Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Thơm NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CĨ HOẠT TÍNH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ LUẬN VĂN THẠC SĨ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Thơm NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CĨ HOẠT TÍNH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: PGS TS Đỗ Thị Huyền Hƣớng dẫn 2: ThS Trần Băng Diệp Hà Nội, 2020 i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần đƣợc công bố hội nghị khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Thơm ii Lời cảm ơn Với tất lịng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới hai ngƣời thầy: PGS TS Đỗ Thị Huyền, Trƣởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cho kiến thức q báu, chia sẻ kinh nghiệm giúp đỡ tơi q trình hồn thiện luận văn; ThS Trần Băng Diệp, Trƣởng phịng Cơng nghệ Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện lƣợng Nguyên tử Việt Nam - ngƣời thầy bên cạnh tôi, truyền cho cảm hứng nghiên cứu khoa học, cho ý tƣởng định hƣớng đắn, bảo kỹ cần thiết ln tận tình, gần gũi, tạo điều kiện tốt suốt trình tơi thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới anh chị Phòng Công nghệ Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện lƣợng Nguyên tử Việt Nam giúp đỡ nhiệt tình đóng góp ý kiến q báu nhƣ tận tình dạy, tạo điều kiện giúp đỡ thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện lƣợng Nguyên tử Việt Nam tạo điều kiện cho tơi có thời gian để học tập thời gian công tác Viện Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học Công nghệ với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu suốt thời gian thực luận văn Tơi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Đề tài KHCN cấp bộ, mã số ĐTCB 01/18/TTCX: “Ứng dụng xạ gamma gây đột biến Trichoderma để tạo chế phẩm phân giải nhanh rơm rạ đồng ruộng” ThS Trần Băng Diệp làm chủ nhiệm Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ngƣời thân gia đình ngƣời bạn thân thiết bên cạnh, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tác giả Nguyễn Thị Thơm iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng việt ADN Axit deoxyribonucleic ADN ARN Axit ribonucleic ARN CBD Cellulose binding domain Vùng liên kết cellulose CMC Carboxyl methyl cellulose Cơ chất CMC DNS Axit 3,5- dinitrosalicylic Thuốc thử DNS FPase Filter paper activity Hoạt độ thủy phân giấy lọc Gy Gray Gy HC Hydrolysis capacity Khả thủy phân kDa Kilo Dalton kDa LET Linear Energy Transfer Hệ số truyền lƣợng tuyến tính MT Mơi trƣờng Mơi trƣờng PDA Potato destrose agar Môi trƣờng khoai tây TB Tế bào Tế bào VSV Vi sinh vật Vi sinh vật iv Danh mục bảng Bảng 1.1 Giá trị LET MT nƣớc (nguồn: ICRU 1995) 17 Bảng 2.1 Các chủng Trichoderma có khả sinh tổng hợp cellulase 21 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng Trichoderma sau ngày nuôi cấy MT PDA 28 Bảng 3.2 Khả sinh cellulase chủng Trichoderma 32 Bảng 3.3 Giá trị HC chủng T koningiopsis VTCC 31435 sau nuôi cấy 28oC 24 ủ 37oC ngày 34 Bảng 3.4 Khả thủy phân cellulose khuẩn lạc T koningiopsis xử lý chiếu xạ liều khác 40 Bảng 3.5 Giá trị HC 05 khuẩn lạc T koningiopsis có khả sinh cellulase cao tạo đƣợc chiếu xạ 43 Bảng 3.6 Hoạt độ CMCase chủng sau chiếu xạ VTCC I-1 VTCC I-3 sau lần cấy truyền 50 v Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian loại cellulase Hình 1.2 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose phức hệ cellulosome Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc Trichoderma mơi trƣờng PDA 11 Hình 1.4 Bào tử Trichoderma 13 Hình 1.5 Tác dụng trực tiếp gián tiếp xạ ion hóa tới ADN 16 Hình 3.1 Vịng phân giải CMC số chủng Trichoderma sau nuôi cấy 28oC 24 ủ 37oC ngày 34 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng T koningiopsis VTCC 31435 MT PDA sau ngày nuôi cấy 35 Hình 3.3 Hình thái quan sinh sản chủng T koningiopsis VTCC 31435 36 Hình 3.4 Mối tƣơng quan số lƣợng bào tử T koningiopsis VTCC 31435 sống sót dịch bào tử liều xạ 37 Hình 3.5 Mối tƣơng quan số lƣợng lƣợng bào tử T koningiopsis VTCC 31435 sống sót liều xạ 38 Hình 3.6 Sàng lọc khuẩn lạc sinh cellulase cao từ dung dịch bào tử T koningiopsis VTCC 31435 chiếu xạ liều 700 1500 Gy 42 Hình 3.7 Vịng phân giải CMC số khuẩn lạc T koningiopsis sau nuôi cấy 28oC 24 ủ 37oC ngày 43 Hình 3.8 Hoạt độ CMCase FPase 05 khuẩn lạc T koningiopsis có khả sinh cellulase cao tạo đƣợc chiếu xạ 44 Hình 3.9 Chủng T koningiopsis 02 thể đột biến nuôi cấy MT PDA 28oC 48 vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 CELLULASE 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại .4 1.1.3 Cơ chế tác động cellulase 1.1.4 Nguồn thu nhận cellulase 1.1.4.1 Vi khuẩn 1.1.4.2 Xạ khuẩn 1.1.4.3 Nấm 1.1.5 Các ứng dụng nhóm cellulase 1.1.5.1 Ứng dụng công nghiệp 1.1.5.2 Ứng dụng xử lí mơi trường 1.1.5.3 Ứng dụng sản xuất phân bón .10 1.1.5.4 Ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học .10 1.1.5.5 Ứng dụng kĩ thuật di truyền 10 1.2 SƠ LƢỢC VỀ NẤM Trichoderma VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE CỦA Trichoderma 10 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Trichoderma .10 1.2.2 Hình thức sinh sản Trichoderma 12 1.2.3 Khả thủy phân cellulose Trichoderma 13 1.3 BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VSV - TĂNG CƢỜNG KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA Trichoderma 14 1.3.1 Đột biến ngẫu nhiên tăng hoạt độ cellulase chi nấm Trichoderma .14 1.3.1 Bức xạ gamma 15 1.3.2 Ứng dụng xạ ion hóa gây tạo đột biến VSV 17 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT TƢ, THIẾT BỊ 21 2.1.1 Nguyên vật liệu 21 vii 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Thiết bị 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Bảo quản giữ giống .23 2.2.2 Xử lý chiếu xạ 23 2.2.2.1 Thu dung dịch bào tử nấm 23 2.2.2.2 Chiếu xạ dung dịch bào tử 23 2.2.2.3 Chiếu xạ thạch đĩa 24 2.2.3 Xác định số lƣợng tế bào 24 2.2.4 Định tính định lƣợng cellulase 24 2.2.4.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch .24 2.2.4.2 Phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic) .25 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1.TUYỂN CHỌN CHỦNG Trichoderma CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN 28 3.1.1 Tốc độ phát triền hình thái khuẩn lạc chủng Trichoderma 28 3.1.2 Tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt tính cellulase cao ổn định 31 3.1.2.1 Khả sinh cellulase chủng Trichoderma .31 3.1.2.2 Một số đặc điểm chủng T koningiopsis VTCC 31435 .34 3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG NẤM T koningiopsis VTCC 31435 36 3.2.1 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả sống sót chủng nấm T koningiopsis VTCC 31435 36 3.2.2 Ảnh hƣởng xử lý chiếu xạ tới khả sinh cellulase chủng nấm T koningiopsis VTCC 31435 39 3.3 CÁC CHỦNG Trichoderma ĐỘT BIẾN PHÓNG XẠ CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO 42 3.3.1 Sàng lọc khuẩn lạc Trichoderma kháng xạ có khả sinh cellulase cao 42 3.3.2 Hoạt độ cellulase khuẩn lạc tiềm 44 3.3.2.1 Hoạt độ CMCase 44 viii 3.3.2.2 Hoạt độ FPase 46 3.3.2.3 Hình thái chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao 47 3.3.2.3 Tính ổn định chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao .49 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH MỤC PHỤ LỤC 59 PHỤ LỤC 60 56 41 Strakowska J., Chelkowski J., Blaszczyk L., 2014, The significance of cellulolyte enzymes produced by Trichoderma in opportunity life style of this fungus, J Basic Microbioogy 54, pp 1-12 42 Nagamani A., Mew T.W., 1987, Trichoderma- Apotential biological control agent in the rice based cropping systems 1- 13, IRRI saturday seminar, Los Banos, Phippines 43 Gadgil N.J., Daginawala H.F., Khanna P., Enhanced cellulase production by a mutant of Trichoderma reesei, Enzyme and Microbial Technology, 17(10), 942-946 44 Trần Đại Nghiệp, 2007, Giáo trình xử lý xạ sở công nghệ xạ Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 45 Blakely W.F., 2007, Introduction: Chromosome aberration induced by radiation, Lecture of regoninal training course on biological radiation dosimetry, Seoul, Korea 46 Obe G., Beck B., 1984, Human peripheral lymphocytes in mutation research Mutation in man, Springer-Verlag (74), pp 177-197 47 Bhatti B., Preston D.L., Doody M.M., Hauptmann M., Kampa D., Alexander B.H., Petibone D., Simon S.L., Weinstock R.M., Bouville A., Yong L.C., Freedman D.M., Mabuchi K., net M.S., Edwards A.A., Tucker J.D., Sigurdson A.J., 2007, Retrospective biodosimetry among United States radiologic technologists, Radiat Res 167, pp 727–734 48 Bauchinger M., 1983, Microdosimetric aspects of the induction of chromosome aberrations radiation induced chromosome damage in man, Mutation research 74, pp 1-22 49 IAEA, 2007, Biodosimetry training course lectures at KIRAM, Seoul, Korea 50 Phan Sỹ An, 1997, Tương tác xạ ion hóa với vật chất tác dụng sinh học xạ ion hóa, Hội nghị An tồn phóng xạ tồn quốc, Đà lạt 51 Fenech M., Morley A.A., 1985, Measurement of micronucleic in lymphocytes, Mutat Res 147, pp 29-36 52 Davati N., Najafi M.B.H., 2013, Overproduction strategies for microbial secondary metabotes A review, fe Science 3, pp 23–37 57 53 Narumi I., 2006, Carriers sterization using γ-irradiation, Biofertizer manual, Forum for nuclear cooperation in Asia (FNCA) Biofertizer project group Asia cooperation center, Japan atomic industrial forum (JAIF) Japan, pp 44-48 54 Silva Aquino K.A.S, 2012, Sterization by gamma irradiation, Gamma radiation, Prof Feriz Adrovic (ed.) In Tech Europe, pp 171-206 55 Yassien M.A.M, Jiman-Fatani A., Hani Z.A., 2014, Production, purification and characterization of cellulase from Streptomyces sp., African journal of microbiology research 8(4), pp.348-354 56.https://www.researchgate.net/pubcation/260033789_Improvement_of_the_ cellulase_activity_of_Trichoderma_viride_mutated_by_gamma_irradiation 57 Darabzadeh D., Esfahani Z.H., Hejazi P., 2018, Improvement of cellulase production and its characteristics by inducing mutation on Trichoderma reesei 2414 under solid state fermentation on rice by products, Apped food biotechnology (1), pp 11-18 58 TCVN 12104: 2018, Xác định hoạt độ xenlulaza vi sinh vật phân giải xenlulo 59 Miklaszewska B., Macko D., Kłosowski G., Mikulski D., 2016, Application of semi-quantitative and quantitative methods for the selection of cellulolytic filamentous fungi isolated from pulp mill materials, BioTechnologia, 3, pp 169–178 60 Florencio C., Couri S., Farinas C.S., 2012, Correlation between agar plate screening and sod-state fermentation for the prediction of cellulase production by Trichoderma strains Enzyme Res, pp.1-7 61 Jahangeer S., Khan N., Jahangeer S., Sohail M., Shaazad S., Ahmad A., Khan S.A., 2005, Screening and characterization of fungal cellulases isolated from the native environmental source, Pak J Bot., 37, pp 739-748 62 Goldbeck R., Andrade C.C.P., Pereira G.A.G., Filho F.M., 2012, Screening and identification of cellulase, producing yeast like microorganisms from Brazian biomes, Afr J Biotechnol 11, pp.11595-11603 58 63 Damaso M.C.T., Terzi S.D.C, Farias A.X., Oveira A.C.P.D, Fraga M.E, Couri S., 2012, Selection of cellulolytic fungi isolated from diverse substrates, Braz Arch Biol Technol, 55(4), pp 513-520 64 Ruegger M.J.S., Tauk T., Sâmia M., 2004, Cellulase activity of fungi isolated from soil of the Ecological Station of Juréia-Itatins, São Paulo, Brazil Rev bras Bot.27(2), pp.205-211 65 Baharvand A., Shahbazi S., Afsharmanesh H., Ebrahimi M.A., Askari H., 2014, Investigation of gamma irradiation on morphological characteristics and antagonist potential of Trichoderma viride against M phaseona, Intl J Farm & Al Sci (11),pp 1157-1164 66 Sazci A., Radford A., Erenle K, 1986, Detection of cellulolytic fungi by using Congo red as an indicator a comparative study with the dinitrosalicylic acid reagent method, Journal of Apped Bacteriology 61, pp 559-562 67 Teather R.M., Wood P.J.,1982, Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen, Apped and environmental microbiology 48, pp 777-780 68 Trandafir T., Florina L.Z., Mioara A., Mihaele E., Mihai C., Alexandru A., Ovidiu I., Rodica I.S., 2012, Radioresistance of biodegradation in estabshing the decontamination dose, ICAMS 2014 – th International Conference on Advanced Materials and Systems 69 Satoh K., Oono Y., 2019, Studies on application of ion beam breeding to industrial microorganisms at TIARA, Quantum Beam Sci, 3(2), pp 1-16 70 Abdul-Hadi S., Al-Saffar F.A.S., Al-Bayyar A.H., 2018, Improving of cellulase productivity of Trichoderma reesei isolate by using physical and chemical mutagens, J Chem Bio Phy Sci Sec B, 7(2), pp 651-661 61 62 63 64 65 59 DANH MỤC PHỤ LỤC Trang Đƣờng chuẩn xác định hoạt độ FPase…………………… …60 Đƣờng chuẩn xác định hoạt độ CMCase……………………… ……60 Giấy chứng nhận chuyển giao chủng giống vi sinh vật 61 Kết phân tích CMCase chủng chủng sau chiếu xạ Trung tâm hóa sinh thực phẩm, Viện cơng nghệ thực phẩm ……62 4.1 Kết phân tích CMCase chủng chủng sau chiếu xạ ngày 25/02/2019 Trung tâm hóa sinh thực phẩm, Viện cơng nghệ thực nghẩm……………………………………… …62 4.2 Kết phân tích CMCase chủng chủng đột biến ngày 16/07/2019 Trung tâm Hóa sinh thực phẩm, Viện Cơng nghệ thực phẩm……………………………………… ……63 Bài báo tham gia Hội nghị khoa học hạt nhân toàn quốc lần thứ 13………………………………………………………………… ……64 60 PHỤ LỤC - Đƣờng chuẩn xác định hoạt độ FPase - Đƣờng chuẩn xác định hoạt độ CMCase 61 62 63 64 65 ... hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao xử lý chiếu xạ? ?? với nội dung sau: Tuyển chọn số chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao (từ chủng. .. lọc chủng Trichoderma sau chiếu xạ có hoạt tính sinh cellulase cao; Đánh giá tính ổn định chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao Trichoderma 3 CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 CELLULASE. .. sinh cellulase, chủng đột biến sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao chủng 38% [56] Cùng với hƣớng nghiên cứu này, Darabzadeh cộng chứng minh đƣợc ảnh hƣởng xạ gamma tới khả sinh cellulase chủng