Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu đề tài 2 1.3 Yêu cầu 2 1.4 Nội dung thực hiện 2

Phần I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật trong nông nghiệp đã mang lại nhiều thành tựu to lớn trong đó quan trọng nhất là giảm tỷ lệ đói nghèo trên thế giới nhờ nâng cao năng suất cây trồng Mặc dù thuốc bảo vệ thực vật giúp giảm tổn thất do sâu hại (ước tính mức độ tổn thất do sâu hại nếu không sử dụng thuốc trừ sâu là 83 % ở lúa gạo và 84 % ở bông vải (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2004)) song thuốc trừ sâu cũng mang lại những bất lợi khó giải quyết như: ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe con người, mất cân bằng sinh thái và gây tính kháng của côn trùng Trong những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu tạo ra các cây trồng chuyển gen mang tính kháng, xem các giống kháng là thành phần chủ yếu trong hệ thống phòng trừ tổng hợp Tuy nhiên, những gen dùng trong công nghệ chuyển gen còn ít, chuyển gen tỷ lệ thành công thấp và vẫn còn tồn tại những tranh cãi về tính an toàn của cây chuyển gen nên thuốc trừ sâu vi sinh được coi là giải pháp khả thi, có thể đáp ứng nhanh yêu cầu của con người về một giải pháp phòng trừ sâu hại an toàn môi sinh và hiệu quả, giúp hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Thuốc trừ sâu vi sinh gồm các sản phẩm từ các loài thiên địch của sâu như: các loài ăn mồi, ký sinh, nguồn bệnh, trong đó các chế phẩm tạo nên trên cơ sở các loài nấm chiếm vị trí quan trọng, đặc biệt chế phẩm nấm diệt sâu từ nấm

Beauveria bassiana đã có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn trùng gây hại Để nâng

cao hiệu quả ứng dụng của nấm này, cần đẩy mạnh các nghiên cứu về sinh học, sinh

lý, sinh thái và mối quan hệ giữa nấm Beauveria bassiana với côn trùng vật chủ

Trong đó, nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh học hiện nay khi nghiên cứu các đối tượng là đọc được chuỗi mã DNA để phân tích bộ genome nhằm tìm hiểu quan hệ di truyền của các đối tượng nghiên cứu và mối liên hệ giữa genome với tính độc của nấm nhằm tạo ra các chế phẩm vi nấm có hiệu quả diệt côn trùng cao Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi chỉ đọc trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của rDNA

để so sánh sự biến đổi trong trình tự giữa các chủng nấm Beauveria bassiana

1.4 Nội dung thực hiện

Phân lập thêm một số dòng nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng

Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm có tính độc cao Đọc trình tự vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 trực tiếp từ sản phẩm PCR và tiến hành so sánh với cơ sở dữ liệu của NCBI

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana

2.1.1 Vị trí phân loại

Lớp: Deuteromycetes Bộ: Moniliales

Theo Nguyễn Ngọc Tú - Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Nấm

Beauveria bassiana có bào tử trần hình cầu (đường kính 1 - 4 m) đến hình trứng

(1,5-5,5 x 1,3 m) Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi trường, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng.” Nấm khi mọc trên côn trùng thường có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và có nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi

Khi mọc trên môi trường thạch, nấm Beauveria bassiana nhìn chung có màu

trắng, viền khuẩn lạc thường có màu kem hoặc vàng nhạt, thỉnh thoảng có màu đỏ nhạt (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Beauveria bassiana tạo rất nhiều bào tử, bào tử thường có hình cầu, hình trứng,

có khi chiều dài lên tới 20 m với 1 m chiều rộng Các sợi nấm khí sinh mang các giá bào tử trần ngắn, phồng to 3 - 5 x 3 - 6 m Các giá bào tử này hoặc tạo thành các nhánh ở phần ngọn, hoặc trực tiếp tạo thành các tế bào sinh bào tử trần Các tế bào sinh bào tử trần thành cụm, được tạo thành từ giá hoặc từ nhánh của giá, hoặc được tạo thành trực tiếp từ sợi nấm khí sinh hay từ nhánh ngang và ngắn của các sợi nấm này Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần hình cầu, hình chai 2,5 - 3,5 x 3 - 6 m, phần ngọn của tế bào dạng cuống hẹp, ngoằn ngoèo hình chữ chi, hoặc ngoằn ngoèo không

đều, có răng cưa 1 x 5 - 20 m Bào tử trần không có vách ngăn, hình cầu hoặc elip, đôi khi có gốc nhọn, nhẵn 2 – 3 x 2 – 4 m, màu trắng hay vàng nhạt (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy

Do có hệ enzyme phong phú (lipase, protease, urease, aspatainase, amylase) nên nấm này có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường dinh dưỡng với các thành phần khác nhau Trong đó môi trường thạch khoai tây hay được sử dụng và khả năng phát triển của nấm trên môi trường này là tốt nhất (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.1.3.2 Điều kiện nhiệt độ

Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng, hầu như ảnh hưởng tới toàn bộ hoạt động sống của nấm, mỗi loại nấm chỉ có khả năng phát triển trong một giới hạn nhiệt độ nhất định Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự nảy mầm, phát triển và tạo bào tử của nấm

Beauveria bassiana là 25 – 30oC (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.1.3.3 Điều kiện pH

Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trường từ 3 - 9 không ảnh hưởng tới sự

phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral (1970) nấm Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trường, pH thuận

lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0 Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng phát

triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,3 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú

và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.1.4 Điều kiện phân bố

Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp Giống như hầu hết các loại nấm

diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành thành viên trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên Vì là vật ký sinh chuyên hóa

rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính Khả năng nhiễm thành công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm khác nhau:

qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp và qua lỗ của thân Ngoài ra, nấm Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận

lợi dưới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh dưỡng kết lại thành một thể rắn chắc)

Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì:

chúng có thể phát triển trên môi trường dinh dưỡng, có thể được chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêu diệt một lượng không nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Nấm Beauveria bassiana có khả năng phát tán rộng trong thiên nhiên thông qua

các hoạt động phóng bào tử bằng cơ học (chúng có có khả năng bắn bào tử tới khoảng cách gấp hàng nghìn lần lớn hơn kích thước của chúng), lan truyền nhờ dòng nước,

không khí và côn trùng (một số loài của bộ Collembola, như Lepidocyrtus giúp nấm Beauveria bassiana di chuyển khá xa) (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương

Giang, 1997)

2.1.5 Độc tố của nấm Beauveria bassiana

Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào tử

nảy mầm Tên thông thường của độc tố là beauverixin, công thức hóa học C45H57O9N3 - ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)3 Đó là một loại depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94oC (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của beauvericin (F R Champlin, 1979)

Tiến trình cấy chuyền Beauveria bassiana qua côn trùng vật chủ sống thì nồng độ độc tố tạo thành tăng hơn so với Beauveria bassiana phân lập giữ trên môi trường

tổng hợp Ngoài ra, nồng độ độc tố cao nhất với sâu được tạo thành khi nấm được nuôi cấy trên chính sâu này Như vậy, nguồn dinh dưỡng của nấm có ý nghĩa đối với sự hình thành độc tố chuyên hóa (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Ngoài ra, mô côn trùng bị nhiễm nấm thì bền vững dưới tác dụng của vi sinh vật gây thối rữa chứng tỏ nấm này có khả năng tạo ra một số chất trao đổi giống kháng sinh Evlachova (1970) đã nghiên cứu tính chất kháng khuẩn của một số nòi nấm

Beauveria bassiana và kết luận rằng phổ diệt khuẩn của chúng khá rộng Tính chất này

rất có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.1.6 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng 2.1.6.1 Sự xâm nhập

Các nấm diệt sâu xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua toàn bộ vỏ cutincun ngoài nhờ enzyme phân hủy lớp chitin của cutincun (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Theo Robinson R.K (1996), sự xâm nhập của nấm diệt sâu qua lớp cutincun ngoài được thực hiện bằng lực cơ học, còn sự tiến sâu vào lớp cutincun trong thì được thực hiện nhờ họat động của enzyme do chính nấm tiết ra Ngoài ra, Robinson R.K

cũng xác nhận rằng các nấm diệt sâu chuyên hóa cao tạo nên trên bề mặt cutincun một kiểu giác bám phồng lên dạng kim xuyên vào bên trong cuticun của côn trùng Sự xâm nhập vào xoang thân côn trùng xảy ra khá nhanh chóng, qua 32 - 48 giờ đã làm đầy cơ thể côn trùng với những đoạn sợi nấm đơn bào tự do bơi trong huyết tương dẫn đến sự phá hủy tiếp theo mô thân côn trùng (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.1.6.2 Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết

Theo Sekhurina J A (1964), khi các bào tử chồi của nấm Beauveria bassiana

bắt đầu sinh sôi nảy nở trong huyết tương của bọ rùa thì bọ rùa bắt đầu tê liệt, và sau khi vật chủ chết thì nấm mọc thành sợi nấm chui vào trong các bắp cơ và khí quản của côn trùng; các chế phẩm mô bệnh lý nhuộm cho thấy hạch thần kinh bị biến đổi màu do ảnh hưởng của độc tố (ở giai đoạn đầu của bệnh tê liệt các hạch thần kinh có màu xanh tím, khi bị nấm ký sinh có màu xanh đỏ đậm trong khi đó màu của hạch thần kinh ở côn trùng khỏe có màu xanh lá cây) (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Hình 2.2 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng (Scholte E-J, 2004)

2.1.7 Triệu chứng của côn trùng nhiễm nấm

A: sự xâm nhập

B: lớp cutin

C: sợi nấm phát triển

D: sợi nấm hình thành vách ngăn

E: túi bào tử hình thành F: bào tử động

G: bào tử noãn

Nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của nấm có lợi lên các đối tượng côn trùng khác nhau đã đưa ra các kết quả mô tả triệu chứng khác nhau:

Làm biến đổi thành phần, hình dạng các nguyên tố enzyme và phản ứng huyết tương, làm giảm khả năng sinh sản, làm giảm trọng lượng, phá hủy sự hô hấp và phá hủy chức năng hệ thống nội tiết của côn trùng Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm

Beauveria bassiana lên độ mắn đẻ của bướm Torticidae hại táo, Kondria V.S (1966)

đã đưa ra kết luận rằng việc xử lý nhộng bởi nấm này làm giảm độ mắn đẻ của bướm

rất nhiều Trong các thí nghiệm nhiễm 5000, 15000, 45000 bào tử nấm Beauveria bassiana lên các con cái thì số lượng trứng trung bình còn lại không bị hư lần lượt là

59, 47 và 29 so với đối chứng là 71 trứng Zagae (1963) cho biết độ mắn đẻ của các

con cái bọ cánh cứng nhiễm Beauveria bassiana đã giảm tới 48 % so với đối chứng và

nếu kết hợp với DDT sẽ giảm tới 83 % (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang)

Phá hủy chức năng sinh lý của côn trùng Theo Ferron P (1967) thì sự nhiễm

nấm trắng và nấm xanh trên sâu Melolontha melolontha sẽ gây ra hiện tượng biến đổi

sinh hóa và giảm lực oxy hóa khử dẫn tới tình trạng hóa melanin trong huyết tương Ngoài ra, công trình nghiên cứu của Codaira (1967) cho thấy sự nhiễm nấm vào côn trùng còn làm thay đổi độ nhớt của huyết tương Một số các nhà nghiên cứu khác (Dieuzeide R 1926, Cordon T.C và Schwartz J.H 1962) còn thấy các tinh thể được tạo thành trong huyết tương khi côn trùng bị nhiễm nấm (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang)

Phá hủy quá trình biến thái và phát triển của côn trùng, cụ thể là các ấu trùng bị nhiễm nấm không lột xác được (Benz G., 1963) Theo Gosswald K (1938), nấm

Beauveria bassiana có thể nhiễm tất cả các pha phát triển của Bombyx mori Theo Prasertphon (1967), khi nấm B bassiana nhiễm vào ấu trùng tuổi 4 và 5 của bọ rùa

gây hại thì biểu hiện của ấu trùng bị phá hủy như sau: ấu trùng và rệp non không thể thoát ra khỏi tầng cutincun cứng và ở mức độ cao hơn thì côn trùng có dạng gù quái dị (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.1.8 Các chể phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana

Theo danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam (quyết định số 15/2004/QD – BNN ngày 14 tháng 4 năm 2004, các loại chế phẩm nấm

Beauveria bassiana được phép sử dụng gồm có:

Boverit 5,0 x 108 bào tử/g (Viện Bảo vệ Thực vật) trừ rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đay, sâu róm hại thông, sâu kèn hại tai tượng

Biovip 1,5 x 109 bào tử/g (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long) trừ rầy và bọ xít hại lúa

Beauverine (Công ty Thanh Sơn Hóa Nông) trừ sâu tơ hại bắp cải, sâu đục quả hại xoài

Muskardin (Công ty cổ phần thuốc trừ sâu Cần Thơ) trừ sâu đục thân hại lúa và ngô

Bermetent (Công ty hợp danh sinh học nông nghiệp Sinh Thành, Thành phố Hồ Chí Minh), trừ bọ cánh cứng hại dừa, sâu đục thân, rệp sáp, rầy đen hại mía

2.2 Tổng quan về ITS - rDNA 2.2.1 Giới thiệu về rDNA và vùng ITS

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa Hơn nữa, ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de Peer và cộng sự, 1996)

Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS) Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5 S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5 S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm Kích thước của mỗi vùng lập lại nằm trong khoảng 7,7 – 24 kbp (Guarro, 1999)

Hình 2.3 Sơ đồ nhóm gen rDNA nhân và rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989)

rDNA 18 S thường được quan tâm nghiên cứu; rDNA 5,8 S có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi song rRNA 5 S là thành phần không thể thiếu của nu - LSU-rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein (Szymanski và cộng sự, 2001); rDNA 25 S mặc dù ít có sự biến đổi song lại rất có ý nghĩa trong phân loại (Guarro, 1999)

Vùng ITS là vùng có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999)

Nu - SSU - rDNA tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền Nu - LSU - rDNA mặc dù có ít vùng

biến đổi nhưng lại rất có ý nghĩa trong nghiên cứu so sánh và phân loại ở nhiều cấp độ (Guarro, 1999)

rDNA ty thể

rDNA ty thể (mt - rDNA) cũng gồm có hai loại: mt - SSU - rDNA (19 S) và mt - LSU - rDNA Các mt - rDNA tiến hóa khá nhanh, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật cùng họ (Yamamoto và cộng sự, 1995)

Theo nghiên cứu của Santos và cộng sự (2002), ở các loài sinh vật có lạp thể, rDNA của lạp thể (cp - rDNA) cũng rất thay đổi về kích thước giữa các loài Nghiên cứu cũng kết luận rằng cp - LSU - rDNA (23 S) có sự thay đổi lớn về kích thước trong các loài sinh vật có lạp thể, cp - SSU - rDNA (16 S) thường ít được sử dụng trong nghiên cứu vì nó có đặc tính phái sinh

2.2.3 Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu rDNA

rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm Bằng cách tách gen, nhân dòng và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA Đặc biệt, phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA (White và cộng sự, 1989)

Năm 1984, Hassouna và cộng sự đã giải trình tự toàn bộ gen mã hóa 28 S rRNA trên chuột và phát hiện có gia tăng kích thước của gen này ở các sinh vật eukaryote bậc cao

Năm 1985, Hasegawa và cộng sự dựa trên trình tự rDNA nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của giới eukaryote

Field và cộng sự (1988) là những người đầu tiên đề nghị nghiên cứu rDNA để xác định mối quan hệ trong phát sinh loài của động vật đa bào Đặc biệt, rDNA nhân mã hóa rRNA 18 S được xem là đủ đa dạng có thể giải quyết nhiều vấn đề liên quan đến lịch sử phát sinh động vật đa bào (Halanych và Kenneth M., 1998)

Năm 1989, Gams và cộng sự sử dụng phương pháp PCR - RFLP thay vì đọc trình tự khi nghiên cứu rDNA

Năm 1990, Palmer và cộng sự đã so sánh trình tự SSU - rDNA của nhân, ty thể và lục lạp của thực vật hạt kín và thấy rằng trình tự rDNA 18 S của nhân là có nhiều

biến đổi nhất Cũng trong năm này, Devereux và cộng sự lần đầu tiên chú ý tới những tương đồng trong trình tự 16 S của vi khuẩn khi nghiên cứu phân loại

Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 (Bruns và cộng sự, 1991; ) So sánh những thay đổi của nu - SSU - rDNA (18 S), Bruns và cộng sự (1992) đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi

Năm 1994, Gutell đã tổng hợp những biến đổi trong cấu trúc bậc hai của rRNA 16 S từ các đại diện thuộc giới cổ vi khuẩn, vi khuẩn và eukaryote trên cả nhân, ty thể và lạp thể

Các nghiên cứu phát sinh loài thực vật dựa trên vùng ITS được tiến hành bởi Baldwin và cộng sự (1995)

Những năm gần đây, ngoài ý nghĩa phân loại, rDNA và vùng ITS rất được quan tâm nghiên cứu ở cấp độ phân tử Năm 1998, Chilton và cộng sự chứng minh cấu trúc ITS2 bậc hai có sự tương đồng giữa các họ phụ của lớp giun tròn Năm 1999, Joseph và cộng sự đã chứng minh vùng trung tâm trong cấu trúc ITS2 bậc 2 của động vật có xương sống và nấm men có nhiều điểm tương đồng Năm 2004, Colette và cộng sự nghiên cứu về vai trò của vùng ITS2 trong tiến trình tạo tiền rRNA ở nấm men

2.2.4 Sơ đồ vị trí và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu rDNA và vùng ITS 2.2.4.1 Vị trí và trình tự primer khuếch đại nu - rDNA

Vị trí primer

Hình 2.4 Sơ đồ vị trí primer trên nu - rDNA (White và cộng sự, 1989)

Các primer từ NS1 đến NS8 được thiết kế dựa trên vùng trình tự bảo tồn của

rDNA 18 S của S cerevisiae, Distyostelium discoideum và Stylonicha pustulata Các

primer NS1 và NS2 có thể sử dụng cho hầu hết các loại nấm, tảo đỏ và sinh vật đơn

bào, NS3 và NS4 dùng cho hầu hết các loại nấm, NS7 và NS8 chỉ khuếch đại được rDNA của thực vật và động vật có xương sống NS1 và NS8 thường dùng để đọc trình tự hầu hết các loại rDNA nhưng không đọc được trình tự vùng primer NS2 và NS3, NS4 và NS5, NS6 và NS7 có trình tự bổ sung, được thiết kế để đọc được trình tự cả vùng primer (White và cộng sự, 1989)

Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18 S, 5,8 S, 28 S ITS1 là trình tự bổ sung của NS8 Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng

lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N crassa, Schizosaccharomyces pombe và S cerevisiae, Vicia faba và chuột Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S prombe, S, cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4 Primer ITS5 có trình tự giống với rDNA 18 S của N crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 bp (White và

GTAGTCATATGCTTGTCTC GGCTGCTGGCACCAGACTTGC GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC CTTCCGTCAATTCCTTTAAG AACTTAAAGGAATTGACGGAAG GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC TCCGCAGGTTCACCTACGGA

56 68 68 56 57 65 65 65

ITS Primer

ITS1 ITS2 ITS3 ITS4 ITS5

TCCGTAGGTGAACCTGCGG

GCTGCGTTCTTCATCGATGC GCATCGATGAAGAACGCAGC TCCTCCGCTTATTGATATGC GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

65 62 62 58 63

Nu - LSU – Rdna

NL2F NL13 NL14

GTGAAATTGTTAAAAGGGAAAC CAAGCGAACTTTCATCATGCACG CTTTAGAACAAGGGTTGAAC

53 63 51

2.2.4.2 Vị trí và trình tự primer khuếch đại mt - rDNA

Vị trí primer

Các primer ML1, ML2, ML4, MS1, MS2 được sử dụng để khuếch đại các trình tự đặc trưng ở hầu hết các loại nấm Ở vài loài nấm, trình tự khuếch đại bởi 2 primer ML6 và ML5 chứa một intron khá lớn nên việc khuếch đại thường không hiệu quả Các đột biến thay đổi kích thước như vậy thường rất phổ biến ở các gen ty thể, do đó kích thước vùng khuếch đại thay đổi rất đáng kể (White và cộng sự, 1989)

Hình 2.5 Vị trí primer trên rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989)

CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG GCGGATTATCGAATTAAATAAC AACCACCATTCATCGTTGAC

65 63 63

Mt – LSU – rDNA

ML2 ML3 ML4 ML5 ML6 ML7 ML8

TATGTTTCGTAGAAAACCAGC

GCTGGTTTTCTACGAAACATATTTAAG GAGGATAATTTGCCGAGTTCC

CTCGGCAAATTATCCTCATAAG CAGTAGAAGCTGCATAGGGTC GACCCTATGCAGCTTCTACTG TTATCCCTAGCGTAACTTTTATC

63 67 68 66 65 63 57

2.2.5 Ý nghĩa của ITS - rDNA trong phân loại nấm

Nghiên cứu so sánh trình tự rDNA (ribosomal RNA gene) đóng vai trò quan trọng trong phân loại và xác định quan hệ di truyền (Woese and Olsen (1986), Zimmer và cộng sự (1988), Medlin và cộng sự (1989)) và đặc biệt có ý nghĩa trong ngành phân loại nấm Từ trước đến nay nấm thường được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả phân loại thường không chính xác; các so sánh dựa trên trình tự nu được xem là cơ sở chính xác nhất, rất có ý nghĩa trong phân loại nấm (Guarro, 1999)

Nhờ những phân tích trên nu - SSU - rDNA có thể chia giới nấm thành 4 lớp Acrasiomycota, Myxomycota, Oomycota, và Fungi (Bruns và cộng sự, 1991)

Cũng dựa trên cơ sở so sánh SSU - rDNA, người ta cũng đã chứng minh

Schizosaccharomycetales có nguồn gốc từ lớp Myxomycota (Guarro, 1999)

Các phân tích trên mt - LSU - rDNA (24 S) cho thấy P carinii thuộc lớp nấm

men Basidiomycete trong khi đó người ta thường lầm tưởng loài này thuộc nhóm động vật nguyên sinh (Wakefield, 1992)

Trên cơ sở so sánh trình tự LSU - rDNA và trình tự SSU - rDNA, Leclerc

(1994) chứng minh S apiospermumand S prolificans có quan hệ về di truyền

Muthumeenakshivà cộng sự (1994) đã chứng minh có sự đa hình xảy ra khi

nghiên cứu những thay đổi trong vùng ITS của các dòng Trichoderma harzianum

Dựa trên trình tự rDNA 18 S, 5,8 S và vùng ITS, Berbee và cộng sự (1995) đã

chứng minh Penicillium, Aspergillus, và Paecilomyces thuộc lớp Trichocomaceae

2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR 2.3.1 Khái niệm

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được mô tả bởi Mulis và cộng sự

(1985) là kỹ thuật cho phép làm tăng bội đáng kể các đoạn DNA cần được nghiên cứu

Khác với sự tăng bội DNA qua sự tạo dòng nhờ vi khuẩn, PCR được thực hiện in vitro

theo con đường enzyme

2.3.2 Nguyên tắc phản ứng PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt Primer là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002)

Hiện tượng trên chính là cơ sở của phương pháp PCR Nếu được cung cấp hai primer (forward primer và reverse primer) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của một trình tự DNA, phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai primer này (PCR thường được dùng để nhân bản các trình tự DNA có chiều dài khoảng 200-2000 bp) (Bùi Trang Việt, 2002)

2.3.3 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng 2.3.3.1 Primer và nhiệt độ lai

Primer là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới tính đặc hiệu và tính hiệu quả của phản ứng khuếch đại Trình tự của primer thường được chọn sao cho không có có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung trong mỗi primer và Tm của 2 primer phải không quá cách biệt nhau Ngoài ra, thành phần nucleotide của primer phải cân bằng tránh lập lại nhiều lần các cặp GC Primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự trên gen Trình tự nằm giữa hai primer không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.3.2 DNA mẫu

Kết quả phản ứng PCR phụ thuộc rất lớn vào độ tinh sạch cũng như lượng DNA mẫu Tuy nhiên, trong kỹ thuật chẩn đoán nhanh bằng PCR, DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào nhưng kết quả vẫn tốt Lượng DNA mẫu thường được sử dụng

là 100 ng Lượng mẫu phù hợp có tác dụng hạn chế sự khuếch đại tạo các sản phẩm không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.3.3 Enzyme DNA polymerase

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I Đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác ph ức tạp và hiệu quả thấp Phương pháp PCR trở nên thuận lợi hơn với việc phát hiện ra enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được

tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus hiện diện trong suối nước nóng, viết tắt là Taq polymerase, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA và có khả năng xúc tác

tiổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng Một enzyme có nhiều chức năng chuyên

biệt và hoàn thiện hơn là Tth polymerase được tách từ Thermus thermophilus, có khả

năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt của RNA khuôn và Mn2+

(khuếch đại bản mẫu RNA thông qua sự hình thành cDNA), ngược lại khi khuôn là DNA và có ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA (Hồ

Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.3.4 dNTP

Mỗi loại dNTP thường được sử dụng với nồng độ từ 20 – 200 M Nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến việc tạo ra các sản phẩm không mong muốn Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.3.5 Mg2+ và nồng độ Mg2+

Mg2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt Nồng độ Mg2+ ảnh hưởng mạnh tới quá trình chạy PCR Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động

của Taq polymerase bị ức chế Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhưng lại hạn chế sự biến tình hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa primer và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu Nồng độ tối ưu Mg2+

phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.3.4 Những ứng dụng quan trọng của phản ứng PCR

Kể từ khi ra đời, phương pháp PCR ảnh hưởng sâu sắc tới các nghiên cứu về sinh học phân tử Các ứng dụng tiêu biểu của PCR bao gồm: sản xuất mẫu dò dùng trong phương pháp lai phân tử, xác định trình tự acid nucleic, tạo đột biến điểm định hướng Ngoài ra, PCR còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như:

Trong y học, PCR được dùng trong chẩn đoán nhanh các bệnh có nguyên nhân là

các vi sinh vật mà không có khả năng mọc trên môi trường nuôi cấy hoặc chậm phát

triển như virus HIV, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia thông qua việc khuếch

đại va phát hiện đoạn DNA đặc hiệu

Trong lĩnh vực pháp y, PCR được ứng dụng để thiết lập dấu vân tay DNA

Trong ngành khảo cổ học, PCR giúp khuếch đại những đoạn DNA của những sinh

vật đã tuyệt chủng như khủng long, voi răng mấu và những hóa thạch khác

Gần đây nhất là sự đóng góp thiết thực của kỹ thuật PCR trong việc giải mã bộ gen

người

2.4 Nguyên tắc đọc trình tự

2.4.1 Nguyên tắc phương pháp đọc chuỗi mã Sanger

Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger dựa trên sự tổng hợp sợi DNA bổ sung của sợi cần được xác định trình tự Trong các phản ứng tổng hợp sợi bổ sung, dideoxynucleotide được bổ sung vào thành phần phản ứng Dideoxynucleotide (ddNTP) là các deoxynuckeotide đã được khử nhóm OH ở 3’, khi dideoxynucleotide gia nhập vào chuỗi, sự kéo dài chuỗi sẽ ngưng lại (Khuất Bửu Thanh, 2003)

2.4.2 Nguyên tắc giải trình tự gen bằng máy sequencer

Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật Cả hai loại primer xuôi và ngược đều được sử dụng để đọc cả hai mạch đơn DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Giải trình tự theo phương pháp tự động không phải dùng chất phóng xạ mà sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát hiện cùng một lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm Beauveria bassiana

2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Ở nước ta kể từ năm 1990 đến nay, các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana

chủ yếu là các nghiên cứu về công nghệ sản xuất các chế phẩm từ nấm và hiệu suất phòng trừ côn trùng của chúng

Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nước ta khá phong phú Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương

pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 108

bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất theo phương pháp này là 10 ngày, chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45o

C trong 8 giờ và có thể được bảo quản trong thời gian 6 tháng Khi thử nghiệm phương pháp lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trường có pepton, cao nấm

men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 109 bào tử/gam Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lưng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 108

bào tử/ml Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm

Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy Sử dụng phương pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn được các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao Từ

các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập được 9 chủng nấm Beauveria bassiana

từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia

Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trưởng thành và sâu xanh da láng nhưng ở các mức độ

khác nhau Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng

khoai lang ở Thủ Đức làm giảm 10 % số củ khoai lang bị hà (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế phẩm

Bemetent (được phối từ 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ cánh cứng

hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ cả thành trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập từ

New Zealand bằng hai phương pháp RAPD và RFLP Kết quả phân tích RAPD sử dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập được thành 4 nhóm có kiểu di

truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B bassiana/B brongniartii, nhóm B bassiana, nhóm B brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác Sử dụng

enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền

giữa giống B bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B bassiana/B brongniartii

Hegedus và cộng sự (1998) đã giải toàn bộ vùng gen mã hóa SSU-RNA của ti

thể nấm Beauveria bassiana Khi so sánh trình tự này với các trình tự ở vùng tương tự

của nấm sợi thì thấy có sự khác biệt lớn Các kết quả từ việc phân tích cây phát sinh

loài cho thấy nấm Beauveria bassiana có mối liên hệ chặt chẽ với nấm bột hơn là nấm túi, kết quả này không giống với các kết quả so sánh trước đó tiến hành ở nấm sợi

Theo Wang C – Z., Li Z – Z và Butt T M (2002), các dòng đơn bào tử của

nấm Beauveria bassiana là Bb 123 (phân lập từ Ammophila sp.) và Bb 151 (phân lập từ Brachyderes incanus) có thể được phân biệt dựa vào marker phân tử là một đoạn

intron trong vùng 11 của 28 S rDNA Khi sử dụng hai primer I21 và I22 để khuếch đại vùng 11 này thì sản phẩm khuếch đại của hai dòng này có kích thước không bằng nhau Kết quả đọc trình tự cho thấy một trong hai đoạn khuếch đại có thêm một vùng intron 405 bp, đoạn intron này cũng có thể được phân biệt bằng phương pháp RAPD

với các primer : OPA - 03, OPA - 08, OPA - 11, OPA - 13, OPB - 07, OPE - 01, OPE

- 04 Thử nghiệm chủng đồng thời hai dòng nấm này trên Galleria mellonella cũng

như trên môi trường nhân tạo sau đó phân tích kết quả bằng RAPD cho thấy luôn luôn có một dòng chiếm ưu thế hơn dòng còn lại Hơn nữa, sự nhiễm đồng thời hai dòng lên cùng ký chủ dẫn đến việc tạo ra các thể dị nhân, tuy nhiên các thể dị nhân này thường không ổn định và có khuynh hướng trở lại dạng bình thường giống dòng mẹ sau nhiều lần cấy chuyền Các phân tích ở mức độ phân cũng cho thấy không có sự tái tổ hợp ở các dòng phân tách từ ký chủ thí nghiệm nhiễm đồng thời hai dòng nấm trên

Talaei - hassanloui và cộng sự (2002) đã so sánh trình tự đoạn gen mã hóa RNA ribosom 5.8 S, vùng ITS và vùng gen mã hóa các yếu tố kéo dài trong quá trình phiên

mã của 10 nguồn Beauveria bassiana khác nhau Kết quả so sánh trình tự của vùng

ITS1 - 5.8 S - ITS2 gồm 595 nucleotide của 10 nguồn nấm trên cho thấy chỉ có 0,16 - 1,77 % trình tự là có sự biến đổi Sử dụng phần mềm UPGMA xác định được 10 nguồn trên thuộc 3 nhóm khác nhau, các nhóm này có liên quan nguồn gốc nơi nấm

được phân lập Ngoài ra, kết quả so sánh trình tự gene tef-1a mã hóa cho protein chỉ ra

rằng có 1,8 % trình tự có sự thay đổi và dựa trên trình tự gen này cũng có thể chia 10 nguồn trên thành 3 nhóm kiểu gen khác nhau, các nhóm kiểu gen này có liên quan tới vùng phân bố của các nguồn nấm thu thập được Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cũng

cho thấy không có mối liên hệ ý nghĩa giữa các kiểu gen của nấm Beauveria bassiana với đặc tính gây bệnh trên các côn trùng như Plutella xylostella, Leptinotarsa decemineata, côn trùng cánh cứng hại khoai tây

Shih HL và cộng sự (2002) đã giải trình tự hoàn toàn gene mã hóa 5.8 S rDNA

và vùng ITS lân cận 2 dòng Beauveria bassiana Sự giống trên toàn vùng trình tự giải

được của hai dòng này là 96 % Sự giống nhau ở vùng ITS1 là 96 %, vùng ITS2 là 100

% Sự tương đồng của hai vùng trình tự gen mã hóa 5.8 S rRNA là 98 %

Theo Eiji và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vùng intron nhóm 1 trong trình tự

rDNA mã hóa tiểu đơn vị ribosom (SSU rDNA) của nấm Beauveria bassiana và chỉ ra rằng tổ tiên của Cordicepts prolifera và C kanzashiana có được các vùng intron trong

trình tự rDNA là do nhận được từ các nấm khác Khi tiến hành đọc trình tự của SSU

rDNA cua nấm Beauveria bassiana và các nấm có liên quan thì thấy có sự đa hình xảy ra giống như sự đa hình giữa các dòng Beauveria bassiana Sự đa hình này xảy ra do

có sự chèn các intron nhóm 1 vào trình tự

Theo Martin Kendall J and Rygiewicz Paul T (2005), các vùng ITS của rDNA nấm có sự thay đổi lớn trong trình tự, trên cơ sở các khác biệt trong trình tự này có thể phân biệt các loài nấm nhờ phản ứng PCR Hai primer ITS1 và ITS2 thường được sử dụng để khuếch đại vùng gen 5,8 S tạo các đoạn khuếch đại kích thước không giống nhau giữa các loài

Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được tiến hành từ 28/2/2005 - 30/7/2005 tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật - Khoa Nông học và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật - Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Kiên Giang

Cnaphalocrosis medinalis

G (Pyralidae-Lepidoptera)

SCL-LA SCL-KG

1 2 Bọ xít đen Quận 9 Scotinophora spp

Sâu xanh Bình Dương Spodoptera litura Fab

(Noctuidae-Lepidoptera)

SX-BD 1

Rầy nâu Long An Nilaparvata lugens RN-LA 1 Nhiều chủng nấm khác

Ghi chú:

Nguồn tham khảo (1): Lê Thị Kim Thoa, 2004

Nguồn tham khảo (2): Mới thu thập và phân lập

3.2 Phân lập và nhân sinh khối các nguồn Beauveria bassiana

3.2.1 Hóa chất và dụng cụ 3.2.1.1 Hóa chất

Môi trường sử dụng: Agar, PGA, CZA

Bảng 3.2 Thành phần môi trường phân lập và nhân nấm

Môi trường agar (1 lít) Môi trường PGA (1lít) Môi trường CZA (0,5 lít)

Agar: 15 g

Nước cất một lần: 1 lít

Khoai tây: 200 g Đường glucose: 17 g Agar: 15 g

Nước cất một lần

Glucose: 15 g Yeast extract: 2,5 g NaNO3: 1,5 g K2HPO4: 0,5 g

MgSO4.7H2O: 0,25 g Nước cất 2 lần: 500 ml pH: 6 - 6,5

Cách nấu môi trường PGA: gọt vỏ khoai tây, rửa sạch, cắt nhỏ, cho vào nước cất đang sôi, nấu khoảng 25 phút, lọc bỏ khoai tây và thêm nước cất cho đủ 1 lít, đun sôi trở lại, cho agar và agarose vào, tiếp tục đun sôi cho đến khi agarose và agar tan hoàn toàn, rót môi trường vào bình tam giác đem hấp vô trùng, đổ đĩa petri

Nấm từ mẫu côn trùng chết được phân lập bằng môi trường PGA và agar (Nguyễn Thị Bích Lập, 2005)

Đặt côn trùng nhiễm nấm trên một lame sạch và chuyển vào một đĩa petri có sẵn lớp giấy ẩm, để ở nhiệt độ phòng trong 3 - 7 ngày Sau khi nấm phát triển mạnh và tạo thành một lớp bột trắng phủ đầy trên mình côn trùng, dùng que cấy chấm bào tử cấy 3 điểm vào môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày Quan sát cách mọc bào tử của nấm dưới kính hiển vi, khi đã khẳng định nấm được phân lập là

Beauveria bassiana thì tiến hành tách đơn bào tử

Đặt các lame sạch vào đĩa petri, hút 1 ml môi trường agar cho vào lame và trang thành một lớp mỏng Dùng nước cất 2 lần vô trùng để pha loãng bào tử nấm Hút 10 ml nước cho trực tiếp vào đĩa nấm, quan sát mật độ bào tử dưới kính hiển vi và pha loãng tới mật độ thích hợp thuận lợi cho quá trình tách đơn bào tử

Hút 0,1 ml dịch bào tử chuyển lên lame agar đã chuẩn bị, dùng que cấy tam giác trang đều cho đến khi bề mặt agar khô hoàn toàn Sau 12 giờ, quan sát lame agar dưới kính hiển vi, tìm vị trí bào tử mọc thưa, cắt phần agar chứa từng bào tử đơn chuyển sang môi trường PGA

3.2.3 Phương pháp nhân sinh khối

Nấm sau khi phân lập được tiến hành nhân sinh khối trong môi trường CZA (Rakotonirainy, 1991)

Cách nấu môi trường CZA: Đong 0,5 lít nước cất 2 lần cho vào becher 1 lít, đặt lên máy khuấy từ ở 100oC Cho yeast extract vào khuấy tan, tiếp tục cho các muối NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O khuấy cho đến khi các muối này tan hoàn toàn thì ngưng, để nguội và đo pH, rót 80 ml môi trường vào mỗi bình tam giác 250 ml, hấp vô trùng ở 121oC trong vòng 30 phút

Các dòng nấm sau khi tách đơn bào tử đem nuôi cấy trên môi trường PGA trong đĩa petri, sau khi nấm mọc được 15 ngày tuổi dùng que cấy mốc nhúng ướt hớt ngang bề mặt khuẩn lạc để thu bào tử chuyển sang môi trường lỏng CZA, lắc 120 vòng/phút ở 27oC trong 1 tuần, thu sợi nấm, phơi khô, gói vào giấy bạc và bảo quản ở -70oC

3.3 Khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao

3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm dùng trong phản ứng PCR 3.3.1.1 Hóa chất

Master mix 2X (Sapphire)

Các primer: 2 primer sử dụng trong nghiên cứu là ITS 4 và ITS 5 (Biorad), được

thiết kế để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana

3.3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm Cối, chày

Cân điện tử

Ependorf các loại: 0,2 l, 0,3 l, 1,5 l Micropipet và các loại đầu típ

Waterbath

Máy Thermo cycle

DNA - photography equipment UV transilluminator

Máy điện di Máy li tâm Máy vortex Tủ cấy

3.3.2 Chuẩn bị khuôn DNA

DNA từ các nguồn nấm đã nhân sinh khối được ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996

Nghiền phần sợi nấm thu được trong dung dịch nitơ lỏng cho đến khi sợi nấm

chuyển sang dạng bột trắng, mịn

Chuyển bột nấm vào ống eppendoft 1,5 ml

Thêm 600 l lysis buffer, lắc mạnh tay hoặc vortex Ủ ở 650C trong 1 giờ

Thêm 600 l hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), lắc

nhẹ, ly tâm 14000 vòng/phút ở 280C trong vòng 20 phút Thu phần dịch nổi (nếu dịch nổi chưa trong có thể ly tâm lại với cùng tốc độ thêm một thời gian ngắn)

Thêm 0,03 V sodium acetate và 0,5 V isopropanol, đảo nhẹ, ly tâm 14000

vòng/phút ở 280C trong 5 phút, thu phần tủa trắng

Rửa sạch DNA ba lần bằng ethanol 70 %, mỗi lần dùng 150 l

Phơi khô DNA cho đến khi phần tủa chuyển sang màu trắng trong, hòa tan trong 50

l dung dịch TE 1X, ủ ở 550C trong bồn ủ nhiệt cho đến khi phần tủa trắng tan hoàn toàn trong dung dịch TE 1X giữ ở 40C hay – 20 0C cho tới khi sử dụng

3.3.3 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR và chu kỳ phản ứng PCR

Thành phần hóa chất

Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR

Thành phần Liều lƣợng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối

+ Master mix 10 2X 1X dNTP 0,4 mM 0,2 mM MgCl2 3 mM 1,5 mM Tag DNA polymerase 1 U 1U +Primer 1 1 100 pmol/ l +Primer 2 1 100 pmol/ l

+Khuôn DNA 1 100 ng/ l 5 ng/ l +Nước cất 7

Master mix Primer ITS4 Primer ITS5 DNA khuôn Nước cất

Chu kỳ nhiệt: 940C/3 phút 940C/1 phút 560C/30 giây 720C/1 phút 720C/7 phút

30 chu kỳ

Hình 3.1 Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer ITS4 và ITS5 3.3.6 Bố trí thí nghiệm trong phản ứng PCR

Mục tiêu: Xác định nồng độ primer tối ưu cho master mix để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2

Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức:

Nghiệm thức 1: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 5 pmol/ l Thí nghiệm

được bố trí với 7 nguồn nấm: PUL-Q2-4, SCL-LA-8, BH-BD-11, SCL-LA-6, 10, SCL-LA-5, BH-BD-13 và một đối chứng dương là nguồn PUL2 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS4 và ITS5

Nghiệm thức 2: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 3 pmol/ l Thí nghiệm

được bố trí với 7 nguồn nấm: DP-BD-1, SCL-KG-37, BH-BD-12, SN-PT-9, 6, BXD-Q9-8, RM-TD-11 Đối chứng dương là nguồn PUL-BC-3 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS3 và ITS4, đối

PUL-BC-chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng Ngoài ra, nấm Corynespora cũng được

bố trí chạy chung quy trình PCR để so sánh kích thước đoạn khuếch đại của nấm này

so với các nguồn Beauveria bassiana thí nghiệm

Nghiệm thức 3: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 0,5 pmol/ l Bố trí thí

nghiệm lần thứ nhất với 6 nguồn: SCL-KG-37, RM-TD-11, SCL-LA-5, SX-DL-9, PUL-BC-4, DTB-5, đối chứng dương là PUL-BC-3, đối chứng âm là nước cất 2 lần

khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được tiến hành với nấm Paecilomyces để thử khả

năng khuếch đại của 2 primer ITS4 và ITS5 trên nấm này

Sau khi kiểm tra kết quả và xác định primer đã đạt nồng độ tối ưu, tiếp tục chạy PCR với các nguồn còn lại với nồng độ primer trên

Chạy PCR lần thứ 2 theo nghiệm thức trên với 7 nguồn: PUL-Q2-4, 6, BH-BD-11, SCL-LA-8, BH-BD-13, RN-LA-10, DTB-9 Đối chứng dương là PUL2, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với 2

PUL-BC-nấm Metarhizum và Corynespora

Chạy PCR lần thứ 3 theo nghiệm thức trên với 6 nguồn: SCL-LA-6, CC-TD-4, SCL-KG-3, BXD-Q9-8, SN-PT-9, BH-BD-12 Đối chứng dương là BXD-Q9-9, đối chứng âm là nước cất hai lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với nấm

Rhizoctonia

3.4 Đọc trình tự sản phẩm PCR 3.4.1 Chuẩn bị khuôn DNA

3.4.1.1 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình của GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham) Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dư thừa cũng như các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện di không thể phát hiện được Quy trình tinh sạch gồm các bước như sau:

Điện di 15 l sản phẩm PCR trên gel tan ở nhiệt độ thấp (low melting agarose) Cân một ependorf 1,5 ml và ghi nhớ khối lượng

Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel (thao

tác này được tiến hành dưới tia UV trong phòng tối), cắt càng xát band chứa DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã được cân từ trước, dùng đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn

Cân ống ependorf chứa sản phẩm PCR, xác định khối lượng của miếng gel

Thêm 10 l capture buffer cho mỗi 10 g gel (khả năng tối đa của cột dùng cho tinh

sạch là 300 l buffer và 300 mg gel)

Vortex nhẹ và ủ ở 600C cho đến khi agarose tan hoàn toàn, thường khoảng 10 - 15 phút

Trong quá trình ủ, cho một GFX column vào collection tube

Sau khi agarose hoàn toàn tan, li tâm 400 vòng/phút trong 10 giây để tập trung mẫu

xuống phần đáy của ependorf

Chuyển toàn bộ mẫu vào GFX column (chú ý thao tác nhẹ bằng cách cho mẫu chảy

nhẹ theo thành column) Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút

Li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây

Lấy GFX column ra, bỏ phần dịch lỏng trong collection tube, cho GFX column vào

collection tube trở lại

Thêm 500 l wash buffer vào (thêm từ từ theo thành column), li tâm 10000

vòng/phút trong vòng 30 giây

Lấy GFX column ra khỏi collection tube, chuyển vào một eppendoft 1,5 ml đã

được làm lạnh

Thêm 15 l elution buffer trực tiếp vào giữa màng lọc trong GFX column Để ở

200-500 bp 500-1000 bp 1000-2000 bp

1-3 ng 3-10 ng 5-20 ng 10-40 ng

3.4.2 Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)

3.4.2.1 Thành phần hóa chất

Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự