-lactamase kháng lại amoxicilin dùng đơn độc [2], [17] Tại Việt Nam, chế phẩm có phối hợp amoxicilin sulbactam sử dụng tương đối phổ biến Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận cho chế phẩm chứa hai thành phần Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nước định lượng đồng thời amoxicilin sulbactam sắc ký lỏng hiệu cao công bố Trên giới, nghiên cứu định lượng đồng thời amoxicilin sulbactam chế phẩm dạng phối hợp sắc ký lỏng hiệu cao tương đối hạn chế số lượng [4], [11], [25] Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao có ưu điểm cho kết phân tích nhanh với độ xác, độ chọn lọc độ nhạy cao Do đó, phương pháp thường lựa chọn để xác định hàm lượng thuốc phân tích kiểm nghiệm [8], [22] Thuốc bột pha tiêm Vimotram lưu hành thị trường, Công ty cổ phần dược phẩm VCP sản xuất, chế phẩm chứa hai thành phần amoxicilin sulbactam Với mong muốn đề xuất phương pháp định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần trên, có khả ứng dụng cơng tác kiểm nghiệm nhằm kiểm sốt chất lượng chế phẩm này, nghiên cứu: “Định lượng đồng thời amoxicilin sulbactam thuốc bột pha tiêm Vimotram sắc ký lỏng hiệu cao” thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định hai phương pháp định lượng đồng thời amoxicilin sulbactam hỗn hợp hai thành phần sắc ký lỏng hiệu cao Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng amoxicilin sulbactam thuốc bột pha tiêm Vimotram CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan amoxicilin sulbactam 1.1.1 Đặc điểm amoxicilin sulbactam Cơng thức cấu tạo, tính chất lý hóa độ ổn định amoxicilin (AM) sulbactam (SB) tổng hợp bảng 1.1: Bảng 1.1 Đặc điểm AM SB AM SB Công thức cấu tạo [28] Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo AM SB Tên (2S,5R,6R)-6-{[(2R)-2-Amino-2-(4- (2S,5R)-3,3-Dimethyl-7-oxo- khoa hydroxyphenyl)acetyl]amino}-3,3- 4-thia-1-azabicyclo[3.2.0] học dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo heptan-2-carboxylic acid 4,4- [3.2.0]heptan-2-carboxylic acid [24] dioxid [28] Công − AM khan: C16H19N3O5S − SB khan: C8H11NO5S thức (P.t.l: 365,4) (P.t.l: 233,2) phân tử − AM natri: C16H18N3NaO5S − SB natri: C8H10NNaO5S [28] (P.t.l: 255,2) (P.t.l: 387,4) − AM trihydrat: C16H19N3O5S.3H2O (P.t.l: 419,4) Tính − pKa1 = 2,4 (carboxyl); pKa2 = 7,4 − pKa = 2,5 [16] chất lý (amin); pKa3 = 9,6 (phenol) [3], − Log P (octanol/nước): 3,16 hóa [24] [16] − Log P (octanol/nước): 0,87 [24] TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 1,2, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2018), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tiếng Anh Abdelmalek I., Mesli A., Mesli S., Simonneaux G., Svahn I (2014), “Formulation, evaluation and microbiological activity of ampicillin and amoxicillin microspheres”, Journal of Materials and Environmental Science, (6), pp.1799-1807 Anusha N., Kamath B.U (2012), “Simultaneous estimation of amoxicillin and sulbactam in a parenteral formulation by reverse phase HPLC method”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 4, pp.330-336 AOAC International (2016), Guidelines for Standard Method Performance Requirements, Assosiation of Official Analytical Chemists Barcelona L., Marín M., Stamboulian D (2008), “Betalactam antibiotics combined with betalactamase inhibitors Amoxicillin – Sulbactam”, Medicina (B Aires), 68(1), pp.65-74 Barrett D.A., Erah P.O., Goddard A.F., Shaw P.N., Spiller R.C (1995), “Effect of pH on the Stability of Amoxycillin in Buffered Aqueous Solutions and in Gastric Juice”, Pharmaceutical Sciences, pp.597-600 Bélanger J.M.R., Paré J.R.J., Sigouin M (1997), “High Performance Liquid Chromatography (HPLC): Principles and Applications”, Instrumental Methods in Food Analysis, chapter 2, pp.37-59 Center for Drug Evaluation and Reasearch (1994), Reviewer Guidance, Validation of Chromatographic Methods, Food and Drug Administration, (3), pp.161-176 10 Chadha R., Jain D.V.S., Kashid N (2003), “Kinetic studies of the degradation of an aminopenicillin antibiotic (amoxicillin trihydrate) in aqueous solution using heat conduction microcalorimetry”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 55(11), pp.1495-1503 11 Chandana P., Srinivas N., Tuljarani G (2015), “Development and validation of RP – HPLC method for simultaneous estimation of Amoxycillin and Sulbactam in binary mixture”, International Journal of Pharmacy Review and Research, 5(1), pp.47-52 12 Coym J.W (2010), “Evaluation of ternary mobile phases for reversed-phase liquid chromatography: Effect of composition on retention mechanism”, Journal of Chromatography A, 1217(2010), pp.5957-5964 13 Feezle H., Frynkewicz H., Richardson M (2013), “Thermostability Determination of Broad Spectrum Antibiotics at High Temperatures by Liquid Chromatography – Mass Spectrometry”, National Conference on Undergraduate Research, 2013, pp.333-337 14 Haginaka J., Nakagawa T., Uno T., Wakai J., Yasuda H (1985), “Degradation Kinetics of Sodium Sulbactam in Aqueous Solutions”, Chem Pharm Bull (Tokyo), 33(6), pp.2461-2468 15 International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use (2005), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1), pp.1-13 16 Jakob – Rodamer V (2014), Development and validation of LC – MS/MS methods to determine PK/PD parameters of anti – infectives, Julius – Maximilians – Universität Würzburg, Scheinfeld 17 Jasovich A (2001), “Amoxicillin – Sulbactam: A combination with a sound pharmacokinetic – pharmacodynamic basis”, Drugs Today (Barc), 37(3), pp.187-188 18 Kazakevich Y., Lobrutto R (2007), HPLC for Pharmaceutical Scientists, John Wiley and Sons, Canada 19 Kazusaki M., Ohgami Y., Ueda S., Takeuchi N (2012), “Review Validation of analytical procedures by high – performance liquid chromatography for pharmaceutical analysis”, Chromatography, 33 (2), pp.65-73 20 Krull I.S., Swartz M.E (2012), Handbook of Analytical Validation, Taylor and Francis Group, New York 21 McPolin O (2009), Validation of Analytical Methods for Pharmaceutical Analysis, Mourne Training Services, United Kingdom 22 Meenakshi B., Vidushi Y (2017), “A review on HPLC method development and validation”, Research Journal of Life Sciences, Bioinformatics, Pharmaceutical and Chemical Sciences, 2(6), pp.166-178 23 Meyer V.R (2010), Practical High-Performance Liquid Chromatography, John Wiley and Sons, United Kingdom 24 Moffat A.C., Widdop B., Osselton M.D (2011), Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, Pharmaceutical Press, United Kingdom 25 Qi M., Wang P., Sun Y., Yang J (2004), “A liquid chromatographic method for simultaneous determination of amoxicillin sodium and sulbactam sodium in a combination formulation”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 36(3), pp.565-569 26 Rӓder K., Wildfeuer A (1996), “Stability of β-lactamase inhibitors and βlactam antibiotics in parenteral dosage forms and in body fluids and tissue homogenates: a comparative study of sulbactam, clavulanic acid, ampicillin and amoxycillin”, International Journal of Antimicrobial Agents, (1996), pp.S31-S34 27 Shabir G.A (2003), “Validation of high – performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization”, Journal of Chromatography A, Vol 987, pp.57-66 28 Sweetman S.C (2009), Martindale the complete drug reference, Pharmaceutical Press, United Kingdom PHỤ LỤC Phụ lục 1: − Sắc ký đồ dung dịch đường chuẩn, dung dịch thử với hệ pha động A: dung dịch đệm phosphat 10 mM pH 5,0 – ACN tỉ lệ 92 : 8, tốc độ dòng 1,5 mL/phút Chuẩn hỗn hợp AM 60 µg/mL SB 30 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 80 µg/mL SB 40 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 100 µg/mL SB 50 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 120 µg/mL SB 60 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 140 µg/mL SB 70 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 160 µg/mL SB 80 µg/mL Mẫu thử − Ảnh độ tinh khiết hệ số chồng phổ AM mẫu thử với hệ pha động A − Ảnh độ tinh khiết hệ số chồng phổ SB mẫu thử với hệ pha động A Phụ lục 2: − Sắc ký đồ dung dịch đường chuẩn, dung dịch thử với hệ pha động B: dung dịch đệm acetat 25 mM pH 5,0 – MeOH tỉ lệ 90 : 10, tốc độ dòng 1,0 mL/phút Chuẩn hỗn hợp AM 60 µg/mL SB 30 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 80 µg/mL SB 40 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 100 µg/mL SB 50 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 120 µg/mL SB 60 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 140 µg/mL SB 70 µg/mL Chuẩn hỗn hợp AM 160 µg/mL SB 80 µg/mL Mẫu thử − Ảnh độ tinh khiết hệ số chồng phổ AM mẫu thử với hệ pha động B − Ảnh độ tinh khiết hệ số chồng phổ SB mẫu thử với hệ pha động B ... cứu nước định lượng đồng thời amoxicilin sulbactam sắc ký lỏng hiệu cao công bố Trên giới, nghiên cứu định lượng đồng thời amoxicilin sulbactam chế phẩm dạng phối hợp sắc ký lỏng hiệu cao tương... ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TRỌNG 1501521 ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMOXICILIN VÀ SULBACTAM TRONG THUỐC BỘT PHA TIÊM VIMOTRAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng... chất lượng chế phẩm này, nghiên cứu: ? ?Định lượng đồng thời amoxicilin sulbactam thuốc bột pha tiêm Vimotram sắc ký lỏng hiệu cao? ?? thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định hai phương pháp định lượng