Nghiên cứu quy trình phân tích một số kháng sinh họ Floquinolon trong mẫu tôm : Đề tài NCKH. QT.07.57

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN #$#£** ** NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH HỌ FLOQUINOLON TRONG MAU t ô m M Ã SỐ : Q T -07-57 C H Ủ T R Ì Đ Ề TÀ I : TS Dương H ồng A nh C Á C C Á N BỘ T H A M GIA: ThS Phạm N gọc H CN T rần T hanh T uấn CN N guyễn H oàng Tùng ĐA! HỌ C Q UỐ C G IA HÀ NÔi TRUNG TẨM THÒNG TIN THƯ VIÊN H À N Ộ I - /2 0 IM TẮT KẾT QUẲ THỰC HIỆN Đề tài cap DHQGHN năm 2007 Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình phân tích dư lượng số kháng sinh họ Floquinolon mẫu tôm Mả số: QT - 07 - 57 Chủ trì đề tài: TS Dương Hồng Anh Các cán tham gia: ThS Phạm Ngọc Hà CN TrầnThanh Tuấn CN Nguyễn Hoàng Tùng Mục tiêu nội dung nghiên cứu Mục tiêu đề tài: - Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình phân tích dư lượng số kháng sinh họ Floquinolon mẫu tôm sở sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu phân tích định tính, định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu quy trình phân tích dư lượng số kháng sinh họ Floquinolon mẫu tôm dựa hai giai đoạn: > Chiết chất phân tích khỏi mẫu phương pháp chiết lỏng rắn thông thường, làm làm giàu dịch chiết phương pháp chiết pha rắn sử dụng loại cột chiết khác nhau: cột trao đổi cation hỗn hợp (MCX), cột trao đổi anion hỗn hợp (MAX), cột HLB.VỚi mõi cột chiết pha rắn giai đoạn rửa chất bẩn, rửa giải tối ưu hoá nhằm đem lại hiệu chiết tốt > Phân tích định tính, định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ huỳnh quang - Lấy mẫu tôm tưoi bán chợ địa bàn Hà Nội phân tích để minh hoạ khả sử dụng phương pháp Tóm tắt kết nghiên cứu đạt Tóm tắt kết nghiên cứu, ỷ nghĩa khoa học kết đạt được: - Đã tối ưu hố 03 qui trình phân tích dư lượng số kháng sinh họ Floquinolon mẫu tơm > Quy trình 1: mẫu tơm chiết dung môi EtOH/axit axetic (99/1) Dịch chiết làm làm giàu kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột MCX gồm bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần mL EtOH/axit axetic (99/1), rửa tạp chất lần 3mL MeOH, rửa tạp chất lần 3mL NH 3/H /M e H (10/85/5), rửa giải 3mL NH 3/MeOH/fị(Y'íỹ£^;) Thực q trình chuyển đổi dung mơi phân tích định tính định lượng HPLC-FLD Qui trình có hiệu suất thu hồi vói bốn loại floquinolon 64 83%, giới hạn định lượng 5,0 - 7,0 |J.g/kg đáp ứng yêu cầu phân tích mẫu tơm > Quy trình 2: mẫu tôm chiết đệm phôtphát pH=7,4 Dịch chiết làm làm giàu kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột MAX gồm bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần mL NH 5%, rửa tạp chất rửa tạp chất lần ' 3mL H /M e0 H Qợ/0) 4% HCOOH, rửa giải 3mL HzO/MeOH Cố70(j) trong6 % HCOOH Thực hiên q trình chuyển đổi dung mơi phân tích định tính định lượng báng HPLC-FLD Qui trình có hiệu suất thu hồi với bốn loại floquinolon 62 - 84%, giới hạn định lượng 4,9 - , |J.g/kg đáp ứng u cầu phân tích mẫu tơm > Quy trình 3: mẫu tơm chiết đệm phôtphát pH=7,4 Dịch chiết làm làm giàu kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột HLB gồm bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần mL NH 5%, rửa tạp chất lần 3mL NH /M e0H /H 20 (lOMy 5VP), rửa giải 3mL NH 3/H /M e H (lO/to/80) Thực trình chuyển đổi dung mơi phân tích định tính định lượng HPLC-FLD Qui trình có hiệu suất thu hồi với bốn loại floquinolon 60- 85%, giới hạn định lượng 5,1 - 7,6 ng/kg đáp ứng u cầu phân tích mẫu tơm - Đã lấy mẫu tôm tươi chợ Hà Nội phân tích, phát hiộn dư lượng kháng sinh Ciprofloxacin, Norfloxacin Enrofloxacin mẫu phân tích với cỡ độ kháng sinh - |ig/kg Tóm tắt kết nghiên cứu, ý nghĩa thực tiễn kết đạt được: - Các quy trình phân tích dư lượng số kháng sinh họ Floquinolon mẫu tôm sở sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn (dùng cột MAX, MCX HLB) để xử lý mẫu phân tích định tính, định lượng phương pháp HPLC/FLD có giới hạn định lượng phù hợp với yêu cầu thực tế, so sánh với phương pháp HPLC/MS/MS đạt tương quan tốt chuyển giao cho sở sử dụng PTN Cục Quản lý chất lượng an toàn vệ sinh, thú y thủy sản (NAFIQAVED) Kinh phí đề tài 6.1 K inh phí cấp: 20 triệu 6.2 Giải trình khoản chi: - Th khốn chun mơn: Hố chất, nguyên liệu, dụng cụ: Hội nghị, hội thảo: Điện nước quản lý phí: KHOA QUẢN LÝ Trung tâm NC CNMT &PTBV GS.TS Phạm Hùng Việt 9.000.000 đồng 9.096.000 đồng 520.000 đồng 1.600.000 đồng CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI TS TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN HREF OF THE PROJECT Name of project: Study on analytical method development for determination of Fluoroquinolone Antibacterial Agents in shrimp sample The code number: QT - 07- 57 The Coordinator: Dr Duong Hong Anh The Participants of the project: MSc Pham Ngoc Ha BSc Tran Thanh Tuan BSc Nguyen Hoang Tung Purpose and contents of the research Purpose: - Optimizing analytical procedures for determination of Fluoroquinolone Antibacteria agents (FQs) in shirmp sample based on using solid phase extraction technique and high performance chromatography/ fluorensence for quantitation and qualification Content: - Study on analytical procedure for determination of Fluoroquinolone Antibacterial Agents in shrimp sample: > Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by shaking with suitable solvent The extract was cleanup by solid phase extraction technique using several cartridges: MAX, MCX and HLB For each cartridge, the procedures including wash and elution stages were optimized for the best extraction efficiency > Fluoroquinolnes were quantitated and qualificated by high performance chromatography/ fluorensence method - Several shirmp shamples were collected from markets in Hanoi for analysis as a practical examples for the developed methods Summary of obtained investigation results - Completing 03 analytical procedure for determination of Fluoroquinolone Antibacteria agents (FQs) in shirmp sample > Procedure 1: Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by shaking with phosphate buffer (pH=7,4) The extract was cleanup by solid phase extraction technique using MAX cartridge The clean up includes following stages: samples filling, r ‘ washing by mL of NH 5%, 2Gd washing by mL of MeOH, 3rd washing by mL of 4% HCOOH in M e0H /H 20 (10:90), elution by 3mL % HCOOH in M e0H /H 20 (95:5) The elute was analysed by HPLC-FLD Average recoveries obtained for FQs were in range of 62 - 84% Quantitative determination limits were in range of ,9 - , ng/kg The investigated procedures were suitable for analysis of shữmp samples > Procedure 2: Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by shaking with EtOH/axit axetic (99/1) The extract was cleanup by solid phase MCX cartridge The clean up includes following stages: samples filling, 1“ washing by mL of EtOH/axetic acid (99/1), 2nd washing by mL of MeOH, 3" washing by mL of NHj/MeOH/HjO (10/5/85), elutíon by 3mL NH 3/M e H/H (10/85/5) The elute was analysed by HPLC-FLD Average recoveries obtained for FQs were in range of 64 - 83% Quantitative determination limits were in range of 5,0 - 7,0 M-g/kg The investigated procedures were suitable for analysis of shirmp samples > Procedure 3: Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by shaking with phosphate buffer (pH=7,4) The extract was cleanup by solid phase extraction technique using MAX cartridge The clean up includes following stages: samples filling, r washing by mL of NH 5%, 2nd washing by mL of NH /M e0H /H 20 (10/10/80), elution by 3mL NH /MeOH/HjO (10/80/10) The elute was analysed by HPLC-FLD Average recoveries obtained for FQs were in range of 60 - 85% Quantitative determination limits were in range of ,1 - 7,6 ng/kg The investigated procedures were suitable for analysis of shirmp samples Ciprofloxacin, Norfloxacin and Enrofloxacin were found in 3/4 shirmp samples collected in Hanoi market at concentration in range of - 13 ng/kg for each antibacterial agents MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ổ THỊ MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng kháng sinh nuôi tôm Việt Nam 1.2 Dư lượng kháng sinh thuỷ sản tác hại 1.3 Đối tượng nghiên cứu - kháng sinh floquinolon tơm 1.4 Một số phương pháp xác định nhóm kháng sinh floquinolon mẫu thực phẩm 1.5 Lựa chọn phương pháp xác định nhóm kháng sinh floquinolon mẫu tôm 1.6 Giới thiệu chung vể cấu tạo, chế hoạt động cột chiết pha rắn sử dụng trongnghỉên cứu 1.6.1 Cột MAX 13 1.6.2 CộtM CX 13 1.6.3 CộtHLB 14 II MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 15 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 III THỰC NGHIỆM 16 3.1 Hoá chất, dụng cụ, thiết bị 16 3.2 Điều kiện phân tích sắcký lỏng hiệu cao 16 3.3 Thực nghiộm 17 3.3.1 17 Pha dung dịch chuẩn dung địch cần sử dụng 3.3.2 Xây dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắn/ kết hợp sắc ký lỏng hiệu cao phân tích dư lượng FQs mẫu tôm 18 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Nghiên cứu qui trình xử lí mẫu kỹ thuật chiết pha rắn 23 4.1.1 Tối ưu hố bước qui trình chiết pha rắn sử dụng cột 23 MAX 4.1.2 Tối ưu hoá bước qui trình chiết pha rắn sử dụng cột 27 MCX 4.1.3 Tối ưu hoá bước qui trình chiết pha rắn sử dụng cột 30 HLB 4.2 Phép đo định tính định lượng FQs phương pháp HPLC/FLD 33 4.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn xác định FQs 33 4.2.2 Sai số độ lặp lại phép đo 35 4.3 Đánh giá phương pháp phân tích FQs mẫu tơm 37 4.3.1 Cách tính hàm lượng FQs mẫu tơm 4.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp 37 4.3.3 Hiệu suất thu hồi phương pháp 38 4.3.4 Kết phân tích dư lượng FQs số mẫu tôm 39 V KẾT LUẬN 42 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CIP : kháng sinh ciprofloxacin ELISA : phương pháp miễn dịch enzym ENR : kháng sinh enrofloxacin FQs : kháng sinh họ floquinolon HLB : cột chiết pha rắn loại cân ưa nước - kỵ nước HPLC/FLD : sắc kí lỏng hiệu cao/ detectơ huỳnh quang LC/MS/MS : sắc kí lỏng/detectơ khối phổ kép LOD : giới hạn phát phương pháp LOM : kháng sinh lomefloxacin LOQ : giói hạn định lượng phương pháp MAX : cột chiết pha rắn loại anion hỗn hợp MCX : cột chiết pha rắn loại cation hỗn hợp NOR : kháng sinh norfloxacin SPE : phương pháp chiết pha rắn PLE :phương pháp chiết lỏng áp suất cao DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Một số kháng sinh thường sử dụng Viột Nam nuôi tôm Bảng Độ lặp phép đo xác định NOR, CIP, LOM, ENR 36 Bảng Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp xác định FQs mẫu tôm sử dụng loại cột chiết khác Bảng 37 Kết khảo sát hiệu suất thu hổi phương pháp phân tích sử dụng cột MAX Bảng 38 Kết khảo sát hiệu suất thu hồi phương pháp phân tích sử đụng cột MCX Bảng 38 Kết khảo sát hiệu suất thu hổi phương pháp phân tích sử dụng cột HLB 39 Bảng Dư lượng FQs mẫu tôm tươi chợ Phùng Khoang Bảng Dư lượng FQs mẫu tôm tươi chợ Phùng Thanh 40 Xuân Bảng 40 Dư lượng FQs mảu tôm tươi chợ Hàng Bè 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ổ THỊ * • Trang Hình Cấu trúc FQs nghiên cứu 10 Hình Cấu trúc chế lưu giữ cột MAX 13 Hình Cấu trúc chế lưu giữ cột MCX 14 Hình Cấu trúc chế lưu giữ cột HLB 14 Hình Qui trình chiết tách FQs từ mẫu tơm 18 Hình Các bước qui trình sử dụng cột MAX 19 Hình Các bước qui trình sử dụng cột MCX 20 Hình Các bước qui trình sử dụng cột HLB Hình Sự thay đổi diện tích tín hiệu theo tỉ lệ M e0H /H 20 dung mơi rửa lần Hình 10 23 Sự thay đổi diộn tích túi hiệu theo nồng độ axit fomic dung mơi rửa giải Hình 11 24 Sự thay đổi chiểu cao tín hiệu theo tỉ lê MeOH/ H20 dung mơi rửa giải Hình 12 25 Sự thay đổi sấc đổ thay đổi điều kiện rửa rửa giải cột MAX 26 Hình 13 Sự thay đổi diện tích tín hiộu theo tỉ lệ M eOH/ H20 Hình 14 Sự thay đổi diện tích tín hiệu theo tỉ lệ NHj/MeOH đung môi rửa giải Hình 15 Sự thay đổi chiểu cao tín hiệu theo tỉ lộ M e0H /H 20 dung 29 Sự thay đổi sắc dổ thay đổi thành phẩn hệ dung mơi rửa giải cột MCX Hình 17 30 Sự thay đổi diộn tích tín hiệu theo tỉ lệ M e0H /H 20 dung mơi rửa lẩn Hình 18 31 Sự thay đổi chiều cao tín hiệu theo tỉ lệ MeOH /H20 đung mơi rủa giải Hình 19 28 28 mơi rửa giải Hình 16 21 32 Sự thay đổi sắc đổ thay đổi bứớc rửa rửa giải cột HLB 33 Hình 20 Khoảng tuyến tính NOR; G P ; LOM; ENR 34 Hình 21 Đường chuẩn xác định NOR, CIP, LOM, ENR ưong khoảng nổng độ 3,3-201ppb 35 Hình 22 Sắc đổ phân tích mẫu tơm tươi lấy chợ Phùng Khoang 40 Hình 23 Sắc đồ phân tích mảu tơm tươi lấy chợ Thanh Xn 40 Hình 24 Sắc đổ phân tích mẫu tơm tươi lấy chợ Hàng Bè 41 PHỤ• LỤC * I Bài báo Dương Hồng Anh, Phạm Ngọc Hà, Trần Thanh Tuấn, Nguyễn Hồng Tùng “Quy trình phân tích dư lượng thuốc kháng sinh Floquinolon mẫu tơm sử dụng kỹ thuật chiêì pha rắn kết hợp với phân tích định tính định lượng sắc kí lỏng hiệu cao sử dụng detectơ huỳnh quang "đã gửi đăng tạp chí Phân tích Hố Lý Sinh học 2008 II Quyết định công nhận đề tài luận văn thạc sỹ người hướng dản học viên cao học Trần Thanh Tuấn QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Dư LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH FLOQUINOLON TRONG MẪU TÔM s DỤNG KỶ THUẬT CHIẾT PHA RẮN KẾT HỢP VỚI PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BANG SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTƠ HUỲNH QUANG Dương Hồng Anh, Phạm Ngọc Hà, Trần Thanh Tn, Nguyễn Hồng Tùng Trung tâm Nghiên cứu Cơng nghệ Mơi trường vị Phát triển Bển vững, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN SUMMARY ANALYTICAL M ETHOD FOR DETERMINATION OF FLUOROQUINOLONE ANTIBACTERIAL AGENTS IN SHRIMP SAM PLE BY SOLID PHASE EXTRACTION TECHNIQUE A N D HIGH PERFORM ANCE CHROMATOGRAPHY FLUORESCENCE DETECTION The analytical procedure for determination o f fluoroquinolone antibacterial agent (FQs) residues in shrimp sample were optimized by solid phase extraction technique using several kinds o f ion exchange cartridges (MAX, MCX) and reversed-phase liquid chromatography in combination with fluorescence detection Average recoveries obtained for FQs were in range o f 60 - 85% Quantitative determination limits for each FQs were in range o f 4,9 - 7,0 ng/kg Ciprofloxacin, Norfloxacin and Enrofloxacin were found in some shirmp samples collected in Hanoi market at concentration in range of - 13 |!g/kg for each antibacterial agents MỞĐẦU Nghể nuôi tôm Việt Nam thực phát triển từ sau nãm 1987 nuôi tôm thương phám phát triển mạnh vào nhũng năm đầu thập kỷ 90 Diện tích ni tơm tăng từ 250.000 (năm 2000) lên đến 478.000 (nãm 2001) 540.000 (nảm 2003) [1], Sản lượng nuôi tôm tăng mạnh, đặc biệt từ sau năm 2000, Việt Nam trở thành nãm nước có sản lượng tơm ni cao giới Tuy nhiên, nghề nuôi tôm Việt Nam phải đối mặt với thách thức nghiêm trọng, bùng nổ loại bệnh dịch làm ảnh hưởng nặng nề tới sản lượng tôm Để phòng bệnh trị bệnh, người ta phai sử dụng nhiều loại thuốc hóa chất oxytetracylin, sulfonamid, amoxicilin , có kháng sinh nhóm floquinolon (FQs) [6] Mặt trái việc sử dụng kháng sinh môi trường thủy sản ảnh hưởng đên chất lượng tôm xuất môi trường nuôi tôm [4], Kiểm soát dư lượng kháng sinh FQs yêu cầu nghiêm ngặt thuỷ sản xuất thời gian qua, thuỷ sản Việt nam tôm cá da trơn xuất vào thị trường Hoa Kỳ Nhật bị sô lần trả lại phát dư lượng kháng sinh FQs [1], Việc xác định dư lượng kháng sinh tôm thu hút ý dư luận nhà khoa học Việt Nam giới [3] Hiện có phịng thí nghiệm Cục Quán lý chẫt lượng an toàn vệ sinh, thú y thúy sán (NAFIQUAVED) có chức kiểm sốt dư lượng FQs cá, tôm phục vụ xuất phương pháp thư nhanh ELISA xây dựng phương pháp SPE/LC/MS/MS để phân tích kiểm chứng Trong báo chúng tơi trình bày kêt nghiên cứu qui trình phân tích dư lượng FQs mẫu tôm phương pháp chiết pha rân kết hợp sãc ký lỏng hiệu cao dùng detectơ huỳnh quang thiết bị có mặt phổ biến phịng thí nghiệm phân tích Các FQs lựa chọn để nghiên cứu norfloxacin (NOR), cipprofloxacin (CIP), lomefloxacin (LOM) enrofloxacin (ENR) CIP LOM ^ H ình 1: Cóng thức cấu tạo kháng sinh FQ s sử dụng nghiên cứu II THỰC NGHIỆM: 2.1 Hoá chất, dụng cụ, thiết bị - - Chất chuẩn dạng bột: CIP (Bio Fluka -17850), NOR (SIGMA:0-8757), LOM (SIGMA: L2906), ENR (Fluka) Dung dịch axit photphoric 85%, axetonitril, amoniac 25%, axit clohydric 37%, metanol tinh khiết (Merck, Darmstadt, Đức) Cột chiết pha rắn MAX 6ml 150 mg, MCX 6ml 150 mg (Oasis, Mỹ) Bộ chiết pha rắn Supelco, máy lắc Vortex (Bohemia, Mỹ), máy ly tâm Rotina 35R (Hettich, Đức) Thiết bị sắc ký lỏng hiệu nãng cao (HPLC - LC 10AB) sử dụng detectơ huỳnh quang (FLD) hãng Shimadzu - Nhật Bản 2.3.Thực nghiệm * Chiết tách FQs khỏi mẫu tơm mẫu Cân xác g mẫu tôm cho vào cốc, thêm 30 ml dung mỏi chiết (dung môi chiết đệm phốt phát 0,05 M (pH= 7,4) sử dụng cột MAX, dung môi chiết EtOH/axit axetic (9 :1 ) sử dụng cột MCX) Quy trình chiết tách hình Mẫu hóa băng dụng cụ chuyên dụng phút, đem rung lắc 30 phút máy lắc tự động, sau li tâm vịng 10 phút vói tốc độ 4000 vịng/ phút Gạn lấy lớp dịch phía vào bình tam giác Sau lấy 10 ml dịch chiẽt Hình 2: Qui trình chiết tách FQs từ mẫu tôm thu cho qua cột chiết pha rán đế loại tạp chất làm giàu * Qui trình xử lí mẫu kỹ thuật chiết pha răn Các FQs sau chiết khỏi mẫu tơm có hàm lượng nhỏ dịch chiết có chứa rât nhiểu chất gây ảnh hưởng cần phải làm làm giàu kỹ thuật chiết pha rắn Theo công thức cấu tạo hợp chất FQs có chứa nhóm COOH NH2 phân tứ với pKa cỡ - 9, tuỳ theo pH hợp chất mang điện tích dương điện tích âm sử dụng cột chiết trao đổi anion cation đề xứ lí dịch chiết Mật khác phân tử FQs có cấu trúc vịng thơm có thê sư dụng cột chiết theo chế hấp phụ pha ngược Sau tham khảo tài liệu [5, 7], định lựa chọn loại cột chiết pha rắn cột trao đổi anion hôn hợp (MAX), cột trao đổi cation hỗn hợp (MCX) cho bước chiết pha rắn Sau trình khào sát, tối ưu hố bước rua tap chất, rửa giải đua quy trình chiết pha rắn tương úng với cột hình Hình Cấu trúc chếliíu gỉứ cua cột MAX cột MCA Hình : Quy trình chiết pha rắn sử dụng cột MAX cột MCX Điều kiện phản tích sấc ký lỏng hiệu cao: [2] - Tién cột: RP-Amit C16 (3,0 mm), cột: RP-Amit Clố (250 X * 3,0 mm; 5ụm, Supelco) - Nhiệt độ lò: 50°c Áp suất tối thiểu: lObar, áp suất tối đa: 400bar Thể tích bơm mảu: 200 - ụl Tốc độ dòng 0,7ml/phút Detectơ huỳnh quang (FLD): - Bước sóng kích thích (excitation): Vj = 278nm Bước sóng phát xạ (emission): v2= 445nm Pha động: Sử dụng chế độ gradien dung mơi vói: Dung dịch H3P 25mM (A),dung môi Axetonitril (B) * Đánh giá phương pháp phân tích FQs mẫu tơm: Các phương pháp phân tích sau tối ưu hố đánh giá sờ xác định hiệu suất thu hồi, độ lặp lại giới hạn phát Sau tối ưu hố quy trình chúng tơi thu thập mẫu tôm tươi chợ Hà Nội mẫu tơm đơng khơ Ninh Bình Nam Định để phân tích nhằm minh hoạ khả sử dụng phương pháp III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phép đo định tính định lượng FQs phương pháp HPLC/FLD Các FQs có tính chất huỳnh quang nên phân tích định tính định lượng HPLC với detectơ huỳnh quang (FLD) bước sóng kích thích (excitation): V , = 278nm bước sóng phát xạ (emission): v2 = 445nm Thời gian lưu FQs: NOR, CIP, LOM, ENR 20.5, 22, 22.5 26.5 phút Các FQs phân tích định lượng phương pháp ngoại chuẩn Đường chuẩn FQs xây dựng khoảng nồng độ từ 3,33 ppb đến 999.7 ppb đế khảo sát khoảng tuyến tính Sau đo chúng tơi thu kết hình Như khoảng nồng độ 3,33 đến 666,7 ppb cường độ phát quang tỉ lệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích nồng độ tiếp tục tăng khơng cịn tỉ lệ tuyến tính ■ LOM ♦ NOR * ENR ■ CIP N óng độ c h ấ t c h u ẩ n 500 1000 1500 Đ ong đõ ch át ch u ẩn Hình 5: Đổ thị khảo sát khoảng tuyền tính FQs Từ kết khảo sát khoảng tuyến tính FQs trên, sử dụng phần mểm Origin 6.0 để xây dựng đường chuẩn, phương trình đường chuẩn phục vụ cho mục đích định lượng FQs khoảng 3,33ppb đến 201,3ppb Kết hình sau C IP NOR • Y Y - A - B *x Parameter Value A 15,37301 B 964 61164 R 0.9999 Nong dộ B *x Value A 200 14438 B 1321 94152 R 99988 Nủny à\' l/níiiỉỊ s tO ìù u n 0 Ọ UYÍÍT Đ ỊN II CỦA IIIKIJ TRUỒNG TRUỜNCi OẠI IIỌC KHOA IIOC I U NI III N V/v: công nhận dé lùi vã ngưừi hướng dần luận vãn thạc sĩ cúa I IVCII Khóa 2005- 2007 H I ỆU T R Ư Ỏ N G TRƯÒNC; ĐẠĨ H Ọ C K H O A H Ọ C T ự NHI ÊN - Căn Q uy clịtih r t; t chức v ù h o a ! ÍỈỘIIỊÌ irtiHỊỊ D ại học Q uòc "/ Procedure 1: F ữ stly , the hom ogenous shirm p sam ple was extracted by shaking with EtOH/axit axetic (99/1) The extract was cleanup by solid phase extraction technique using MCX cartridge The clean up includes following stages: samples filling, 1st washing by mL of EtOH/axetic acid (99/1), 2nd washing by mL of MeOH, 3rd washing by mL of NH 3/H /M e H (10/85/5), elution by 3mL NH3/MeOH (10/90) The elute was analysed by HPLC-FLD Average recoveries obtained for FQs were in range of 64 - 83% Quantitative determination limits were in range of 5,0 - 7,0 ng/kg The investigated procedures were suitable for analysis of shirmp samples > Procedure 2: Fừstly, the homogenous shirmp sample was extracted by shaking with phosphate buffer (pH=7,4) The extract was cleanup by solid phase extraction technique using MAX cartridge The clean up includes following stages: samples filling, 1st washing by mL of NH 5%, 2nd washing by mL of MeOH, " washing by mL of H /M e0 H (5/95) in 4% HCOOH, elution by 3mL HjO/M eOH (5/95) in 4% HCOOH The elute was analysed by HPLCFLD Average recoveries obtained for FQs were in range of 62 - 84% Quantitative determination limits were in range of ,9 - , |ig/kg The investigated procedures were suitable for analysis of shirmp samples > Procedure 3: Fừstly, the homogenous shirmp sample was extracted by shaking with phosphate buffer (pH=7,4) The extract was cleanup by solid phase extraction technique using MAX cartridge The clean up includes following stages: samples filling, 1st washing by mL of NH 5%, 2nd washing by mL of NH /M eOH/H2ơ (10/5/85), elution by 3mL NHj/MeOH (10/90) in % HCOOH The elute was analysed by HPLC-FLD Average recoveries obtained for FQs were in range of 60 - 85% Quantitative determination limits were in range of ,1 - 7,6 fig/kg The investigated procedures were suitable for analysis of shirmp samples Results in practical application: - Ciprofloxacin, Norfloxacin and Enrofloxacin were found in 3/4 shirmp samples collected in Hanoi market at concentration in range of - 13 |!g/kg for each antibacterial agents - The investigated analytical methods need to be crosschecked by SPE/LC/MS/MS method for confirmation If the comparison achives good results, the investigated analytical method can be used for practical purpose Results in training: M aster thesis Publications: publication Duong Hong Anh, Pham Ngoc Ha, Tran Thanh Tuan, Nguyen Hoang Tung “Analytical method Development for Determination of Fluoroquinolone antibacterial agents in shrimp sample by solid phase extraction technique and high performance chromatography/ fluorescence detection" submited to Vietnam Analytical Sciences Journal 11 Evaluation grade (if the project has been evaluated by the the evaluation committee: excellent, good, fair) PHIẾU ĐẢNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN c ú n KH - CN Tên Đề T ài: Nghiên cứu quy trình phân tích dư lượng số kháng sinh họ Floquinolon mẫu tôm M ã số: Q T- 07- 57 Cơ quản chủ trì đề tài: Trường Đại học Khoa học tự nhiên 334 - Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Tel: 8585277 Cơ quan q uản lý đề tài: Đại học Quốc gia Hà nội 144 - Xuân Thuỷ, Cầu Giấy, Hà Nội Tel: Tổng kinh phí thực chi: 20.000.000 T rong đó: - T Ngân sách Nhà nước: 20.000.000 Thời gian thực hiện: lnăm Thời gian b đầu: 3/2007 Thời gian kết thúc: 3/2008 Tên cán phối hợp: TS Dương Hổng Anh (chủ trì) ThS Phạm Ngọc Hà CN Trần Thanh Tuấn CN Nguyễn Hoàng Tùng Số đăng ký đề tài Số chứng nhận đăng ký kết nghiên cứu: Ngày: Bảo a b c mật : Phổ biến rộng rãi: X Phổ biến hạn chế: Bảo mât: Tóm tắt kết nghiên cứu: - Đã tối ưu hố 03 qui trình phân tích dư lượng số kháng sinh họ Floquinolon mẫu tơm > Quy trình 1: mẫu tơm chiết dung môi EtOH/axit axetic (99/1) Dịch chiết làm làm giàu kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột MCX gồm bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần mL EtOH/ạxit axeúc (99/1), rửa tạp chất lần 3mL MeOH, rửa tạp chất lần bàng 3mL NH^/H^O/MeOH (10/85/5), rửa giải 3mL NH j/M e O H /ft^ /iy # Thực q trình chuyển đổi dung mơi phân tích định tính định lượng HPLCFLD Qui trình có hiệu suất thu hổi với bốn loại floquinolon 64 - 83%? giới hạn định lượng , - , ^Ig/kg đáp ứng u cầu phân tích mẫu tơm > Quy trình 2: mẫu tơm chiết đệm phôtphát pH=7,4 Dịch chiết làm làm giàu kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột MAX gồm bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần mL NH 5%, rửa tạp chất lần báng 3mL MeOH, rửa tạp chất lẩn 3mL H /M e H (40/10) 4% HCOOH, rửa giải 3mL H /M e0 H ( 5!9Õ) % HCOOH Thực q trình chuyển đổi dung mơi phân tích định tính định lượng HPLCFLD Qui trình có hiệu suất thu hổi với bốn loại floquinoion 62 - 84%, giới hạn định lượng 4,9 - , ịig/kg đáp ứng u cầu phân tích mẫu tơm > Quy trình 3: mẫu tơm chiết đệm phơtphát pH=7,4 Dịch chiết làm làm giàu kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột HLB gổm bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần mL NH 5%, rira tạp chất lần băng 3mL NHj /M e0H /H 20 (10/W80), rửa giải 3mL NHj/HjO/MeOH (10/ty8d» Thực trình chuyển đổi dung mơi phân tích định tính định lượng HPLC-FLD Qui trình có hiệu suất thu hổi với bốn loại floquinolon 60- 85%, giới hạn định lượng 5,1 - 7,6 ]ig/kg đáp ứng u cầu phân tích mẫu tơm - Đã lấy mẫu tôm tươi chợ Hà Nội phân tích, phát dư lượng kháng sinh Ciprofloxacin, Norfloxacin Enrofloxacin mẫu phân tích VỚI cỡ độ kháng sinh - ng/kg Kiến nghị qui mô đối tượng áp dụng: - Cần gửi mẫu phân tích kiểm tra chéo với phương pháp SPE/LC/MS/MS Nếu kết đạt tương quan tốt chuyển giao cho sở sử dụng PTN cùa Cục vệ sinh An toàn thuỷ sản C hủ nhiệm dể tài Họ Tên Học hàm, học vị Ký tên Đống dấu Dương H ồng Anh Thủ trưởng quan chủ trì dề tài Chủ tịch Hội dồng đánh giá thức Thủ trường quan quàn lý dề tài