Bệnh truyền nhiễm gia súc- chương 3

Bệnh truyền nhiễm gia súc- chương3

Chương 3

Chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm

I Khái quát về chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm là việc xác định nguyên nhân (và tên gọi) của hiện tượng bệnh lý đang có thông qua các thủ tục mô tả những hiện tượng bệnh lý đang gặp ở cá thể (bệnh) và ở quần thể (dịch) hoặc/và mô tả mầm bệnh đã được phân lập để so sánh những thuộc tính thu được đó với những thuộc tính của các bệnh/dịch hoặc mầm bệnh đã

được mô tả, phân loại và định danh (đặt tên) và quy thuộc hiện tượng bệnh lý đang có vào

một nhóm hiện tượng bệnh lý đã được phân loại và đặt tên Mô tả có thể dựa vào triệu chứng lâm sàng (chẩn đoán lâm sàng), bệnh tích (chẩn đoán giải phẫu bệnh lý), đặc điểm dịch học (chẩn đoán dịch tễ học) và các đặc điểm vi sinh vật học, huyết học, huyết thanh học, sinh học phân tử (chẩn đoán xét nghiệm) Như vậy, ta gọi được tên bệnh đang có là

nhờ vào việc xác định tính tương đồng của các biểu hiện bệnh và/hoặc căn bệnh với các

biểu hiện bệnh và/hoặc căn bệnh của những bệnh đã đặt tên từ trước Thủ tục chẩn đoán

(giống như thủ tục nhận dạng) vì vậy được gọi là thủ tục đồng định (identification) Trên thực tế, quá trình quy thuộc được thực hiện qua hàng loạt bước loại suy, ví dụ "vi khuẩn phân lập được nhuộm màu Gram âm vậy không thể là Bacillus hay một vi khuẩn Gram dương nào khác" Do đó, chẩn đoán còn là quá trình giám biệt (differentiation), còn các

tính trạng quan trọng giúp chẩn đoán được gọi là những đặc điểm giám biệt Tuy nhiên,

nhiều khi thủ tục chẩn đoán chỉ là việc xác nhận sự hiện diện của một mầm bệnh (chẩn

đoán bệnh nguyên học xác nhận kết quả chẩn đoán khác)

Đồng định, như vậy, không chỉ là "xác định", mà là xác định có định hướng trên cơ sở những kiến thức đã biết trước của nhà chuyên môn về các loại bệnh và/hoặc mầm

bệnh Hơn nữa đồng định có thể thất bại Sau mọi nỗ lực đồng định, nếu đồng định vẫn thất bại, nhà chuyên môn có thể đưa ra giả thuyết về loại bệnh mới, chưa được biết

Trong điều tra dịch tễ học người ta nghiên cứu tốc độ truyền lây, tỷ lệ mắc bệnh mới, tỷ lệ lưu hành bệnh, tỷ lệ tử vong, tuổi và giống phát bệnh chủ yếu, vùng phát sinh, yếu tố thời tiết, sinh sản dị thường hoặc đẻ trứng dị thường, giảm sản lượng sữa hoặc tỷ lệ đẻ trứng, thay đổi thức ăn, nhập động vật mới, sự truyền lây bệnh sang loại động vật khác, lịch sử tiêm phòng vacxin, Đặc biệt, điều tra dịch học là hết sức quan trọng trong quá trình nhận biết bệnh truyền nhiễm phát sinh ở động vật được chăn nuôi tập trung dưới cùng điều kiện môi trường

Tuy ở nhiều bệnh cảm nhiễm những đặc điểm dịch học, biểu hiện bệnh lý và triệu chứng lâm sàng có thể đặc trưng, và điều này giúp ích cho việc suy định mầm bệnh liên quan nhưng cần chú ý rằng cũng có thể chúng tạo định kiến ở người xét nghiệm và làm lệch lạc kết quả do lựa chọn sai phương pháp xét nghiệm, ví dụ, dùng phương pháp vi khuẩn học để xét nghiệm động vật bệnh do ngộ độc hóa chất (nông dược, )

Chẩn đoán bệnh nguyên học là những thủ tục vi sinh vật học, huyết thanh học và sinh học phân tử, nhằm xác định sự hiện diện của một loại mầm bệnh nào đó trong cơ thể bị bệnh Đương nhiên, quy thuộc yếu tố mầm bệnh nghi ngờ (với nhóm mầm bệnh đã biết) ở cấp độ càng chi tiết càng tốt: loài gì, nhóm huyết thanh học nào, nhóm di truyền học phân tử nào, là những câu hỏi thường đặt ra và tìm cách trả lời

Để thực hiện nhanh chóng và chính xác các xét nghiệm chẩn đoán bệnh nguyên học cần khảo cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích mổ khám và đặc điểm dịch tễ để suy định những bệnh nguyên liên quan có thể gây nên bệnh dịch Dựa vào triệu chứng lâm sàng và bệnh tích, vị trí bệnh biến chủ yếu, mà các bệnh truyền nhiễm động vật chia thành bệnh cơ quan hô hấp, bệnh hệ thần kinh trung ương, bệnh cơ quan tiêu hóa, bệnh sinh khối u (ung thư), bệnh da, bệnh cơ quan sinh dục tiết niệu và các chứng bệnh trở ngại sinh sản (vô sinh, đẻ non, ) Chủng loại các mầm bệnh cũng có thể là vi khuẩn, virut, nấm, nguyên trùng hoặc ký sinh trùng khác Hơn nữa các loại mầm bệnh không chỉ gây bệnh đơn thuần mà còn có thể bệnh hỗn hợp hoặc kế phát làm bệnh chứng lâm sàng càng thêm phức tạp Do đó, việc chọn lấy loại bệnh phẩm thích hợp với loại bệnh tật này hay khác và việc thu mẫu ảnh hưởng lớn đến kết quả chẩn đoán Trong trường hợp nghi ngờ bệnh do cảm nhiễm vi khuẩn, chẳng hạn, cần chú ý mở rộng giả thuyết về loại mầm bệnh mà lấy mẫu thích hợp để chẩn đoán cả bệnh cảm nhiễm virut và nấm,

II Chẩn đoán bệnh nguyên học

1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh phẩm

Kết quả phân lập bệnh nguyên phụ thuộc việc lấy bệnh phẩm vào thời điểm thích hợp và từ vị trí thích hợp cũng như những xử lý thích hợp cho đến khi xét nghiệm Cách lấy mẫu khác nhau phụ thuộc loại bệnh, mẫu bệnh phẩm, nhưng về nguyên tắc thì lấy sớm khi mới phát hiện bệnh trạng lâm sàng, hoặc nếu vật bệnh chết thì ngay sau khi chết là tốt Tuy nhiên, trong những bệnh cảm nhiễm mãn tính bệnh nguyên vẫn còn có thể phân lập được ngay cả khi bệnh đã qua Vị trí lấy bệnh phẩm thích hợp trong đa số trường hợp là tổ chức có biến đổi bệnh lý (ổ bệnh) hoặc vị trí liên quan Ví dụ, trong bệnh cơ quan hô hấp lấy dịch xoang mũi và khí quản, trong bệnh thần kinh lấy máu hoặc tủy sống, trong bệnh đường tiêu hóa lấy phân hoặc dịch từ hầu họng, trong bệnh ở da thì lấy nội dịch bọc nước và bọc mủ, trong bệnh đường sinh dục tiết niệu thì lấy nước tiểu hoặc dịch thẩm xuất tử cung, Hơn nữa, trong trường hợp phân lập mầm bệnh từ mẫu bệnh phẩm mổ khám bệnh tích thì cần lấy một cách vô trùng tránh vi khuẩn đường ruột ô nhiễm các loại bệnh phẩm (não, gan, lách, hạch lympho, ), thời điểm lấy các mẫu sau chết càng sớm càng tốt vì sau khi súc vật chết vài giờ các nội quan và máu đã bị tạp khuẩn xâm nhập và phát triển Hơn nữa, đối với các bệnh cảm nhiễm virut có chứng nhiễm virut huyết nặng như bệnh sốt lưu hành bò thì cần lấy máu vào thời điểm sốt Sau phát bệnh hai tuần trở đi là thời kỳ lấy máu thu huyết thanh kỳ hồi phục Trong thời kỳ này hiệu giá kháng thể tăng so với thời kỳ sốt cấp tính chứng tỏ mầm bệnh chứa kháng nguyên thuộc loại dùng để phát hiện kháng thể Ví dụ, nếu một bệnh xuất hiện trong quần thể thì ở các cá thể bị bệnh cấp tính triệu chứng bệnh kéo dài khoảng 1 tuần, khi đó khả năng phát hiện được mầm bệnh nhờ lấy mẫu để phân lập trong khoảng 1 tuần đó cho đến vài ngày sau đó Trong kỳ cấp tính này kháng thể đặc hiệu chưa được hình thành Tuy nhiên, sau thời điểm này kháng thể đặc hiệu bắt đầu tăng dần Nếu lấy mẫu huyết thanh kỳ hồi phục (từ 10 ngày cho đến 1 tháng sau khi xuất hiện triệu chứng thì hàm lượng (hiệu giá) kháng thể cao hơn nhiều so với lần lấy máu kỳ cấp tính Trong kỳ hồi phục này, ngược lại khó có thể phân lập được mầm bệnh

Trong kiểm tra bệnh nguyên, sau khi lấy mẫu nên xét nghiệm mẫu càng sớm càng tốt Trong trường hợp không thể thực hiện xét nghiệm ngay được, nếu để phân lập vi khuẩn thì bảo quản bệnh phẩm ở 4 °C hoặc đôi khi đông lạnh Nhưng với bệnh phẩm để

kiểm tra virut thì cần bảo quản ở -70 °C hoặc bảo quản trong dung dịch PBS (dung dịch sinh lý đệm phosphat) pha 50% glycerin

2 Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên

Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên bao gồm một số phương pháp bên cạnh việc chẩn đoán lâm sàng: kiểm tra trực tiếp, nuôi cấy phân lập và đồng định mầm bệnh qua các xét nghiệm, phản ứng dị ứng và các phản ứng huyết thanh học xác định sự tăng hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh Hai sơ đồ dưới đây thường được áp dụng cho việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn và virut gây ra ở động vật

Kiểm tra trực tiếp bệnh phẩm được thực hiện trong trường hợp phải vận dụng đối

sách cấp bách đối với bệnh cảm nhiễm và nhiều khi đồng thời với xác định mầm bệnh qua phân lập

Trong trường hợp bệnh cảm nhiễm vi khuẩn người ta có thể suy định chủng loại mầm bệnh trên cơ sở các đặc điểm hình thái, bắt màu của vi khuẩn có trong bệnh phẩm Khi xác nhận được mầm bệnh trong các tiêu bản chế tác từ ổ bệnh ở các cơ quan tổ chức vốn không có vi sinh vật, hoặc là khi thấy các vi khuẩn nghi gây bệnh một cách áp đảo ở các tổ chức thường có các vi khuẩn "bình thường" thì phương pháp kiểm tra trực tiếp là rất hữu ích Hơn nữa, kết quả này còn có tác dụng tham khảo đối với việc tuyển chọn những khuẩn lạc đặc hiệu phát triển trên môi trường phân lập vi khuẩn Trong trường hợp

bệnh cảm nhiễm nguyên trùng hoặc Leptospira và Spirochaeta người ta còn có thể sử

dụng những tiêu bản tươi mới không nhuộm

Ngoài ra, có thể sử dụng các phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phản ứng ngưng kết để kiểm tra kháng nguyên đặc hiệu, hoặc phương pháp PCR để kiểm xuất ADN đặc hiệu của mầm bệnh như những phương pháp kiểm tra trực tiếp

Trong trường hợp bệnh cảm nhiễm virut các phương pháp trực tiếp kiểm tra thể bệnh nguyên có thể là phương pháp hiển vi điện tử để phát hiện các virion virut, phương pháp phát hiện thể vùi (thể ấn nhập) trong tiêu bản tổ chức nhuộm, phương pháp kháng thể huỳnh quang phát hiện kháng nguyên đặc hiệu, phương pháp PCR để phát hiện ADN đặc hiệu của mầm bệnh

Phương pháp hiển vi điện tử áp

kiểm tra trực tiếp hoặc kiểm tra sau khi làm sạch và tăng nồng độ các bệnh phẩm (dịch ổ viêm, niêm dịch mũi,

phân, ) hoặc các tiêu bản lá siêu mỏng làm từ tổ chức bệnh biến đã nhuộm âm bản Các phương pháp kháng thể huỳnh quang và nhuộm tổ chức sử dụng các tiêu bản làn mỏng tế bào tách biệt hoặc từ lát cắt tổ chức

Các phương pháp kiểm tra trực tiếp rất hữu ích trong các trường hợp phải chẩn đoán nhanh một cách chính xác để có đối sách dự phòng sớm đối với các virut khó hoặc không thể nuôi cấy

2.1 Phương pháp kiểm tra phát hiện kiểu hình

Các phương pháp kiểm tra phát hiện kiểu hình bao gồm hiển vi trực tiếp tiêu bản nhuộm (nhuộm Gram, Giemsa, ) hoặc tiêu bản tươi, hoặc sau khi nuôi cấy khởi đầu phân lập vi sinh vật gây bệnh thì nghiên cứu các đặc điểm sinh lý (khả năng phát triển trong các môi trường và đặc điểm lứa cấy, ), đặc điểm sinh hóa (phân giải hay tổng hợp

các chất, sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa, ), khả năng đề kháng (hay mẫn cảm) với các thuốc kháng sinh, Trên cơ sở mô tả các tính trạng của vi sinh vật có thể so sánh với những mô tả trước đó để có thể quy thuộc vi sinh vật ta đang có vào một nhóm vi sinh vật nhất định

2.2 Phương pháp phát hiện axit nucleic đặc hiệu

Trình tự nucleotid của ADN nhiễm sắc thể các sinh vật, của axit nucleic trong nucleocapsid của virut cũng như của ty thể sinh vật nhân thực có tính bảo toàn cao, bảo đảm tính cá thể của chúng trong quá trình phát triển Trình tự này có thể khác nhau ở các cá thể khác nhau nhưng ở những miền nhất định trong trình tự axit nucleic này là ổn định ở các cá thể cùng loài, ở miền khác lại giống nhau ở những cá thể trong cùng nhóm phân loại lớn hơn Nhìn chung những miền axit nucleic genom có tính bảo toàn cao là những gen có tính chức năng cao Các phương pháp phát hiện gen đặc hiệu hoặc ADN và ARN đặc hiệu được áp dụng khá rộng rãi trong phân loại và đồng định vi sinh vật thời gian gần đây nhờ những thành tựu to lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử Các phương pháp phát hiện gen đặc hiệu thường được sử dụng là PCR (polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi enzym trùng hợp) với những biến thể của nó (RAPD, ), hoặc RT-PCR với ARN virut hoặc sinh vật khác, các phương pháp lai phân tử (hybridization, gồm nhiều biến thể khác nhau như Southern hybridization, Northern hybridization, Western hybridization), tính đa dạng ngẫu nhiên, giải đọc và so sánh trình tự nucleotid, Mục đích của các phương pháp này là so sánh phân loại vi sinh vật trên cơ sở tính đồng dạng và dị biệt (tính đồng - dị) của các gen có chức năng cao nào đó, trên cơ sở đó có thể đồng định các vi sinh vật bệnh nguyên mới phát hiện được với các mầm bệnh đã được mô tả và phân loại trước đó, tức xác nhận rằng ở trong bệnh phẩm có vi sinh vật thuộc loại mầm bệnh trong số các mầm bệnh đã biết hay không thông qua xác nhận sự hiện diện của gen đặc hiệu loại mầm bệnh này mầm bệnh khác đã được biết đó

2.3 Phương pháp huyết thanh học

Các phương pháp huyết thanh học dùng để phân biệt các sinh vật hoặc đồng định chúng thông qua việc đánh giá tính dị biệt hoặc tính đồng dạng của các phân tử tham gia phản ứng với các kháng huyết thanh hay kháng thể Bản chất của phương pháp này là lợi dụng tính đặc hiệu của phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể: "kháng nguyên nào thì kết hợp với kháng thể nấy" Trong thực tế các phản ứng huyết thanh học có thể giúp phát hiện kháng nguyên (nếu có sẵn kháng thể đặc hiệu) hoặc phát hiện kháng thể (nếu có sẵn kháng nguyên)

Việc phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm thường có thể khẳng định sự hiện diện của mầm bệnh Tuy nhiên, phản ứng này thường khó khăn hơn so với các phản ứng phát hiện kháng thể Phát hiện ra kháng thể cho phép kết luận rằng trong quá khứ động vật đã bị kháng nguyên xâm nhập (có thể là bị cảm nhiễm hoặc đã được tiêm vacxin) Như vậy, phát hiện kháng thể trong máu động vật có thể không có ý nghĩa chẩn đoán Tuy vậy, nếu thực hiện hai lần xét nghiệm kháng thể (cách nhau một số ngày) trong quá trình bệnh lâm sàng mà thấy có sự tăng cao hàm lượng (hiệu giá) kháng thể chứng tỏ bệnh do mầm bệnh (mang kháng nguyên) tương ứng gây ra

3 Phân lập và đồng định bệnh nguyên

Đồng định mầm bệnh nhằm trả lời câu hỏi có phải bệnh (với những triệu chứng lâm sàng và đặc điểm bệnh tích đã mô tả) gây ra bởi vi sinh vật nào đó (thuộc loại đã được biết là gây bệnh) hay không Hay nói cách khác, đồng định mầm bệnh là xác định mầm bệnh nghi ngờ có mặt trong bệnh phẩm có thực sự có mặt trong đó hay không Việc

nghiên cứu là khá đơn giản nếu chỉ có một tác nhân gây bệnh nghi ngờ Khi đó chỉ cần

trả lời kết quả dương tính hay âm tính Tuy nhiên, nhiều khi số chủng loại mầm bệnh thuộc đối tượng nghi ngờ không ít Khi đó, rất có thể phải áp dụng đồng thời nhiều hướng nghiên cứu phân lập và các kỹ thuật kiểm định khác nhau (vi sinh vật học, huyết thanh học, phân tích phát hiện gen đặc hiệu mầm bệnh, )

3.1 Vi khuẩn

Phân lập và đồng định vi khuẩn mầm bệnh phải dựa trên những hiểu biết trước về đặc tính của loại mầm bệnh đó bởi vì chỉ có như vậy mới có thể nuôi cấy khởi đầu thành công cũng như phân lập được vi khuẩn mầm bệnh dưới dạng lứa cấy thuần khiết để có nguyên liệu cho các xét nghiệm sau đó Nhiều vi khuẩn phát triển mạnh, có thể hình

thành khuẩn lạc (từ một tế bào ban đầu) sau một ngày đêm (ví dụ, E coli) nhưng nhiều vi

khuẩn khác lại cần nuôi cấy trong thời gian kéo dài (2 tuần đến 2 tháng đối với trực khuẩn lao, ) và cũng có vi khuẩn không nuôi cấy được trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo (vi khuẩn bệnh Tyzzer, bệnh phong) Những vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện là khá thuận lợi cho việc nuôi cấy phân lập nhưng các vi khuẩn yếm khí thường đòi hỏi

những điều kiện không tiếp xúc với khí quyển (Bacteroides, Fusobacterium, Veillonella) hoặc điều kiện yếm khí của môi trường dinh dưỡng (Clostridium) Cũng có những vi

khuẩn mầm bệnh thường cần phải bồi dưỡng tăng sinh trước khi nuôi cấy phân lập do

mật độ của chúng trong bệnh phẩm thường không cao (Salmonella) Trong nhiều trường

hợp khả năng phân lập trực tiếp mầm bệnh thường thấp do vi sinh vật tạp nhiễm, khi đó cần sử dụng cơ thể động vật thí nghiệm mẫn cảm làm môi trường tuyển lựa đối với mầm bệnh Biện pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm này đòi hỏi phải nắm được tính gây bệnh của các loại mầm bệnh trong điều kiện thí nghiệm

Để nuôi cấy khởi đầu thường sử dụng các môi trường đặc thích hợp Các môi trường thạch thường, thạch máu thường được sử dụng cho nhiều loại vi khuẩn Tuy vậy, đối với nhiều vi khuẩn mầm bệnh có thể sử dụng trực tiếp môi trường phân biệt (như các môi trường Endo, Istrati, EMB, cho một số trực khuẩn đường ruột, môi trường muối -

kiềm cho các Vibrio, môi trường Lowenstein với trực khuẩn lao, ) Với vi khuẩn hiếu

khí, bằng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ bệnh phẩm phết lên một vị trí trên bề mặt môi trường nuôi cấy khởi đầu rồi cũng bằng que cấy đó, hoặc một que cấy vô trùng khác, từ vị trí vết bôi vạch lên bề mặt môi trường đó đường gấp khúc không chồng lên nhau và càng dài càng tốt Sau khi ủ ở điều kiện thích hợp từ môi trường đó, đặc biệt ở những vùng cuối cùng của đường vạch có mật độ vi khuẩn thấp, ta có thể thu được những khuẩn

lạc riêng rẽ có những dấu hiệu đặc trưng đối với vi khuẩn mầm bệnh cần đồng định

Chọn một số khuẩn lạc đại diện để nuôi cấy tiếp trên môi trường đặc mới để có lứa cấy thuần khiết dưới dạng những khuẩn lạc riêng rẽ hoặc canh khuẩn lỏng Chú ý rằng trên môi trường tuyển lựa có thể có những tế bào vi khuẩn khác loại không thể hình thành khuẩn lạc nhưng vẫn sống và có thể phát triển trên môi trường khác và, vì vậy, cần tránh để que cấy chạm vào bề mặt môi trường một cách không cần thiết

Để đồng định cần vận dụng các thử nghiệm thích hợp như nghiên cứu hình thái, tính chất bắt màu Gram, các tính trạng sinh lý (phát triển trên môi trường nghèo hoặc có chứa một số chất nhất định ở một nồng độ nhất định như muối mật, mật, NaCl, KCN, ), các tính trạng sinh hóa (chuyển hóa các chất như lên men đường có sinh hơi hoặc không sinh hơi, hình thành axit hữu cơ, acetoin, sản sinh ureaza, sinh indol, ), tính gây bệnh đối với động vật, với phôi gà và lứa cấy tế bào (vero, ), thành phần protein tế bào, cấu trúc kháng nguyên,

3.2 Virut

Việc nuôi cấy phân lập virut đòi hỏi phải có môi trường tế bào sống như động vật thí nghiệm, lứa cấy tế bào tổ chức, trứng gà đang phát dục (phôi gà) với một số xử lý đối với bệnh phẩm Bệnh phẩm được nghiền nhỏ, pha với nước sinh lý cho có đủ độ loãng nhất định, thêm chất kháng sinh (thường là penicillin và streptomycin) để diệt vi khuẩn Để loại bỏ vi khuẩn, có thể lọc bệnh phẩm đã nghiền (thường với cát vô trùng để tăng khả năng giải phóng virion) qua lọc vi khuẩn (đường kính lỗ khổng <0,22 μm) rồi cấy vào môi trường lứa cấy tế bào một lớp, phôi gà hoặc động vật thí nghiệm Với động vật thí nghiệm cần theo dõi thường xuyên các triệu chứng lâm sàng, sau đó mổ kiểm tra bệnh tích, dựa trên các triệu chứng và bệnh tích điển hình mà khẳng định sự phát triển của virut Nếu không có biểu hiện lâm sàng và bệnh tích, cần thực hiện phản ứng huyết thanh học để phát hiện và trắc định kháng thể, so sánh hai kết quả hàm lượng (hiệu giá) kháng thể trước và sau quá trình theo dõi vật sau tiêm truyền có thể khẳng định về sự phát triển của virut trong cơ thể động vật

Ở lứa cấy tế bào, nhiều loại virut gây hiệu quả bệnh lý tế bào (CPE) hay bệnh tích tế bào Dựa vào CPE đặc trưng ta có thể xác nhận được sự phát triển của virut phát triển trong lứa cấy tế bào tổ chức Nếu không biểu hiện CPE có thể kiểm tra sự hiện diện của kháng nguyên bằng phản ứng huyết thanh học

III Chẩn đoán huyết thanh - miễn dịch học

1 Phương pháp huyết thanh học

Phương pháp huyết thanh học giúp ta phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trên cơ sở phát hiện sự hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể khi trộn một thành phần đã biết (kháng nguyên hoặc kháng thể) với một dịch nghi có chứa yếu tố kia (kháng thể hoặc kháng nguyên) Phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm chứng tỏ con vật bị cảm nhiễm mầm bệnh có kháng nguyên tương ứng Tuy nhiên, phản ứng phát hiện kháng nguyên thường có độ nhạy thấp và khó có được bệnh phẩm thích hợp đặc biệt khi động vật còn sống Vì vậy, người ta thường vận dụng phản ứng phát hiện kháng thể Phản ứng này có nhược điểm là khó giải thích kết quả phản ứng Kết quả dương tính thường nói rằng trong quá khứ cơ thể động vật đã tiếp xúc với kháng nguyên tương ứng vừa có thể do cảm nhiễm tự nhiên, vừa có thể do đã được tiêm phòng Bên cạnh đó, cảm nhiễm tự

nhiên cũng có thể là thui, mầm bệnh chỉ kích thích miễn dịch nhưng sau đó không tồn tại

trong cơ thể Như vậy, ngay cả khi đã loại trừ trường hợp đáp ứng miễn dịch do vacxin thì nếu giết hủy loại thải những con vật kháng thể dương tính thì vẫn có thể là lạm sát Tuy nhiên, trong trường hợp bệnh tiến triển nếu lấy máu kiểm tra kháng thể hai lần mà thấy có sự gia tăng lượng kháng thể chứng tỏ bệnh do mầm bệnh tương ứng đang tiến triển

Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là đơn giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên - kháng thể được hình thành thường khó phát hiện nếu không có những thủ thuật thích hợp Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp phân tích khác nhau Có thể nói, mỗi phương pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể Ngoài ra, các phản ứng định lượng (thường bán định lượng) như xác định hiệu giá kháng thể có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá đáp ứng miễn dịch tập đoàn

1.1 Phản ứng kết tủa

Phản ứng kết tủa là phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên khi có kháng thể biết trước và để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên biết trước thông qua việc phát hiện sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, trong đó kháng nguyên là chất tan

Do kháng nguyên là chất tan nên phản ứng dù xảy ra cũng có thể không được nhận biết bởi vì tổ hợp kháng nguyên kháng thể sau khi hình thành có thể hòa lẫn (xáo trộn) cùng với dung dịch do tác động của dòng đối lưu Để khắc phục, phản ứng này được thực hiện trong điều kiện giảm thiểu dòng đối lưu của dung dịch Có thể thực hiện phản ứng kết tủa trong ống nghiệm nhỏ và trong keo (gel) agar (hoặc agarose)

Với ống nghiệm nhỏ người ta cho kháng nguyên (dịch chiết từ bệnh phẩm, phải trong suốt) vào ống sau đó bằng ống hút (pipet) có đầu nhỏ lấy một lượng tương đương kháng huyết thanh (kháng thể), đưa đầu ống pipet vào sâu tận đáy ống nghiệm rồi nhả từ từ cho kháng huyết thanh đội dần lớp kháng nguyên lên Kết quả ta có hai lớp dịch trong ống Để yên ở nhiệt độ phòng, sau một thời gian (vài chục phút) nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy một vòng kết tủa màu trắng gần giữa hai lớp dịch (thường thấp hơn ranh giới giữa hai lớp dịch một chút) Kỹ thuật này thường dùng phát hiện kháng nguyên giáp mô vi khuẩn nhiệt thán (phản ứng Ascoli)

Phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch có một số biến thể: khuyếch tán một

chiều, khuyếch tán hai chiều Kỹ thuật khuyếch tán một chiều ít được sử dụng do phải

tiêu tốn lượng lớn yếu tố phản ứng (kháng huyết thanh hoặc kháng nguyên) Người ta pha thạch (agar hoặc agarose) vào dung dịch sinh lý NaCl 0,8 - 0,85% (pH 7,2) ở nồng độ thạch khoảng 1% (0,8 - 2,0% agar, phụ thuộc vào chất lượng thạch, có thể kiểm tra bằng thực nghiệm), đun tan chảy đều rồi ủ duy trì ở 50 °C Ở nhiệt độ này thạch ở trạng thái lỏng, có thể cho vào đó một lượng kháng nguyên (hoặc kháng thể), trộn đều rồi đổ thành bản thạch trên phiến kính (hoặc trong đĩa Petri), đục lỗ, mỗi lỗ cho một loại mẫu cần xét nghiệm Nhỏ vào đó một lượng kháng thể (hoặc kháng nguyên) Ủ vào buồng ẩm ở nhiệt độ phòng hoặc 4 °C Sau một thời gian nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy vòng kết tủa trắng xuất hiện quanh lỗ tương ứng

Phản ứng kết tủa khuyếch tán hai chiều được thực hiện một cách đơn giản nhất

với hai lỗ nhỏ được đục trong khối thạch agarose, một lỗ chứa kháng nguyên còn lỗ kia chứa kháng thể Ủ trong buồng giữ ẩm một số ngày và theo dõi hàng ngày, nếu phản ứng xảy ra ta sẽ thấy đường kết tủa trắng xuất hiện giữa hai lỗ (ở vùng có tỷ lệ hóa trị kháng thể và hóa trị kháng nguyên xấp xỉ 1) Tuy nhiên, phản ứng này thường có độ nhạy rất thấp do đó cần vận dụng phương pháp cải tiến như dưới đây

Trên một phiến thạch cần đục 7 lỗ (đường kính khoảng 3 mm, một lỗ ở tâm và sáu lỗ ở xung quanh (biên), đều cách lỗ tâm và cách nhau khoảng 3 - 3,5 mm Như vậy ba

lỗ liền kề nhau luôn tạo một tam giác đều Nếu để phát hiện kháng nguyên thì nhỏ vào lỗ

tâm một lượng kháng huyết thanh chuẩn (kháng thể) rồi nhỏ vào hai lỗ biên đối diện nhau một lượng kháng nguyên chuẩn Còn bốn lỗ biên còn lại dùng để chứa các mẫu kháng nguyên cần kiểm Ủ vào buồng ẩm, kiểm tra kết quả hàng ngày Nếu các lỗ kiểm đều không chứa kháng nguyên tương ứng thì giữa kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn phải xuất hiện đường tủa chuẩn thẳng kéo dài từ phía một lỗ cần kiểm sang phía một lỗ cần kiểm đối diện Nếu có kháng nguyên ở lỗ cần kiểm nào đó thì đường kết tủa chuẩn sẽ uốn cong trước lỗ đó và hướng về phía lỗ tâm Trong trường hợp kháng nguyên ở lỗ cần kiểm có nồng độ cao, đường kết tủa trắng sẽ xuất hiện giữa lỗ đó với lỗ tâm và cùng với đường kết tủa chuẩn tạo thành một đường cong liên tục Sự giao cắt của hai đường tủa (chuẩn và kiểm) chứng tỏ thành phần kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn là đa giá còn kháng nguyên kiểm, ít nhất là, có thành phần không cùng nhóm với kháng nguyên chuẩn

Để phát hiện kháng thể thì cho kháng nguyên chuẩn vào lỗ tâm, một cặp lỗ đối diện chứa kháng huyết thanh chuẩn, bốn lỗ còn lại chứa huyết thanh cần kiểm Kết quả biểu hiện dưới dạng các đường kết tủa tương tự trường hợp trên

1.2 Phản ứng ngưng kết

Phản ứng ngưng kết là phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên khi có kháng thể biết trước và để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên biết trước thông qua việc phát hiện sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, trong đó kháng nguyên là hữu hình (tế bào vi khuẩn, hạt nhỏ, tế bào hồng cầu, )

Nếu để phát hiện kháng thể, kháng nguyên là tế bào vi khuẩn có thể được nhuộm màu (bằng crystal violet, rose bengal), khi đó có thể thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh với huyết thanh, với máu nguyên hoặc với sữa nguyên

Phản ứng ngưng kết nhanh với máu nguyên được thực hiện bằng cách trộn một

giọt máu nguyên vừa lấy từ động vật bằng một vòng (khuyên cấy vi khuẩn) trộn với một giọt nhỏ dịch kháng nguyên đã được nhuộm màu đặt sẵn trên một phiến kính Kết quả dương tính biểu hiện dưới dạng các hạt trong giọt co cụm lại làm cho dịch còn lại trở nên trong Nếu không phản ứng (âm tính) các tế bào vi khuẩn nhuộm màu vẫn phân bố đều trong giọt làm dịch tiếp tục đục đều Phản ứng này dùng để phát hiện nhanh tình hình

nhiễm Salmonella gallinarum-pullorum (hay Salmonella Gallinarum-Pullorum gây bệnh

bạch lị gà con và thương hàn gà trưởng thành) trong đàn gia cầm và một số bệnh nhiễm khuẩn khác

Phản ứng ngưng kết nhanh với sữa nguyên được thực hiện để phát hiện bò cái,

cừu cái mang mầm bệnh sẩy thai truyền nhiễm và một số bệnh nhiễm khuẩn khác Cho một ít sữa tươi mới vào ống nghiệm rồi cho kháng nguyên vi khuẩn đã nhuộm vào lắc trộn đều Nếu phản ứng dương tính, các tế bào vi khuẩn sẽ co cụm lại với nhau và bám vào lớp kem nổi lên bề mặt sữa với màu thuốc nhuộm vi khuẩn kháng nguyên Ngược lại các tế bào vi khuẩn có màu phân bố đều trong sữa khi phản ứng âm tính

Phản ứng ngưng kết nhanh cho kết quả nhanh nhưng độ nhạy thấp và không thể

định lượng để so sánh hàm lượng kháng thể như phản ứng chậm trong ống nghiệm Cho

vào mỗi ống của một dãy ống nghiệm 1 phần (hoặc 4 phần, hoặc 9 phần) nước sinh lý rồi cho vào ống nghiệm thứ nhất (đầu dãy) 1 phần huyết thanh, trộn rồi chuyển sang ống nghiệm tiếp theo bằng lượng huyết thanh đã đưa vào (1 phần) và cứ tiếp tục trộn và chuyển như vậy cho đến hết dãy thì vứt bỏ bằng lượng đó Ta có dãy huyết thanh pha loãng 2 lần (hoặc 5 lần, hoặc 10 lần) Cho vào tất cả các ống nghiệm một lượng ổn định kháng nguyên (vi khuẩn đã biết), trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng, kiểm tra phản ứng sau khoảng 10 - 30 phút Phản ứng dương tính thể hiện ở dạng các tế bào vi khuẩn ở ống tương ứng ngưng tụ lại làm đục cả ống nghiệm, trong khi ở các ống âm tính vi khuẩn (kháng nguyên) chìm xuống đáy ống làm dịch trở nên trong Ngưng kết thấy rõ ở những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau, vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy ngưng kết Nhờ phản ứng này ta có thể xác định được hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bị kiểm Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh (hoặc nhũ thanh, ) còn cho phản ứng dương tính Phản ứng ngưng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác Khi đó thường phải có bộ kháng huyết thanh đa giá (xác định nhóm) và đơn giá (xác định typ)

Trong thực tế các virut được coi là kháng nguyên hòa tan và không thể thực hiện phản ứng ngưng kết Tuy vậy, bằng cách gắn kết virut lên hồng cầu người ta có thể tạo được kháng nguyên hữu hình đặc hiệu virut có tính ngưng kết hoàn hảo với kháng thể và

được áp dụng trong một biến thể của phản ứng huyết thanh học, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện và bán định lượng kháng thể Đồng thời, kháng nguyên này cũng còn được sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện

kháng nguyên bằng cách lấy kháng huyết thanh chuẩn cho tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa kháng nguyên nghi rồi đo lại hàm lượng (hiệu giá) kháng thể bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Sự sụt giảm hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn chứng tỏ có kháng nguyên đặc hiệu trung hòa kháng thể đó

1.3 Phản ứng cố định bổ thể

Phản ứng cố định bổ thể (CFR) hay còn gọi là phản ứng kết hợp bổ thể là phản

ứng huyết thanh học phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể thông qua vận dụng thuộc tính gây dung giải tế bào, kể cả tế bào hồng cầu, của hệ thống bổ thể (các enzym trong huyết tương động vật có vai trò trong miễn dịch không đặc hiệu) một khi hệ thống này được hoạt hóa nhờ kháng thể khi kháng thể hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể Phản ứng này gồm hai hệ thống: 1) hệ thống phản ứng chính và 2) hệ thống phản ứng hiển thị (hệ thống phụ, hay hệ thống dung huyết)

Bổ thể là một hệ thống gồm 9 protein (C1 đến C9) hòa tan trong huyết tương ở trạng thái vô hoạt và có thể được hoạt hóa theo phản ứng dây chuyền từ C1 đến C9 một khi C1 được hoạt hóa (con đường cổ điển) hoặc C3 được hoạt hóa (con đường nhánh) Yếu tố C1 được hoạt hóa nhờ phần Fc của kháng thể khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên (Fc từ trạng thái vô hoạt sang trạng thái hoạt động của một enzym) Khi tổ hợp bổ thể được hoạt hóa một số yếu tố sản phẩm của bổ thể được hình thành và gắn kết lên cấu trúc màng tế bào chất làm hình thành tổ hợp tấn công màng (MAC - membrane attacking complex) là những lỗ khổng bất thường trên màng tế bào chất qua đó tế bào chất bị thoát ra ngoài (dung bào) (bên cạnh các phản ứng quá mẫn, viêm và hoạt hóa thực bào, ) Tuy