Nghiên cứu sự tương tác giữa Lectin và enzim amylase và proteinase : Đề tài NCKH. QT.08.67

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN NGHIÊN CỨU Sự TƯƠNG TÁC GIỮA LECTIN VÀ ENZIM AMYLASE VÀ PROTEINASE VÀ KHẢ NĂNG ÚNG DỤNG Mã số: QT - 08 - 67 Chủ trì đề tài: TS Nguyễn Quang Vinh 7;A' H O C Q U Ố C G IA HA N O I ^RUN G Tá m THÕMG t i n t h v i ệ n 'ữ r / % '/ HÀ NỘI - NĂM 2009 BÁO CÁO TÓM TẮT Tên để tài: "Nghiên cứu tương tác lectin enzim amylase proteinase khả ứng dụng" Mã số: QT-08-67 Chủ trì đề tài: TS Nguyễn Quang Vinh Cán tham gia: CN Trần Văn Quang - giảng viên trường Đại học Sư phạm Hà Nội Mục tiêu nội dung nghiên cứu: Mục tiêu: - Tách lectin, enzim nghiên cứu tính chất chúng số loài sinh vật biển nấm lón - Nghiên cứu tương tác lectin amylase proteinase thương phẩm tự nhiên Nội dung nghiên cứu: - Thu mẫu phân tích số enzim (proteinase amylase) sổ loài sinh vật biển nấm lớn - Tách, tinh chế phẩm lectin từ số mẫu chọn - Nghiên cứu tương tác lectin tách với proteinase amylase tự nhiên thương phẩm Các kết đạt được: - Đã thu thập loài động vật biển 18 loài nấm lớn mọc tự nhiên nuôi trồng địa bàn Hà Nội số tỉnh thành - Đã phát thấy lectin loài số loài động vật biển thu gom vùng biên Quảng Ninh, lồi có hoạt tính cao Hải miên (Callyspongia sp.) Lectin loài bền nhiệt, hoạt độ bị ức chế đường lactose Đã tinh phần lectin từ Hải miên bàne phương pháp lọc phân tử qua cột Sephadex G-100 sắc ký trao đổi ion cột DEAE-cellulose (độ tăng lên gần 10 lần) - 18 loài nấm lớn mọc tự nhiên nuôi trồng nghiên cứu điều tra hoạt độ proteolytic (PA) amylolytic (AA) phát thấy AA 16/18 loài (chiếm 88,9%) PA 12/16 loài (chiếm 75%) - Thử nghiệm phương pháp Wolgemuth nhựa cho thấy dùng phương pháp cải tiến để xác định hoạt độ amylase - Ket nghiên cứu tính chất proteinase amylase loài nấm ăn thường gặp là: nấm sò trắng, nấm hương, nấm rơm, cho thấy proteinase lồi nấm thuộc nhóm proteinase - serine và/hoặc proteinase-aspartic, cịn amylase a-amylase và/hoặc ß-amylase - Khi tương tác với enzim, lectin từ rong biển ưỉva conglobata kìm hàm hoạt độ proteinase nấm sị trấng, nấm hương nấm rơm, khơng ảnh hưởng tới hoạt độ amylase loài nấm Lectin tách từ Hải miên Caỉỉyspongia sp khơng ảnh hưởng đển achymotripsin lại kìm hãm rõ nét hoạt độ papain Tình hình kinh phí đề tài Kinh phí cấp: 20 triệu đồng Kinh phí tốn: 20 triệu đồng PHỊNG ĐÀO TẠO CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI _ \/^ Nguyễn Quang Vinh TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự• NHIÊN • * • • MÓ HIỀU H Ư Ỏ N G 11 STUDY ON INTERACTIONS OF LECTINS AND ENZYMES (PROTEINASE AND AMYLASE) AND THEIR POSSIBLE APPLICATION SUMMARY Five species o f marine coral and sponge were examined for lectins (hemagglutinins) and hemagglutinating activity (HAA) was found in extracts o f species o f which Callyspongia sp is the species containing ABO blood group non-specific lectin with the highest HAA Lectin from this sponge was partially purified by sephadex G-lOO gel filtration and DEAE-cellulose ionexchange chromatography (the purity o f the preparation is increased in about 10 times) The lectin is relactivily thermostable (50% HAA remained at 60‘*C in 30 minutes) and its HAA is inhibited by Lactose Eighteen species o f mushrooms growing in nature and cultivated were screened for presence of proteolytic and amylolytic activities (PA & AA) and AA was found in 16/18 species (88,9%) and PA in 12/16 species (75%) Activity o f amylase can be determined by procedure of Wolgemuth carried out in microtiter plate Characteristics o f proteinase and amylases from Pleiirotus pulmonatus, Lentinula edodes and Volvariella volvacea (three edible mushrooms) were estimated and the results obtained show that proteinases in these mushrooms belong to group proteinase-serine and/or proteinase-aspartic, and amylases are a-amylase and/or (3-amylase Studies o f interaction of the lectins and enzymes showed that lectin from marine alga Ulva conglobata have no effect on activity o f amylases, but inhibits activity o f proteinases in three mushroom above mentioned, while the lectin isolated from Callyspongia sp has almost no influence on activity of a-chymotripsin, but markedly inhibits the activity o f papain Ill M ỤC LỤC Trans M đầu Chưcmg Tổng quan 1.1 Lectin - sổ tính chất ứng dụng chúng 1.2 Chương enzim enzim amylase proteinase Nghiên cứu lectin enzim 2.1 Kết nghiên cứu lectin số loài nấm sinh vât biên Chương 15 15 2.2 Ket nghiên cứu amylase proteinase nấm lớn 22 Nghiên cứu tương tác lectin enzim 30 3.1 Tương tác lectin proteinase 30 3.2 Tương tác lectin amylase 33 Kết luận kiến nghị 36 Tài liệu tham khảo 38 IV ngun cịn khai thác mở triển vọng cho việc ứne dụng sinh học y học Trên sở điều trình bày trên, chúng tơi thực đề tài: "Nghiên cứu tương tác ỉectin enzint amylase prơíeỉnase khả ứng dụng" CHƯƠNG TỎNG QUAN Để tìm hiểu hợp chất tự nhiên, thơng thường người tabắt đầu bàng nghiên cứu điều tra hợp chất nguồn nguyên liệu có sằntrong tự nhiên Trên sở kết nghiên cứu điều tra, đổi tượng giàu hợp chất quan tâm chứa họp chất có tính đặc hiệu đáng ý, chọn để nghiên cứu sâu Việc nghiên cứu lectin enzim tuân theo quy tắc triển khai rộng rãi đối tượng sinh vật 1.1 Lectin - số tính chất ứng dụng chúng Ngày nay, lectin định nghĩa là: "Protein glycoprotein liên kết đưỊTig khơng có nguồn gổc miễn dịch, có khả ngưng kết tế bào (và) kết tủa phức chất xacarit" [12] Từ định nghĩa thấy rõ hai tính chất quan trọng lectin khả ngưng kết tế bào, có tế bào hồng cầu, khả kết tủa phức chất xaccarit Người ta thường phát lectin hai phản ứng Lịch sử nghiên cứu lectin [13] thức thừa nhận năm 1888 Stillmark phát tính chất ngưng kết tế bào hồng cẩu người nhiều động vật khác rixin - độc tố có chất protein tách từ hạt thầu dầu {Ricinus communis) Sự ngưng kết hồng cầu khác động vật khác nhau; khơng ngạc nhiên lectin cịn gọi hemagglutinin Tuy vậy, rixin không ngưng kết tế bào hồng cầu mà ngưng kết tế bào khác như: tế bào gan, tế bào biểu bì, bạch cầu Cơng trình Stỉllmark kích thích nghiên cứu huyết học miễn dịch học Tiếp sau nghiên Stillmark, hàng loạt nghiên cứu công bố có mặt lectin thực vật, vi sinh vật động vật Từ giừa kỷ thứ XX trở đi, nhờ tiếp cận hoá sinh việc áp dụng phương pháp kỳ thuật tách chiết hợp chất tự nhiên, nghiên cửu lectin triển khai sâu rộng loạt tính chất độc đáo khả nâng ứng dụng lectin đề cập 1.1.1 M ội sổ tính chất hoả lý lectìn [14] - thành phần hoá học: Trong thành phần axit amin lectin nghiên cứu axit amin axit (như aspactat) hydroxiamino axit (như xerin, treonin) chiếm tỷ lệ cao (khoảng 30%), axit amin chứa lưu huỳnh khơng có Mặc dầu vậy, thành phần axit amin trình tự chúng chuỗi polypeptit lectin, người ta nhận thấy nhừng lectin tách từ loài chi nhóm có thành phần trình tự axitamin giống nhiều hoTi lồi khác chi khác nhóm Tuyệt đại đa số lectin biết, thành phần mình, ngồi axitamin cịn chửa thành phần đường (xáccarit) Các đường tìm thấy lectin thường mannose, glucose, galactose, galactosamine Người ta tìm thấy phân tử số lectin ion kim loại Mg^^, Ca^^, M n‘^ Các ion kim loại cần thiết cho tương tác gổc đường lectin - Khối lượng phân từ lectin Khối lượng phân tử lectin khác khác Tuy nhiên, khối lượng phân tử đa số lectin nghiên cứu dao động khoảng từ 32 kDa đến 120 kDa; khác biệt lectin liên kết axit sialic: phân tử có hoạt tính chúng tập hợp với khổi lượng vào khoảng từ 200 đến 500 kDa Đặc điểm bật hầu hết lectin nahiẽn cứu cấu trúc phân tử có hoạt tính gồm phần đơn vị (pdđv) Phân tử có hoạt tính dimer, tetramer, hexomer cao lectin liên kết axit sialic gồm từ 10 đến 24 pdđv Các pdđv giống hệt khác nhau, kết hợp với thành đại phân tử nhờ liên kết khơng cộng hố trị nhờ cầu disulíìia Phần đơn vị lectin chuỗi polypeptit gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptit nối với bàng cầu disulÍLia Mỗi pdđv có trung tâm liên kết đường và/hoặc khơng có trung tâm liên kết ion kim loại, thể tính đa hố trị phân tử lectin - Tỉnh đặc hiệu đường lectin Khả liên kêt đường (xáccarit) tính chất quan trọng lectin Đặc tính liên kết với loại đường định, chủ yếu đưịng đơn (monoxaccarit) thể tínli đặc hiệu đưịng lectin Việc xác định tính đặc hiệu dựa mức độ ức chế phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu so sánh đưòng thêm vào phản ứng với nồng độ định, ỏ ức chế khả ngưng kết tế bào hồng cầu lectin trung tâm liên kết đường lectin bị đưòng thử phong toả (liên kết trước) nên không tiếp xúc với trung tâm thụ cảm bề mặt tế bào hồng cầu Trung tâm liên kết đường lectin phân bố mồi pdđv lectin domen gồm số gốc axit amin bao bọc vùng gồm axit amin khác Một sổ ion kim loại Mg^^, tham gia vào tương tác lectin với đường, chúng liên kết với lectin vị trí định gọi trung tâm liên kết kim loại Các trung tâm thường phân bổ vùng gần trung tâm liên kết đường lectin Việc loại bỏ ion kim loại trường hợp làm hoạt tính liên kết đường sổ tính chất khác lectin Trong số lectin nghiên cứu, lectin liên kết Galactose N-Axetyl-Galactosamine chiếm ưu số lượng phổ biến Như vậy, khả liên kết đường lectin mang tính chọn lọc thuận nghịch sở nhiều tính chất sinh học ứng dụng quan trọng lectin 1.1.2 M ột số tính chất sinh học lectin [14] - Sự ngim g kết tế bào Nếu tất tế bào bao bọc đường với khả liên kết đường mình, lectin dễ dàng ngưng kết tế bào, có tế bào hồng cầu, điều đễ hiểu Chính phản ứng ngưng kết dùng để phát có mặt lectin đối tượng nghiên cứu Phản úng ngưng kết xảy điều kiện định lectin tạo thành nhiều cầu nối tế bào cạnh Sự ngưng kết phụ thuộc vào nhiều yếu tố tính chất phân tử lectin (số lượng trung tâm liên kết đường), tính chất bề mặt trạng thái sinh lý tế bào hay điều kiện bên nhiệt độ, pH, nồng độ tế bào Những thay đổi không làm khả liên kêt đường lectin thay đôi hố trị (sơ phân đơn vị) hay kích thước phân tử, ảnh hưởng lớn đến ngưng kết tế bào lectin Thí dụ, polyme hố lectin đậu tương làm tăng khả ngưng kết hồng cầu lectin tới 100 - 200 lần; ngược lại biến đổi lectin đậu rựa (Con A) từ dạng tetrameric thành dạng hoá trị hai (dimer) làm giảm hoạt tính ngưns kết lectin tới 500 lần Sự thay đổi thành phần xaccarit phân tử lectin không ảnh hưcmg đến khả ngưng kết tế bào Đa số nghiên cứu ngưng kết tế bào lectin tiến hành với tế bào động vật, kể tế bào hồng cầu máu người Máu người khác máu động vật phân thành nhóm A, B, o, M, N Khi nghiên cứu phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu, người ta phát số lectin có tính đặc hiệu nhóm máu, nghĩa lectin gây ngưng kết tế bào hồng cầu thuộc nhóm máu định số nhóm máu kể Ngoài tế bào động vật, lectin liên kết tể bào khác vi khuấn, vi nấm, protozoa, tế bào thực vật Sự ngưng kết tế bào sở nhiều ứng dụng quan trọng lectin - Khả kích thích phân bào: tương tác với tế bào lectin có khả kích thích phân bào nguyên nhiễm (mitosis) nghiên cứu với tể bào limpho T hệ miễn dịch người Lectin nghiên cứu khả kích thích phân bào nguyên nhiễm lectin từ đậu côve (phaseolus vulgaris) - ký hiệu PHA, Không phải lectin gây kích thích phân bào, nhiều lectin từ họ đậu đỗ tác nhân gây kích thích phân bào (mitogen) tế bào limpho T người Một nghiên cứu khác [15] cho thấy lectin hạt sổ lồi mít hoang dại Việt Nam biểu khả kích thích phân bào tế bào limpho T người - M ột vài tính chất khác ỉectin Một số lectin từ lâu biết độc tố rixin, abrin, modexin Một số thực vật khác hay vi sinh vật chứa lectin - độc tố, độc tính lectin thường thấp nhiều (tới 1000 - 2000 lần) so với độc tính rixin abrin Cơ chê tác động lectin - độc tổ rixin, abrin biết rỏ Ngưòi ta thây lectin cấu tạo gồm hai chuỗi polypeptit (chuỗi nặng p- chuỗi nhẹ a-) nối với cầu disulfua Chuỗi P- có trung tâm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu nhận được, rút số kết luận sau: Trong số loài động vật biển nghiên cứu lectin, lectin phát thấy lồi, Hải miên Caỉlyspongia sp lồi chứa lectin khơng đặc hiệu nhóm máu người có hoạt tính cao nhất, khả bền nhiệt (ở 60^c 30 phút 50% hoạt độ), hoạt tính bị ức chế đường lactose Lectin từ hải miên tinh phần bàng phương pháp ỉọc phân tử qua cột Sephadex G-100 sắc ký trao đổi ion cột DEAE-cel (độ tăng lên gần 10 lần) Đã điều tra 18 lồi nấm mọc tự nhiên ni trồng hoạt độ amylolytic (AA) hoạt độ proteolytic (PA), phát thấy có mặt A A 16/18 loài (88,9%) PA 12/16 loài (75%) Thử nghiệm phương pháp Wolgemuth nhựa (microtiter plate) cho thấy dùng phương pháp cải tiến để xác đỊnh hoạt độ amylase Kết nghiên cứu tính chất proteinase vả amylase lồi nấm ăn thường gặp là; nẩm sò trắng, nấm hưcmg nấm rơm cho thấy proteinase loài nấm thuộc nhóm proteinase - serine và/hoặc proteinase - aspartic, cịn amylase a-amylase hoặc/và ß-amylase Khi tương tác với enzim, lectin tách từ rong biển Uỉva conglobata (ƯLC) kìm hãm hoạt độ proteinase nấm sị trắng, nấm hương nấm rơm không ảnh hưởng tới hoạt độ amylase loài nấm trên, lectin tách từ hải miên Caỉỉyspongia sp khơng ảnh hưởng đến a-chymotripsin lại kìm hãm rõ nét hoạt độ papain KIÉN NGHỊ Nghiên cứu lectin enzim (trong có proteinase amylase) đối tượng phong phú, đầy tiềm giới nấm sinh vật biển cần khuyến khích nhằm tìm họp chất thiên nhiên đặc hiệu dùng sinh học y học, để sử dụng hợp lý có hiệu nguồn tài ngun thiên nhiên cịn khám phá Nghiên cứu tương tác chất (như tương tác lectin enzim) từ thực nghiệm in vitro tiến tới thử nghiệm in vivo (trong 36 thể sinh vật), giải pháp hữu hiệu để tìm nguồn "thực phẩm chức năng" hay "thuốc" từ nguyên liệu tự nhiên điều trị bệnh, kể bệnh nan y đái tháo đường, ung thư, bệnh gut TÀI LIỆU THAM KHẢO Barondes S.H Vertebrate lectins: properties and functions In: The Lectin: properties, functions and applications in Biology and Medicine IE Liener, N Sharon and I J Goldstein (eds.) N.Y.Acad Press, 1986, 457 492 Sharon N Possible function o f lectins in micro-organisms, plants and animals Glycoconj Res Ill, 1979 Gold E.R and Balding p Receptor - specific proteins: plant and animal lectins Excerpta medica, Amsterdam, 1975 Ofek I., Sharon N Lectinophagocytosis: a molecular mechanism o f recognition between cell surface sugars and lectins in the phagocytosis o f bacteria Infect Immun., 1988, V.56, 539 - 547 Etzler M.E Distribution and function o f plant lectins In: The lectin properties, functions and applications in Biology and Medicine I E Liener, N Sharon, I J Goldstein, N.Y Acad Press., 1986 Nguyễn Quốc Khang, Nguyễn Thị Thịnh M ột vài tỉnh chat khả khai thác lectin từ hạt đậu rồng (Psophocarpus tetragonoỉobus) Tạp chí khoa học - Đại học Tổng họp Hà Nội 1985, số 3, 46 - 50 Đỗ Ngọc Liên, Trương Văn Châu, J Hoebeke Nghiên cứii so sánh m ột so đặc tính phân tử lectin từ hạt hai loại đậu Canavaỉia gỉadỉata Canavaỉia ensiformis Di truyền học ứ n g dụng, 1995, 2, 46 - 49 Nguyễn Lệ Phi, Nguyễn Văn Lợi, Phạm Quang Tùng, Đồ Ngọc Liên Nghiên círu so sảnh hoạt động ngim g kết hồng cảu người m ột so thực vật làm dược liệu Việt Nam Di truyền học ứ n g dụng, 1993, 2, 14 18 Bùi Phương Thuận, J Hoebeke, J Lamy c ấ u trúc poỉym e ỉectỉn sam biển Tachvpỉeus tridentaỉus: kết hợp nhũng đặc tính lectìn khác với protein hoạt động - c Tạp chí Sinh học, 1995, sổ 1, tập 17 38 10.Nguyễn Diệu Thuý, Cao Phương Dung, Nguyễn Quốc Khang Kết điều tra lectin từ nhiryễn thể Việt Nam Tạp chí Sinh học, 1995, tập 17, sổ 11.Robinson M.A, Charlton S.T and others LEAPT: Lectin - directed Enzyme - Activated Prodrug Therapy Proc Natl Acad Sci USA, June, 2004 12.Goldstein I.J, Hughes R c , M onsigny M., Osawa T., Sharon N What should be called a lectin? Nature, 1980, V.285, 66 IS.Kocourek Ì.Historical background In: The lectins - properties, functions and applications in Biology and Medicine Acad Press, New York, 1986, -3 H L iener I.E, Sharon N., Goldstein I.J (Eds) The Lectins properties, functions and applications in Biology and Medicine Acad Press, New York, 1986 15.ĐỖ Ngọc Liên Đặc tính kích thích phán bào đoi với ỉimpìĩo T người ỉectin hai ỉồi m hoang dại (Antocarpus asperuhis, Artocarpiis masticata) Tạp chí khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, 1995, số 3, X I, 33 - 38 ló.Aucouturier p., Mihaesco c , Preud'home J.L Characterization ofjacaUn, the human IgAj and IgD binding lectin from ja c k fruit Mol Immunol., 1987, 24, 503 - 511 17.ĐỒ Ngọc Liên, Nguyễn Lệ Phi Tỉnh chế IgAi từ huvết người sắc kỷ ải lực cột Sephadex - 4B - lectin mít tố nữ Di truyền học ứng dụng 9 ,2 ,2 -2 18.Nakamura R., Aoi K., Okada M., Interactions o f Enzymes and a ỉectin with a Chitin - Based Graft Copolymer havingpolysarcosirte side chains M acromolecular Bioscience, 2004, V , N°6, -6 19.Maierhofer c, Rohmer K and Wittmann V Probing m idtivalent carbohydrate - lectin interactions by an Enzyme - Linked lectin Assay 39 employing covalently immobilized carbohydrates Bioorganic & M edicinal Chemistry 2007, V.15, N°24 20.Doyle R J Introduction to lectins and their interactions with microorganisms In; Lectin - Microorganisms interactions Doyle R.J, Slifkin M (Eds), Marcel Dekker, 1994, - 65 21.Slifkin M., Doyle R J Lectins and their application to clinical microbiology Clin Microbiol Rev 1990, V.3, 197 - 288 22.Bui Phuong Thuan, Ngo Ba Binh Interaction o f Legume lectins with bacteria and some characteristics o f lectin from Anise flow er (Illisium pacựỉorum) Journal o f Science Vietnam National University, Hanoi, 2006, V xxii, N°3c p 227 -232 23.Nguyễn Quang Vinh, Nguyễn Hưng Việt Lectin đặc hiệu nhóm máu o từ tảo ỉục ưỉva conglobata: tinh số tỉnh chất Tạp chí Sinh học, 1995, tập 17, số 1, 56 - 59 24.Nguyễn Quang Vinh Nghiên cím ỉectin, proteinase chất ức chế proteinase sổ loài rong biển (rong đỏ, rong ỉục rong nâu) thuộc vùng biển Việt Nam Luận án PTS Khoa học Sinh học, 1996 25.Nguyễn Quang Vinh Nghiên cihi điển tra lectin enzim (proteinaza amilaza số loài nấm ỉớn mọc tự nhiên nuôi trồng N hững vấn đề nghiên cứu khoa học sống Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2007 "Nghiên cứu khoa học sống" Quy Nhơn 8/2007 NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2007, tr 876 - 879 40 TẠP CHÍ DI TRUYỀN HỌC & ỨNG DỤNG GENETICS & APPLICATIONS ISSN: 0866-8566 E2, 144 Xuân Thuỷ, Hà Nội Tel: 37548747; Fax: 37543391 E-mail: trungtaiTie3@ vahoo.com GIẤY CHỨNG NHẬN Chứng nhận (cá200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 200 >200 B Nghiên cử u p r o tein a se a m y la se ỏ nấm T rong n gh iên c ứ u tưcmg tác với lectin, enzim thLTcms p h ẩ m tripsin, c h y m o ip sin papain cliunii lòi dùng chê p h â m từ n âm Đ ê có n g u n enzim này, ch ún g tiến hà nh ng hiên cứu điều tra PA va AA ò mõt số loài nâm lớn m ọ c tự nh iên n uô i trồng K ết quà nghiên c ứ u điều a (bàn g 4) cho th ấv hoạt tinh k h ô n e cao nhimg am ỵlase vả p rote inase có ph biến lồi nấm đ ã ng h iên cứu: 16/18 loài (88 ,9 % ) có A A 12'16 lồi (75% ) chứa PA n h ữ n g loài biểu A A P A thi enzim axit tru n g tính c ưu (k ết qu xác định A A PA pH axit pH kiềm k h n g trình bày đây) H ơn nữa, liên hệ với hệ th ố n g p hân loại nấ m thấy nhữns; loài c ù n s họ cùno chứa enzim g iố n g n h a u đ ặc tính B ả n g 4, H o ạt độ am ylolytic (A A) hoạt đ ộ proteol>1ic (P A ) m ột số lồi nấm lón Sổ thứ tự Lồi nâm Coriopsis sp Coriolopsis semiìaccata Hoạt độ AA Hoạt độ PA 2+ 1+ 10 II 12 13 14 15 16 17 18 Ghi chú: Tên lồi năm 1+ Canoderma sp2 2+ ìnonotus s p l Inonotus sp2 Lentinus saịor- caịu 4+ 3+ Lentinula edodes (nâm hưcmg) 3+ 3+ Marasmius sp f"nâm trâng) 2+ NT Polyporus arcuìahus 4+ 4+ PsathyreHa sp 4+ Pleurotus pulmonatus (nâm sò trâng) 4+ 6+ Schizophyllum commune 4+ NT Stereum hirsutum 3+ Stereum lobatum 2+ 1+ Trámeles sp 3+ Trámeles corrúgala 2+ 3+ 2+ VolvarĩeHa volvacea (nãm rơm) 4+ GS.TS Trịnh Tam Kiệt định loại Hoạt độ cùa enzim xác định pH 6,5 Dấu (^) có hoại linh, iỏ lớn Ihể hoạt độ mạnh; dấu (') không biểu hoạt độ N T - mẫu không thử Từ kết quà nghiên cứư điều a (b ả n g 4), ng tim h iểu th ê m p rote inase am y la se m ộ t vài lồi n âm ăn được, thường gặp có P A A A tư n g đối cao là: nấm hucoig, n ấ m rơ m v n ấ m sò ắ n g Trư ớc hết, p ro tein ase, để xác định p hân n h ó m en z im , c h ú n g n g h iên cứu anh h ó n g cua m ộ t sô chât kim hãm đặc hiệu n hó m P A cùa ba lồi n ấ m nói trẽn C ác ch ất đ ợ c d ù n g H g C l;, I: E D T A Ánh hường chất P A củ a n ấ m đư ợc n gh iên cứu b n g p h n g p h p k h u ế c h tán trê n đĩa thạch Kết q uà thư đư ọc cho thấy tất chất kim h ã m đặc hiệu n h ó m thử k h ô n g àrứi hưỏTig đ ế n h o t độ phân giải c ua proteinase , Điều nói ỉèn protein ase loài nấm nghiên c ứ u k h ô n g th u ộ c n h ó m p ro tein ase - cy steine h o ậ c /v nhóm proteinase - kim loại m thu ộc n h ó m P roteinase - serine ho ặc /v p ro tein ase ' aspartic, v ề amylase n ấm sò trắng, n ấ m rơm , nấm hương., kết q u ả n g h iê n cứu ả nh h n g c ùa ion kim loai lên h o t đô amylolytic (A A) đư ợc xác đ ịnh b ằ n g p h n g p háp k h u ế c h tán frên đĩa th c h ba loài nấm ( b ả n e 5) ch o thấy tron a số ion kim loại thừ có ion Cu■^ Hg"^, E D T A ức chế hầ u rửiu h n to àn A A ị m ẫu nấm N hu biết hoạt độ a -a m y la s e vày'hoặc P -am ylase bị kìm h ã m ion C u ’", cẩn Ca"^ K ết quà n hận đư ọ c nói lên trono nấ m đư ợ c ng hiên cửu, nấ m sị ắ n , có m ặ t a -a r a y la s e và, p-am ylase B ả n g A n h h n g ion kim loại lên A A n ấ m sò ắ n a , n ấ m rơm nấ m h ợ n a % AA mâu có ion Đối chứng (khơna có ion) ("oAA) Nâm sò trãng Nâm rơm Nâm hươne Na" 100 100 100 100 75 Ca-* 100 100 100 Mn'" 100 85 85 100 100 0 10 Hg" 0 ¡ 1(10 Cu-' ' l'jO NT NT EDTA Các ion sử dụng dạng muối clorua với nồng dộ cuôĩ cùne hỗn hcrp la 0,02M NT - \lả u kị- SỐTT T Ghi chú: Loại ion Thi nghiệm liến hành với pH mòi trưcmg 6,5 C Nghiên cứu s ự tư n g tác g iữ a lectin enzim Kêt qu ả th ng hiệm tư n g tác lectin tách từ ro ng cải biển U lva c o n g lo b a ta (Ü LC), từ rono đại A rập Codium a rabicum (C A - C A - III) rtr Hài m iên C a lỉy sp o n g ia sp (ký h iệu L C ) với tripsin Chymotripsin vầ papain p h n g p h áp k h u ế c h tán ê n đ ĩa thạch (bảng 6) cho th lectin U lva co n g lo b a ta (U L C ) đă kìm hãm hoạt độ cùa tripsin c h y m o ip s in , n h n g lại k h ô n g ức chế hoạt độ papain, o n g đ ó lectin từ ro n a đại (C A -I C A III) từ Hài m iên (Ư L C ) h ầ u n h k h ô n g ức chế hoạt độ cùa tripsin Chymotripsin, n h n s lại kìm hãm hoạt đ ộ cua cùa papain C húng tói cũ ng đ ã th n g h iệ m tưorng tác U L C với pro tein ase a m y lase loài nấm ăn th n g gặp là: nấm sò trảng, nấm h n g n ấ m rơ m T kết q u ả nh ận đư ợc (b àn g 7) thấy rõ U L C đ ã ức chế hoạt độ cù a proteinase, không ảnh h ng đ ến h o t độ cùa am y lase loài nấ m fren B ả n g Sự ức chế h oạt độ ipsin , Chymotripsin p apain bời lectin Enzim bị ức chê Tripsin Chymotripsin Papain Lectin ULC (Lectin tCi Ulva conglobata) CA-I (lectin I tir Codium arabicum) CA-III (lectin III tit Codium arabicum) LC (lectin tit Cailyspongia sp.) _ NT Ghi chii: Dấu (+) có ức chê, ức chê mạnh, nhiêu +; dâu (-) không ức chê; NT - mẫu khône thư B ả n g 7, Ả n h h n g cùa lectin từ ro n g U h a c o n g lo b a ta (U L C ) tới hoạt đ ộ proteolytic (PA ) amyJolytic (A A ) n ấm ăn Loài nâm Nãm sò trăng {Pleurotus pulmonatus) Nấm hương (Lentinula edades) Nâm rơm ( Voharieìla vohacea) Proteinase + + ++ Amylase - Ghi chú: Dấu (+) có ức chế, ức chế mạnh, nhiều +; dấu (-) không ức chế N h trinh bày ph ần trẽn (phần B), proteinase b a loài n ấ m ãn th n g gặp th uộ c n h ó m p ro tein ase - serine tưong tự tripsin c h y m o ip sin kim hãm hoạt độ ciia p ro tein ase n ấ m n y lectin cìia ro ng lục U ìva congiobaỉa (vốn kìm hã m h o t đ ộ tripsin Chymotripsin) h ọ p ỉý có thề giải thích đư ọc T uy nhiên, tr o n g tư n e tác với enzim, lectin từ ro ng lục U lva c o n g lo b a ta biểu đặc điể m h o àn to n trái n g ợ c với lectin tách từ n ấ m mõ' tro ng nghiên cứu gần cùa chtíng [18]; lectin tách từ nấ m m ỡ k h ô n g ản h h n g tớ i h o t độ củ a tripsin Chymotripsin nhung lại làm hầu n h h oàn to n A A n ấ m sò v ề chể tư n e tác g iữ a lectin enzim , với đặc tín h liên kết đ n g , n g i ta cho rà n g tư o n g tác giữ a lectin enziiTi chi xảy với phân sacca rit enzim (n gh ĩa o n g tr n g h ợ p enzim phải g lv c o p r o te in j va nhu vặ) nguyên tác thi hoạt độ ciia e n z im k h ô n g bị ảnh h n g m e n z im đ ợ c làm bền N h n g thực tế, n g h iên cứu tương tác giữ a lectin e n z im k h c n h au [1, 2], người ta thấy m ộ t số e n z im đ ợ c làm bền, m ó t số k h c hoạt độ,enzim bị giám , cịn tr n g h ợ p thứ b a enzim thậ m chí c ịn đ ợ c h o t h o (ho ạt đ ộ enzim tăng lẽn) [7], T rư n g hợp h o ạt đ ộ e n zim bị g iả m đư ợc lý giải ỉà việc h ìn h th àn h p h ứ c hệ lectin - en zim , (khi leclin liên kêt với phần saccarit c ùa enz im q u a tru n g tâm liên kết đư ờng ) tạo s ự càn trở k h ô n g g ia n làm Ìảm lục cua enzim với chất L uận đ iể m c ũ n g đ ợ c c h ứ n g m in h m ộ t p h ầ n k hi c h ú n g tơi tiến h àn h thí nahiệiTi t u o n g tác cùa U L C VOI proteinase (kết k h n g trìiứi b y đây): lectin ức chế h o t đ ộ c ù a pro tein ase - serine (tripsin achymotripsin) k h ô n g có m ặ t L -fu co s e (đ n g ức chế đặc hiệu U L C ), n h n g cho lectin tư ơníi tác với đ n o Lfucose tn iớ c tư ng tác với e n z im thi hoạt độ enzim k h n g bị kìm h ãm (p h n g th ứ c 1) T rư n g hợp e nzim k h ô n o ph ài g lyco protein và/hoặc k±ii t n a tác với lectin, h oạt độ enz im b| giam đ an £ kẽ hồn tồn ho ạt tinh sao? T ro n e trư n g hợp chi giải th ích r ằ n e lectin ỉiẻn kết với tru n o tâm hoạt độn“ enzim c chỗ c ù a c chất h oặc liẽn kêt vị i gân tr u n g tâ m hoạt đ ộ n g cù a en zim dẫn tói sụ hảt hoạt en zim \ a ỉectin no vai trò m ộ t chất kim hãm enzim ( p h n g th ứ c 2) S ự đa d n s cấu trúc tinh chất cù a lectin c ũ n a n h enzim dẫn đẽn k hác nh au tronc tưOìig tac giOn tl'Mi’y C ách tác độnơ c úa lectin từ ro n g biển U lva c o n g lo b a ta đ ẽn p ro te in a se va am s lase có thẻ Iv iai i h t ' ' í'h ‘t I, cịn lectin từ r o n a C o d ìu m a b ic u m hài m iên (C a ìỉy sp o n g ia s p j có thê tư n g tac với papain ih eo phijirr,» I:'n : : lectin làm g iảm m n h h o ặ c k im h ã m hầ u n h hồn tồn hoạt tính c ủ a enzirn T n o tác giũ-a lectin e n z im đ ã đư ợc ứ n g d ụn g tr o n g kỹ th u ậ t E L L A ( E n z \ n i e - L ink ed - I L’.III! \ kỹ thu ật E L L A đ ợ c d ù n g đ ể x ác đ ịn h th àn h p h ầ n đ n g tro n g tư n g tác với lectin [10], (jâ n đã> :;-.c r , ■ '! enzim đ ợ c ứng d ụ n g o n g c h ữ a b ệnh th eo liệu p há p L E A P T (Lectin - directed E n z y m e - activated P ro d ru a T h erap v i lectin đ ón g vai ò ch ât định h n g ch o thuốc đư ợc hoạt h o bời e n zy m e liên kết với lectin [11] Lectin với tác d ụ n g kim hãm h o t độ c ủ a am ylase proteinase có ch ứ a ữ o n g nấ m hay sinh vật biền có thề manií lại hiệu quà đán g kể p h ò n g n g a m ộ t số b ệ n h liên quan đến rối loạn trao đổi chất đ n g hay chất đam sử d ụ n nấm hay sinh vật biển làm th ự c p h ẩm c K Ẻ T L U Ậ N T nh ữ ng kết q uả n g h iê n c ứ u n h ậ n đư ợc, rút m ột số kết luận n h sau: T ron g số loài đ ộ n g vật b iển nghiên cứu ỉectin, lectin đ ợ c ph át thấv lồi, o n o Hai miên C allyspongia sp loài ch ứ a lectin k h ô n g đ ặc hiệu n hỏ m m áu ng ời có h o t tính cao nhất, hoạt tính cùa lectin bị ức chế bời đường a-lactose L ectin từ hài m iên đ ã đư ợc tinh m ộ t p hầ n b n g p h n g ph áp lọc phân từ qua cột S ep had ex G-IOO sấc ký trao đổi ion cột D E A E -c e l (độ tăng lên g ần 10 lần) Đã điều tra 18 loài nấm m ọ c tự n hiên đ ợ c nuòi trồng h oạt độ am y lo lytic (A A ) hoạt độ pro teol\1ic (PA), phát th có m ặ t c A A ỡ 16/18 loài (88,9% ) P A 12/16 loài (7 5% ) K ết qu n gh iên cứu tinh chất proteinase am ylase loài n ấ m ãn th n g g ặ p là: n ấ m sò trắng, nấm h n g n ấm r o m ch o thấy proteinase ỏ loài nấm ên thuộc n h óm pro teinase - serine v à/ho ặc p roteinase - aspartic, a m y la se a - a m y la s e h oặc/v Ị3-amylase KJii tư ng tác với enzim , lectin tách từ ro n g biển U lva c o n g lo b a ta kim hã m h o ạt độ củ a tripsin chymoứipsin proteinase nấm sò trắng, nấm hương nấm rơm Idiông ảnh hường tới hoạt độ cùa papain amylase loài nấm trên, tro n g lectin tách từ ro ng đại Ả rập C o d iu m a b icu m hải m iê n C a lly sp o n g ia sp k hô ng ảnh h n g đến ho ạt độ c ủ a ip s in c h y m o trip sm n h n g lại kìm h ã m rõ nét hoạt độ cúa papain T À I L IỆ U T H A M K H Ả O Dulaney J.T Mol Cell biochem , , - 63, E in h o ff w and R u d ig er H In te c tio n o f th e a -M a n n o sid a se fr o m C a n m a lia e n sifo rm is w ith the le c tin fr o m ihe sam e plant, C onoravaH n A Biol C hem H o p p e - Seyler, 1986, 67 , 943 - 949 G raham K., H ellen K., Ezzell J., D o yle R J E n zym e - L in k e d L e c tin s o r b e n t A s s a y (E L L A ) f o r D e te c tin g B a cillu s anthracis J Im m unol 1984, V.3, N°3, - 2 G oldstein I.J and P o retz R D Jso la iio n , p h y sic o - ch em ic a l c h a c te riz a tio n a n d c a rb o h y d te b in d in g sp e cificity’ o f ¡eclins In: T he L ectins - properties, functions and a pp lica tion s in B io lo g y and M edicine N e w Y o rk , Acad Press, 1986 K aplan R.etal J B ioch em istry 1977.16, 4297-4303 Leluk J., P h am Thi T ran C hau, J K ielezaw a X X I M eet.P ol B io c h e m S o c K k o w , P oland Abstract, 1995 Lorenc - K u bis I a n d B o g - H a n se n T c A c tiv a tio n o f A c id p h o s p h a ta s e fr o m P o a p r a ie m is by b in d in g 10 ¡ectins In; Lectins - B io lo g y , B io chem istry, clinical B io c h e m istrv B o s - H an se n I c (eds) w de G ruy ter Berlin, 1980 Lowry O H e t a l J B i o l c h e m 1951 ,2 M o so lo w v.v P roteolyt}!skie fe r m e n ti Izd "N auka", M o s k v a , 1971, 10 M aierhofer c R o h m e r K a nd W ittm a n n V P ro b in g m u itiv a le n t c a rb o h v d r a te - leciin in tera c tio n s by an En~)'me - L in k e d le c tin A s s a y e m p lo y in g c o v a le n tlv im m o b ilize d ca rb o h y d te s B io o a n ic & M edicinal C hemistry 00 7, V 15, N “24 11 R o binson M A , C h arlto n S T and others L E A P T : L e c tin - d ir e c te d E n zy m e - A c tiv a te d P ro d ru g Therapy Proc Natl, Acad Sci U S A Ju ne, 20 04 12 N g u y ễ n Q u ố c K h a n s N g u y ề n Thị Thịnh M ộ! vài' tíìih ch ắ t kh n ă n g k h a i ih ả c le a i n từ hú! đ â u ¡-¿ìiíi (P so p h o ca rp u s te tra g o n o ỉo b u s) T p chí klioa học - Đại học T ổ n ẹ h ợ p Hà Nội 1985, số 46 - 50 13 Đ ỗ N gọ c Liên, T r n g V ã n C h âu J H oebeke N g h iên cihi so sá n h m ộ t so đ ă c lín h p h n íư cua Ỉ Ldi n l híU loại đậu Canax-aìia g la d ia ta v C ana\'alia ensifonnis Di tru> ẻn học vá U n ° dụnii 1995, 46 - 4V 14 N g u y ễ n Lệ Phi, N g u v ễ n \ ' ă n Lợi P h m Q u an g Túng, Đ N s ọ c Liên X í^hien ctr:t h n g cầu n g i c ù a m ộ t 50 th ự c vậ t ¡àm d ợ c Hệu I 'lệt S a m h Di tru y ẽn học \ a L na dụiit; ! í^ :,1J , 15 BÙI P h n g T huận, J H o eb ek e, J L amy c ấ u trúc p o ỉy m e củ a ¡ectin sam biển Tachy-pìeus íridìtatus: ĩ ự kề! hợ p n h ữ n g đ ặ c tính lectirì k h c n h a u v i p ro te in h o t đ ộ n g - c , T p chí Sinh học, 1995, số tập 17 16 N g u y e n D iệu T h uý , C ao P h n g D ung, N g u y ễ n Q u ốc K hang K ế t q u ả đ iề u tra lectin lừ nhitvễn thé l 'lệr S'iini T ạp chí Sinh học, 1995, tập 17, số 17 L ê N g ọ c T ú v n n k £ « z í w v / s m / vậ/, tập 1, N X B Khoa học K ỹ thuật Hà N ội 1982 18 N gu yên Q u a n g V inh N g h iê n u đ iê u tra le c tin e m im (p ro te in a za a m ila ia m ộ t s ố lo i nam lớii nioc lự n hiên v đ ợ c n u ô i trồ n g N h ữ n g vấn đề nghiên cứu bàn tro ng k h o a học sống B áo cáo kJioa học Hội nẹhị toàn q uố c 2007 "N ghiên c ứ u c b ả n tro ng kh oa h ọc sống" Q u y N h n 8/2007, N X B K h oa học Kỹ thuật Hà Nội, 20 07 , tr 876 - 879 LỜI C Ả M O N C ô n g trình đ ợ c h o n thàn h với hỗ trợ củ a đề tài Q T - - Đại học Q uốc gia Hà Nội SUM M ARY Interactions o f lectins and e n zym es: A n atte m p t to stu d y on the in tera ction o f the lectins from lob io n ts with p roteinases an d am y la ses N g u y e n Q u a n g V inh U n iv ersity o f S cien ce, V N U H anoi Five species o f m arin e coral a n d sponge w ere e x a m in e d for lectins (h em ag g lu tin in s) an d h e m a g g lu lin a tm g activity (H A A ) w as found in extracts o f species o f w h ich C a lly sp o n g ia sp is the sp ecies c o ntainin g A B O blood group non-specific lectin with the h ig h e st H A A Lectin from this sp o n g e w as p artially purified b y s e p h ad ex G-lOO gel filtration and D E A E -c e llu lo s e ion -e xch an ge ch ro m a to g p h y (the p u rity o f the p rep ara tion is increased in a b o u t 10 times) and its H A A is inhibited by a-L actose Eighteen species o f m u s h ro o m s g ro w in g in n ature an d cu ltiv ated w ere sc r e e n e d for presence o f pro teo ly tic and am ylolytic activities (P A & A A ) a n d A A w as found in 16/18 species (8 ,9 % ) and PA in 12/16 species ( 15%) Characteristics o f proteinase an d am y lases from P leu ro tu s p u lm o n a tu s , L e n tin u la ed o d es an d V o lva riella v o lv a c e a (three edible m u s h ro o m s ) w ere e stim a ted an d the results ob tain ed s h o w th at p ro tein ase s in th ese m u s h ro o m s b elo n g to group p roteinase-serine an d /o r p roteinase-aspartic, an d am y la se s are a - a m y la s e a n d /o r p-am ylase Studies o f interaction o f the lectins an d e nzy m es s h o w e d th a t lectin fro m m a rin e alga U lva c o n g lo b a ta have no effect on activity o f a m y la se s o r p ap ain , bu t inhibits activity o f tripsin and c h y m o trip sin a nd th at o f p ro te in a se s in three m u sh ro o m abo ve m en tio n ed , w h ile the lectin isolated from C o d iu m a b ic u m an d C a lly sp o n g ia sp has alm o st no influence on activity o f tripsin an d a -c h y m o trip sin , but m a rk e d ly in hibits the activity' o f papain N g i th ầ m định nội d u n g k h o a học: G S TS Đ ỗ N ẹ ọ c Liên PHIÉU ĐĂNG KÝ KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u KH-CN Tên đề tài (hoặc dự án): "Nghiên cứu tương tác lectin enzim amylase proteinase khả ứng dụng" Mã số: QT-08-67 Cơ quan chủ trì đề tài; Trường Đại học Khoa học Tự nhiên r Đại học Quôc gia Hà Nội Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Tel: 043 858 5277 Cơ quan quản lý đề tài: Đại học Quốc gia Hà Nội Địa chỉ: 144 Đường Xuân Thuỷ, Quận cầu Giấy, Hà Nội Tel: 043 754 7372 Tơng kinh phí thực chi: 20.000.000đ Trong đó: - Từ ngân sách Nhà nước: 20.000.000đ - Kinh phí trường: - Vay tín dụng: - Vốn tự có: - Thu hồi: Thòi gian nghiên cứu: năm Thòi gian b ắ t đ ầu : Từ tháng 04/2008 Thòi gian kết thúc: Năm 2009 Tên cán phối họp nghiên cứu: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Sô đãng Sô chứns nhận đăng Bảo mật: ký tài Ngày: đề ký kết nghiên cứu a Phô biên rộng rãi: b Phổ biến hạn chế: c Bảo mật: Tóm tắt kết nghiên cứu: - Đã thu thập loài động vật biển 18 loài nấm lớn mọc tự nhiên nuôi trồng địa bàn Hà Nội sổ tỉnh thành - Đã phát thấy lectin loài số ỉoài động vật biển thu gom vùng biển Quảng Ninh, lồi có hoạt tính cao Hải miên (Callyspongia sp.) Lectin loài bền nhiệt, hoạt độ bị ức chế đường lactose Đã tinh phần lectin từ Hải miên phương pháp lọc phân tử qua cột Sephadex G-100 bàng sắc ký trao đổi ion cột DEAE-cellulose (độ tăng lên gần 10 lần) - 18 loài nấm lớn mọc tự nhiên nuôi trồng nghiên cứu điều tra hoạt độ proteol>tic (PA) amylolytic (AA) phát thấy AA 16/18 loài (chiếm 88,9%) PA 12/16 loài (chiếm 75%) - Thử nghiệm phương pháp Wolgemuth nhựa cho thấy dùng phương pháp cải tiến để xác định hoạt độ amylase - Kết nghiên cứu tính chất proteinase amylase loài nấm ăn thường gặp là: nấm sò trắng, nấm hương, nấm rơm, cho thấy proteinase lồi nâm thuộc nhóm proteinase - serine và/hoặc proteinase-aspartic, cịn amylase a-amylase và/hoặc ß-amylase - Khi tương tác với enzim, lectin từ rong biển Uỉva conglobata kìm hãm hoạt độ proteinase nấm sị trắng, nấm hương nấm rợm, khơng ảnh hưởng tới hoạt độ amylase loài nấm Lectin tách từ Hải miên Caỉỉyspongia sp khơng ảnh hưởng đến a-chymotripsin lại kìm hãm rõ nét hoạt độ papain Kiến nghị quy mơ đối tượng áp dụng nghiên cứu: Nghiên círu lectin enzim (trong có proteinase amylase) đối tượng phong phú, đầy tiềm giới nấm sinh vật biên cần khuyến khích nhằm tìm hợp chất thiên nhiên đặc hiệu dủn2 sinh học y học, để sử dụna họp lý có hiệu nơn tài nsuvên thiên nhiên cịn khám phá Nghiên cứu tương tác chất (như tương tác giừa lectin enzim) lừ thực nghiệm in vitro tiến tới thư nshiệm in vivo (iro!m LO thê sinh vật), giải pháp hữu hiệu để tìm nguồn "thực phânì chức nãna" hay "thuốc" từ neuyên liệu tự nhiên trons điều trị hệnh kê ca hênh nan \ đái tháo đường, ung thư, bệnh gut Thii truong Chủ tịch Hội Chủ nhiệm đề Thủ trưởng CO’ quan đồng đánh giá quan chủ trì đề tài tà i quản lý đề thức tài Họ N guyên Q uang Nguyên H oàng N guyên Xuân tên Vinh Lương H uấn TS G S.TSK H Học hàm ĐỐC TLGI/ kh )A HỌC ■CÓNG NG^ PHÓ TRI (ỞNG BAN học vị í Ký ậ tên Đónẹ dấu 7/c NCA 'ư KH\Ìn \ ^' V V * ỉ * - '•, r ỵ P ỈS T Ỉ:y ^ ■Ậỉi% Ẩể Ị Ì/Ẩ