Xác định trình tự vùng ITS-rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại sử dụng phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR

Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu rDNA

Đặc biệt, phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA (White và cộng sự, 1989). Năm 1984, Hassouna và cộng sự đã giải trình tự toàn bộ gen mã hóa 28 S rRNA trên chuột và phát hiện có gia tăng kích thước của gen này ở các sinh vật eukaryote bậc cao. Đặc biệt, rDNA nhân mã hóa rRNA 18 S được xem là đủ đa dạng có thể giải quyết nhiều vấn đề liên quan đến lịch sử phát sinh động vật đa bào (Halanych và Kenneth M., 1998).

Năm 1990, Palmer và cộng sự đã so sánh trình tự SSU - rDNA của nhân, ty thể và lục lạp của thực vật hạt kín và thấy rằng trình tự rDNA 18 S của nhân là có nhiều. Năm 1994, Gutell đã tổng hợp những biến đổi trong cấu trúc bậc hai của rRNA 16 S từ các đại diện thuộc giới cổ vi khuẩn, vi khuẩn và eukaryote trên cả nhân, ty thể và lạp thể. Năm 1999, Joseph và cộng sự đã chứng minh vùng trung tâm trong cấu trúc ITS2 bậc 2 của động vật có xương sống và nấm men có nhiều điểm tương đồng.

Ý nghĩa của ITS - rDNA trong phân loại nấm

(1985) là kỹ thuật cho phép làm tăng bội đáng kể các đoạn DNA cần được nghiên cứu. Khác với sự tăng bội DNA qua sự tạo dòng nhờ vi khuẩn, PCR được thực hiện in vitro theo con đường enzyme.

Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng 1. Primer và nhiệt độ lai

Phương pháp PCR trở nên thuận lợi hơn với việc phát hiện ra enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus hiện diện trong suối nước nóng, viết tắt là Taq polymerase, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA và có khả năng xúc tác tiổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Một enzyme có nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn là Tth polymerase được tách từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt của RNA khuôn và Mn2+. (khuếch đại bản mẫu RNA thông qua sự hình thành cDNA), ngược lại khi khuôn là DNA và có ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).

Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhưng lại hạn chế sự biến tình hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng.

Nguyên tắc đọc trình tự

Nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm Beauveria bassiana 1. Nghiên cứu trong nước

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu 1. Thời gian và địa điểm
• Phân lập và nhân sinh khối các nguồn Beauveria bassiana 1. Hóa chất và dụng cụ
• Đọc trình tự sản phẩm PCR 1. Chuẩn bị khuôn DNA

Cách nấu môi trường PGA: gọt vỏ khoai tây, rửa sạch, cắt nhỏ, cho vào nước cất đang sôi, nấu khoảng 25 phút, lọc bỏ khoai tây và thêm nước cất cho đủ 1 lít, đun sôi trở lại, cho agar và agarose vào, tiếp tục đun sôi cho đến khi agarose và agar tan hoàn toàn, rót môi trường vào bình tam giác đem hấp vô trùng, đổ đĩa petri. Đặt côn trùng nhiễm nấm trên một lame sạch và chuyển vào một đĩa petri có sẵn lớp giấy ẩm, để ở nhiệt độ phòng trong 3 - 7 ngày. Sau khi nấm phát triển mạnh và tạo thành một lớp bột trắng phủ đầy trên mình côn trùng, dùng que cấy chấm bào tử cấy 3 điểm vào môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày.

Quan sát cách mọc bào tử của nấm dưới kính hiển vi, khi đã khẳng định nấm được phân lập là Beauveria bassiana thì tiến hành tách đơn bào tử. Các dòng nấm sau khi tách đơn bào tử đem nuôi cấy trên môi trường PGA trong đĩa petri, sau khi nấm mọc được 15 ngày tuổi dùng que cấy mốc nhúng ướt hớt ngang bề mặt khuẩn lạc để thu bào tử chuyển sang môi trường lỏng CZA, lắc 120 vòng/phút ở 27oC trong 1 tuần, thu sợi nấm, phơi khô, gói vào giấy bạc và bảo quản ở -70oC. Các primer: 2 primer sử dụng trong nghiên cứu là ITS 4 và ITS 5 (Biorad), được thiết kế để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana.

Đối chứng dương là nguồn PUL-BC-3 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS3 và ITS4, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng. Ngoài ra, nấm Corynespora cũng được bố trí chạy chung quy trình PCR để so sánh kích thước đoạn khuếch đại của nấm này so với các nguồn Beauveria bassiana thí nghiệm. Đối chứng dương là PUL2, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với 2 nấm Metarhizum và Corynespora.

Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dư thừa cũng như các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện di không thể phát hiện được. Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel (thao tác này được tiến hành dưới tia UV trong phòng tối), cắt càng xát band chứa DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã được cân từ trước, dùng đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn. DNA sau khi tinh sạch được định lượng bằng cách chạy điện di sản phẩm tinh sạch cùng với DNA mass và pha loãng tới nồng độ cần thiết (John P.

So sánh trình tự PUL-Q2-4 với trình tự tương ứng của vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 trên 6 nguồn nấm Beauveria bassiana ký sinh trên nhiều đối tượng ký chủ chọn ngẫu nhiên trong cơ sở dữ liệu của NCBI.