Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của luận án là Đánh giá mối tương quan giữa các dạng đa hình thái đơn các gen CYP1A1, CYP2D6 với một số yếu tố nguy cơ ở bệnh ung thư phổi. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm chi tiết nội dung của luận án.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ HỒNG CÔNG SỰ PHÂN BỐ KIỂU GEN CYP1A1, CYP2D6 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ PHỔI Chun ngành: Hóa sinh Mã số: 62720112 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2017 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI: TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: GS.TS TẠ THÀNH VĂN Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Y Hà Nội Vào giờ, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thƣ viện Quốc Gia Việt Nam Thƣ viện Trƣờng Đại học Y Hà Nội CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƢỢC CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN Lê Hồng Công, Trần Vân Khánh, Lê Hồng Bích Nga, Nguyễn Trọng Tuệ, Nguyễn Đức Hinh, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh (2015) Tính đa hình T6235C gen CYP1A1 nguy với ung thư phổi Tạp chí nghiên cứu Y học, 94(2), 1-8 Lê Hồng Công, Trần Huy Thịnh, Phạm Lê Anh Tuấn, Trần Vân Khánh, Phạm Ngọc Minh, Ngô Thanh Tùng, Tạ Thành Văn (2016) Tính đa hình G4268C gen CYP2D6 bệnh nhân ung thư phổi Tạp chí nghiên cứu Y học, 100(2), 42-49 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Ung thư phổi (UTP) loại ung thư thường gặp nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ung thư nhiều nước giới, Việt Nam Hút thuốc yếu tố nguy nguyên nhân rõ ràng liên quan đến UTP Trong CYPs CYP1A1 CYP2D6 chìa khóa hoạt hóa chất gây ung thư sinh từ khói thuốc nicotine hydrocacbon có nhân thơm Ở Việt Nam nghiên cứu CYP1A1, CYP2D6 bệnh nhân UTP chưa có, đặc biệt liên quan đến yếu tố nguy gây UTP Chính để góp phần hiểu rõ mối liên quan dạng đa hình thái đơn gen CYP1A1, CYP2D6 số yếu tố nguy bệnh nhân UTP mà thực đề tài Mục tiêu đề tài: Xác định tỷ lệ phân bố kiểu gen số đa hình thái đơn gen CYP1A1, CYP2D6 nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm đối chứng Đánh giá mối tương quan dạng đa hình thái đơn gen CYP1A1, CYP2D6 với số yếu tố nguy bệnh ung thư phổi Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài: Từ kết nghiên cứu luận án cho thấy: (1) Làm sáng tỏ vai trò gen CYP1A1, CYP2D6 nguy hình thành phát triển ung thư phổi, sở cho việc phòng bệnh chủ động (2) Phản ánh cách khách quan trung thực tính nhạy cảm gen CYP1A1, CYP2D6 liên quan yếu tố nguy đến hình thành phát triển ung thư phổi Thuốc ngày vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng nguyên nhân gây tử vong cần ngăn chặn hàng đầu Trong CYPs CYP1A1 CYP2D6 có vai trị chìa khóa hoạt hóa chất gây ung thư từ khói thuốc Tuy vậy, đề tài gen CYP1A1, CYP2D6 bệnh nhân ung thư phổi khơng có, đặc biệt liên quan đến thuốc Chính sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đại gồm: PCR, PCR-RFLP, giải trình tự gen để tìm phân bố kiểu gen đa hình CYP1A1, CYP2D6 Cấu trúc luận án: Luận án trình bày 121 trang (khơng kể tài liệu tham khảo phần phụ lục) Luận án chia làm phần: + Đặt vấn đề: trang + Chương 1: tổng quan tài liệu 37 trang + Chương 2: đối tượng phương pháp nghiên cứu 13 trang + Chương 3: kết nghiên cứu 42 trang + Chương 4: bàn luận 24 trang + Kết luận: trang + Kiến nghị: trang Luận án gồm: biểu đồ, 42 bảng 22 hình, sử dụng 92 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt tiếng Anh CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa ung thƣ phổi Ung thư phổi bệnh ác tính phát triển từ biểu mô phế quản, tiểu phế quản, phế nang từ tuyến phế quản 1.2 Dịch tễ học ung thƣ phổi Tình hình UTP giới: Theo WHO UTP đứng hàng đầu nam (17,6%), đứng hàng thứ năm nữ (5,8%) tổng số ung thư Tình hình ung thư phổi Việt Nam: Theo báo cáo WHO, năm 2016, Việt Nam, UTP đứng hàng thứ đứng sau ung thư gan nam Ở nữ UTP có tỷ mắc đứng thứ sau ung thư vú 1.3 Các yếu tố nguy liên quan đến ung thƣ phổi Thuốc lá: Hút thuốc coi yếu tố nguy gây UTP Các yếu tố khác như: Ơ nhiễm khơng khí, xạ ion hóa, bệnh phế quản phổi, tuổi giới, Chế độ ăn uống 1.4 Chẩn đoán ung thƣ phổi Chẩn đoán xác định Kết mô bệnh học, tế bào học từ bệnh phẩm lấy qua soi phế quản, sinh thiết, chọc hút qua thành ngực, dịch màng phổi, hạch thượng địn… có tế bào, tổ chức ung thư Đây tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định UTP 1.5 Phân loại ung thƣ phổi Phân loại TNM Mountian CF dựa ba tiêu chí: T: Khối u, N: Xâm lấn hạch, M: Di xa Giai đoạn I: gồm BN khơng có chứng xâm lấn di xa Giai đoạn II: gồm BN có chứng xâm lấn hạch nằm phổi Giai đoạn III: gồm BN UTP tiến triển lồng ngực Có chứng xâm lấn hạch nằm phổi Giai đoạn IV: gồm bệnh nhân UTP di xa 1.6 Phân loại ung thƣ phổi theo tế bào mô bệnh học Theo mô học, UTP chia làm hai loại là: UTP tế bào nhỏ (SCLC: small cell lung carcinoma) UTP không tế bào nhỏ (NSCLC: non-small cell lung carcinoma) 1.7 Chiến lƣợc điều trị ung thƣ phổi Điều trị thuốc ức chế Tyrosinkinase ung thư phổi Điều trị ung thư phổi thuốc chống sinh mạch Liệu pháp điều trị gen Điều trị miễn dịch ung thư phổi 1.8 Dấu ấn sinh học phân tử gen CYP1A1, CYP2D6 chu trình chuyển hóa Cytochrome P450 ung thƣ phổi Cơ chế phân tử Trong CYPs CYP1A1 CYP2D6 enzyme hoạt hóa chất gây ung thư sinh từ khói thuốc nicotine hydrocarbon có nhân thơm 1.8.1 Tổng quan gen CYP1A1 Vị trí cấu trúc Gen CYP1A1 (Cytochrome P450, họ 1, phân họ A, polypeptid 1) nằm NST số 15, nhánh dài, vị trí 24.1 (Hình 1.1) Hình 1.1 Vị trí gen CYP1A1 NST 15 (Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Chức CYPs chuyển hóa hàng nghìn chất nội sinh ngoại sinh Enzym Cytochrome P450 có mặt hầu hết mơ thể, đóng vai trị quan trọng trình tổng hợp phân hủy hormon (estrogen, testosterone), tổng hợp cholesterol, chuyển hóa vitamin D Enzym cịn có chức chuyển hóa hợp chất độc hại, bao gồm thuốc sản phẩm chuyển hóa nội sinh bilirubin, chủ yếu có mặt gan Tính đa hình thái gen CYP1A1 Hiện nay, nhà nghiên cứu xác định đa hình thái đơn nucleotid gen CYP1A1 Một số làm tăng cường hoạt động protein mã hóa nghiên cứu ảnh hưởng đến nguy gây ung thư Hình 1.2 Tính đa hình thái gen CYP1A1 Đa hình m1: thay T thành C nucleotid 6235 đầu 3' vùng khơng mã hóa Đa hình m2: thay A thành G nucleotid 4889 dẫn tới thay đổi acid amin Isoleucine thành acid amin Valine codon 462 Đa hình m3: thay T thành C nucleotid 5639 đầu 3' vùng khơng mã hóa Đa hình m4: thay C thành A nucleotid 4887 dẫn đến thay đổi acid amin Threonine thành acid amin Asparagine codon 461 1.8.2 Tổng quan CYP2D6 Vị trí Gen CYP2D6 nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số 22, vị trí 13.1 (22q13.1) Hình 1.3 Vị trí gen CYP2D6 nhiễm sắc thể 22 (Nguồn: www.genecards.org) Cấu trúc Gen CYP2D6 có kích thước 4378bp Cấu trúc gen gồm có đoạn exon vùng gen mã hố chứa đựng thông tin di truyền 10 đoạn intron vùng khơng mã hố xen kẽ exon Exon có chứa đoạn khơng mã hóa (từ 1747 đến 1835) Chức enzym CYP2D6 Gen CYP2D6 mã hóa cho chuỗi polypeptide số 6, cytochrome P450 họ 2, họ phụ A Tên protein CYP2D6 Cytochrome P450D6 protein gồm 497 acid amin, enzym monooxygenases xúc tác cho nhiều phản ứng chuyển hoá thuốc tổng hợp cholesterol, steroids lipid khác CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Bệnh nhân ung thƣ phổi Đối tượng nghiên cứu gồm 220 bệnh nhân UTP khám điều trị Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học hạt nhân ung bướu BV Bạch Mai từ tháng 11/2013 đến tháng 11/2015 2.1.2 Nhóm đối chứng 200 người nhóm đối chứng, tương ứng tuổi giới với nhóm nghiên cứu từ người đến khám định kỳ chương trình quản lý THA ĐTĐ từ tháng 3/2014 đến tháng 11/2015 2.1.3 Chọn cỡ mẫu nghiên cứu Chúng áp dụng công thức: X = Z (1-α) £/ n n = ( Z (1-α) £/ X )2 Với X giá trị TB Z (1 - α ) độ tin cậy 95% £ độ lệch chuẩn Dựa vào nghiên cứu trước tác giả Sugimura Haruhiko Nhật Bản, X = 62,1 ± 11,2 chúng tơi tính n = 220 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực theo phương pháp mô tả cắt ngang có đối chứng 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu - Thăm khám lâm sàng, chẩn đoán cận lâm sàng đến chẩn đoán xác định ung thư phổi - Các kỹ thuật sinh học phân tử gồm; tách chiết DNA, PCR, sử dụng enzym giới hạn xác định đột biến, giải trình tự gen - Các kết nghiên cứu sử lý toán thống kê nhằm tìm hiểu khác biệt nhóm đối tượng nghiên cứu so với nhóm đối chứng 2.2.3 Quy trình lấy mẫu Bệnh nhân bị ung thư phổi, nhóm đối chứng lấy 2ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA với hàm lượng 1,5mg/ml 2.3 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 2.4 Kỹ thuật PCR để khuếch đại DNA 2.5 Xác định SNPs kỹ thuật PCR-RFLP Đoạn gen chứa SNPs gen quan tâm khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Danh sách mồi, enzym giới hạn sử dụng NC STT Đa hình thái Trình tự mồi (5’-3’) T6235C gen F: TAG GAGTCTTGTCTCATGCCT CYP1A1 R: CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT (m1) A4889G gen CYP1A1 (m2) F: CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAGC R: TTCCACCCGTTGCAGCAGGATAGCC T5639C gen F:TGAGCAATCTGACCCTA CYP1A1 R:ATCTTCCTAACAACACATGTTTGT (m3) C4887A gen CYP1A1 (m4) F:CTGTCTCCCTCTGGTTACAGGAAGC R:TTCCACCCGTTGCAGCAGGATAGCC C188T gen F:CTGGGTAAGGGCCTGGAG CYP2D6 R:ACCTGGTCGAAGCATATGG G1934A gen CYP2D6 F:ATGAGAGCTGCCAACCTT R:ATGTGAACCAGCTCCCTGTC G1846T gen F:GTGGATGGTGGGGCTAATGCCTT CYP2D6 R:CAGAGACTCCTCGGTCTCTCGCT G4268C gen CYP2D6 F:AGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTG R:GCCTCAACGTACCCCTGTCTC Sản phẩm Enzym PCR cắt (bp) 340 MspI 204 MspI 301 HincII 204 HincII 442 HphI 334 BstNI 486 MspI 332 HhaI 2.6 Kỹ thuật giải trình tự gen 2.7 Đề tài tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu Y học 10 3.2 Comparison the general characteristics of lung cancer group and control group Table 3.3: Comparison the general characteristics of the study group Lung cancer Control Characteristics p n (%) n (%) Gender Male 163 (74,1%) 125 (62,5%) > 0,05 Female 57 (25,9%) 75 (37,5%) Age Mean (M) > 0,05 60 66 Standard (SD) 9,1 9,4 Smoking No 128 (64%) 73 (33%) Yes 72 (36%) 147 (67%) < 20 pack/year 50 (69,4%) 48 (32,7%) ≥ 20 pack/year 22 (30,6%) 99 (67,3%) Histological type Adenocarcinoma 127 (57,7%) Squamous cell carcinoma 81 (36,8%) Small cell lung cancer 12 (5,5%) Comment: The proportion of males is higher than females in both groups and the average age is 60 among lung cancer that is indifference with the control group In the group of lung cancer patients, the number of smoking patient is twice times higher than non-smoking patiens and the number of smoking patients whom smoke ≥ 20 pack/year is twice times higher than the number of patients whom smoke 60 Years 25 (0,93 - 3,08) 1,83 50 170 220 69 131 200 Total (1,16 - 2,88) Comment: The distribution of (TC-CC) genotypes in lung cancer group at the age from 40 to 60 shows the highest risk of lung caner with OR = 1,89 (95% CI = 1,07 - 4,51) p < 0, 05 Female 14 43 57 25 50 75 16 3.4 The distribution of genotypes of CYP2D6 polymorphism gene in lung cancer and control groups 3.4.1 The distribution of genotypes of G4268C polymorphism in CYP2D6 gene in lung cancer patients and control group Result of amplifying G4268C region in CYP2D6 gene M ĐC 332bp Figure 3.4 Products of amplifying G4268C regional segments in CYP2D6 gene; 1-4: Lung cancer samples; 5-7: Control samples; M: 100 bp ladder standards; ĐC: positive control Comment: Results of amplifying G4268C segment in CYP2D6 gene obtained good, quality PCR products, a 332 bp band Results of determinng G4268C polymorphism in CYP2D6 gene by PCR - RFLP M ĐC 332bp 229bp 103bp Figure 3.5 Is the cutting enzyme CYP2D6 gene G4268C region Eco91I enzyme 1-4 lung cancer patients; 5-7 control; M: 100 bp ladder standards; ĐC: positive control Comment: Genotype GG includes a band 332 bp DNA size Genotype GC includes bands 332 bp DNA size, 229 bp, 103 bp (3) Genotype CC includes bands 229 bp DNA size and 103 bp (wells 1, 2, 4, 5, 6.7) 17 Results of cutting restriction enzyme is checked using sequencing techniques CC GC Figure 3.6 Results of sequencing PCR products that carry G4268C polymorphism segment in CYP2D6 gene of DNA matching the G / G; G / C; C / C genotype in patients Comment: The results of DNA sequencing corresponding to the results of cutting restriction enzymes Table 3.11: The distribution of genotypes of G4268C polymorphism in CYP2D6 gene in lung cancer patients and the controls CYP2D6 G4268C n p Group GG GC CC 28 51 121 200 Control (14%) (25,5%) (60,5%) (100%) 26 126 68 220 Lung cancer < 0,001 (11,8%) (57,3%) (30,9%) (100%) 14 72 41 127 AC < 0,001 (11,0%) (56,7%) (32,3%) (100%) 11 46 24 81 SCC < 0,001 (13,6%) (56,8%) (29,6%) (100%) 12 SCLC < 0,008 (16,8%) (41,6%) (41,6%) (100%) Comment: Results of distribution of GG, GC and CC genotypes in lung cancer group is significantly different with p < 0.001 Adenocarcinoma, squamous cell carcinoma and small cell lung cancer have difference in genotype distribution genotypes with control group (p