Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang giao đề tài, dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình làm luận văn Tôi in g i lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện ki m nghiệm An toàn vệ sinh th c ph m Quốc gia, anh chị Khoa chất lượng ph gia chất h trợ chế biến th c ph m - Viện Ki m nghiệm an toàn vệ sinh th c ph m Quốc gia quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho học tập nghiên c u môi trường đại Tôi in bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giảng dạy khoa Hố, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích cho tơi kiến th c quý giá trình học tập th c đề tài Cuối c ng, in g i lời biết ơn sâu s c tới gia đình, bạn b ln bên cạnh chia s kh khăn, động viên giúp đỡ học tập sống Do thời gian th c đề tài c hạn nên không tránh thiếu s t, mong nhận ý kiến đ ng g p c a thầy cô bạn đ luận văn hoàn thiện Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015 Học viên Vũ Thị Hƣơng Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu chung anthocyanin 1.1.1 Cấu trúc h a học c a anthocyanin 1.1.2 Tính chất c a anthocyanin 1.1.3 Tác d ng c a anthocyanin 1.1.4 S phân bố c a anthocyanin 1.2.Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin 1.2.1 Phương pháp pH vi sai 1.2.2 Phương pháp s c ký lỏng hiệu cao (HPLC) CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM .13 2.1 Mục tiêu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu 13 2.4 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 13 2.4.1 Chất chu n 13 2.4.2 Hoá chất 13 2.4.3 Thiết bị 14 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.6 Thẩm định phƣơng pháp 16 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Tối ƣu điều kiện xác định anthocyanin hệ thống HPLC 17 3.1.1 Chọn detector 17 3.1.2 Chọn bước s ng phát 18 3.1.3 Chọn cột tách 19 3.1.4 Chọn th tích bơm mẫu .20 3.1.5 Khảo sát thành phần pha động 21 3.1.6 Khảo sát nồng độ a it pha động 22 3.1.7 Khảo sát chương trình r a giải 23 3.1.8 Khảo sát tốc độ pha động 27 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 28 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng c a thời gian đến trình th y phân .30 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng c a nhiệt độ đến trình th y phân 31 3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu .33 3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 34 3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 34 3.3.2 Khoảng tuyến tính .36 3.3.3 Độ lặp lại .38 3.3.4 Độ thu hồi 40 3.4 Ứng dụng phƣơng pháp xác định anthocyanin số rau củ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc c a chất phổ biến nh m anthocyanin Bảng 1.2: Thông tin chung chất nghiên c u .4 Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng c số mẫu th c vật Việt Nam [7] Bảng 3.1: Ảnh hưởng c a cột tách đến độ rộng đáy pic (W) thời gian lưu (tR) 20 Bảng 3.2: Ảnh hưởng c a thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) c a del, cya, pel 21 Bảng 3.3: R a giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng 23 Bảng 3.4: Chương trình gradient 24 Bảng 3.5: Chương trình gradient 25 Bảng 3.6: Chương trình gradient 25 Bảng 3.7: Chương trình gradient 26 Bảng 3.8: Ảnh hưởng c a chương trình gradient đến hệ số đối ng pic 27 Bảng 3.9: Ảnh hưởng c a tốc độ dòng đến thơi gian lưu chiều cao pic 27 Bảng 3.10: Hàm lượng chất theo thời gian th y phân 31 Bảng 3.11: Hàm lượng chất nhiệt độ th y phân khác 32 Bảng 3.12: Hàm lượng chất tỷ lệ dung môi chiết khác 33 Bảng 3.13: Nồng độ diện tích pic trung bình c a chất 36 Bảng 3.14: Kết so sánh giá trị a với giá trị c a phương trình đường chu n c a anthocyanin 38 Bảng 3.15: Độ lặp lại mẫu b p cải tím 39 Bảng 3.16: Độ lặp lại mẫu khoai lang tím 39 Bảng 3.17: Độ thu hồi mẫu rau dền đỏ 40 Bảng 3.18: Độ thu hồi mẫu c dền .41 Bảng 3.19: Giới hạn phát giới hạn định lượng c a chất phân tích 43 Bảng 3.20: Kết phân tích số mẫu rau c .43 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc aglycon c a anthocyanin Hình 1.2: S ph thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 14 Hình 3.1: Phổ hấp th c a delphinidin 18 Hình 3.2: Phổ hấp th c a cyanidin 18 Hình 3.3: Phổ hấp th c a pelargonidin 18 Hình 3.4: S c ký đồ c a dung dịch chu n chất với cột s c kí .19 Hình 3.5: S c ký đồ c a dung dịch chu n chất với cột s c kí .20 Hình 3.6: S c ký đồ r a giải anthocyanin với thành phần pha động nước ACN 21 Hình 3.7: S c ký đồ del, cya nồng độ a it trifloa etic khác 22 Hình 3.8: S c ký đồ c a h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 24 Hình 3.9: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 25 Hình 3.10: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 25 Hình 3.11: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 26 Hình 3.12: Hàm lượng chất th y phân thời gian khác (60, 90, 120, 150 phút) 30 Hình 3.13: Hàm lượng chất nhiệt độ th y phân khác 32 Hình 3.14: Hàm lượng chất theo phần trăm HCl N dung môi chiết mẫu 33 Hình 3.15: S c ký đồ dung dịch chu n h n hợp .35 Hình 3.16: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin 35 Hình 3.17: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin thêm chu n h n hợp .35 Hình 3.18: Đường chu n bi u thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ delphinidin .36 Hình 3.19: Đường chu n bi u thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ cyanidin .37 Hình 3.20: Đường chu n bi u thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ pelargonidin .37 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN Tiếng Anh Tiếng Việt Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Community tích th c CYA Cyanidin Cyanidin DEL Delphinidin Delphinidin AOAC HPLC High performance liquid chromatography S c ký lỏng hiệu cao High performance thin layer S c ký lớp mỏng hiệu chromatography cao LC- Liquid chromatography tandem mass S c ký lỏng ghép khối phổ MS/MS spectrometry hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MeOH Methanol Metanol PDA Photodiod array Detector mảng đi-ốt quang PEL Pelargonidin Pelargonidin ppm Parts per million Phần triệu R Relative coefficient Hệ số tương quan RSD Relative standard deviation Độ lệch chu n tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chu n S/N Signal to noise ratio TFA Trifloroacetic acid Axit Trifloaxetic UV-VIS Ultraviolet-Visible T ngoại khả kiến HPTLC Tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu MỞ ĐẦU Ngày nay, ảnh hưởng c a điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo l ng hay s d ng th c ph m ch a nhiều chất o y h a tạo điều kiện làm gia tăng gốc t do, kéo theo sau đ s gia tăng dạng o y hoạt động Các dạng o y hoạt động gia tăng, gây nhiều phản ng bất lợi, tổn thương cho th nguyên nhân c a nhiều bệnh nan y Những nghiên c u tìm hi u chất c khả chống o y h a mang lại tác d ng tốt, c lợi cho s c khỏe người ngày phát tri n Chất chống o y h a “chiến binh tốt” chống lại chất độc hại - gốc t Chúng hình thành cách t nhiên sản ph m ph c a trình sống liên quan tới o y Các chất chống o y h a c khả giải ph ng điện t , chúng vô hiệu h a khả oxy h a c a gốc t ngăn chặn chúng công tế bào khỏe mạnh Đ bảo vệ mình, th ln t sản sinh chế chống o y h a thiết yếu, với thời gian chúng dần trở nên hiệu theo tuổi tác Đây lý mà việc s d ng chất chống o y h a th c ph m ch a chất chống o y h a quan trọng [3], [11] Ngày nay, th c ăn không đảm bảo đ calo, ngon, sạch, mà phải ch a hoạt chất sinh học t nhiên cần cho s c kho s c đẹp, không điều n ch c hoạt động c a phận th , tạo cho người khả miễn dịch cao, chống s lão hố, tăng tuổi thọ, mà cịn giúp phòng chống số bệnh, k ung thư Theo nghiên c u hợp chất anthocyanin có hoạt tính tốt như: chống viêm, chống vữa động mạch, c chế đông t ti u cầu, chống ung thư, thúc đ y hình thành cytokin điều hịa phản ng miễn dịch, c hoạt tính chống o y h a mạnh [21], [22], [28] Trên giới c nhiều quy trình ác định hàm lượng tổng anthocyanin hay hoạt chất nh m anthocyanin kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LCMS [17], [24], [31] Tại Việt Nam công bố số nghiên c u ác định hàm lượng anthocyanin th c vật hay th c ph m [2], [7] Hầu hết phương pháp phân tích ác định anthocyanin tổng phương pháp UV-VIS c độ ác khơng cao Việc phân tích riêng l hợp chất nhóm anthocyanin đối tượng mẫu th c vật sở đ đánh giá hoạt tính chống o y hố c a chất nhóm, đề uất nguồn nguyên liệu cho chế biến th c ph m ch c Xuất phát từ th c tiễn trên, đặt vấn đề nghiên c u đề tài: “Xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký” Với m c tiêu sau đây: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Áp dụng quy trình kỹ thuật xây dựng phân tích số mẫu rau thị trường 75 /17.755/439730 /14.570/2296703 mAU 520nm,4nm (1.00) /0.252/1007 /0.548/1176 /9.749/46793 50 25 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A5 Nền mẫu bắp cải tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 9,749 14,570 17,756 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin 75 /17.748/498252 /14.575/2510458 mAU 520nm,4nm (1.00) /0.626/1107 /9.755/48511 50 25 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A6 Nền mẫu bắp cải tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 9,756 14,575 17,748 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin 75 /17.776/496118 /14.601/2475941 mAU 520nm,4nm (1.00) /9.797/50580 50 25 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A7 Nền mẫu bắp cải tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 9,797 14,601 17,776 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin Độ lặp lại mẫu củ khoai lang tím mAU 520nm4nm (1.00) /13.568/28502 /17.539/8245 -1 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A8 Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 13,568 17,539 Chất phân tích cyanidin pelargonidin mAU 520nm4nm (1.00) 12.5 7.5 5.0 /17.571/8807 /13.595/41473 10.0 2.5 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A9 Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 13,596 17,571 Chất phân tích cyanidin pelargonidin /13.078/12953 /13.597/32914 /17.563/8863 mAU 520nm4nm (1.00) 5.0 2.5 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A10 Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 13,597 17,563 Chất phân tích cyanidin pelargonidin mAU 520nm4nm (1.00) 7.5 5.0 /17.609/8715 /13.646/42393 10.0 2.5 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A11 Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 13,646 17,609 Chất phân tích cyanidin pelargonidin mAU 520nm4nm (1.00) 5.0 2.5 /17.562/8900 /13.661/39041 7.5 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A12 Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 13,661 17,562 Chất phân tích cyanidin pelargonidin mAU 520nm4nm (1.00) 5.0 2.5 /17.583/8886 /13.121/19538 /13.700/36601 7.5 0.0 -2.5 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A13 Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 13,700 17,583 Chất phân tích cyanidin pelargonidin mAU 520nm4nm (1.00) 5.0 2.5 /17.572/9001 /13.134/17360 /13.708/35092 7.5 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 Hình A14 Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần Thời gian lưu (phút) 13,708 17,572 Chất phân tích cyanidin pelargonidin Phụ lục B: Khảo sát độ thu hồi phƣơng pháp /13.811/41436 mAU 520nm,4nm (1.00) /9.032/25421 /17.939/43574 Độ thu hồi mẫu rau dền đỏ -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B1 Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 9,032 13,811 17,939 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /13.808/38570 mAU 520nm,4nm (1.00) /9.063/24679 /17.925/40133 Thời gian lưu (phút) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B2 Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần Thời gian lưu (phút) 9,063 13,808 17,925 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /9.045/26958 /17.936/46025 /13.800/42037 mAU 520nm,4nm (1.00) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B3 Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 9,015 13,800 17,935 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /13.914/83952 mAU 520nm4nm (1.00) /9.145/55358 /18.040/93666 Thời gian lưu (phút) -1 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B4 Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần Thời gian lưu (phút) 9,145 13,914 18,040 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /9.248/56686 7.5 /18.101/93192 /13.983/82613 mAU 520nm4nm (1.00) 5.0 2.5 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B5 Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 9,218 13,963 18,101 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /13.906/80401 mAU 520nm4nm (1.00) /9.169/55646 /18.011/86438 Thời gian lưu (phút) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B6 Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần Thời gian lưu (phút) 9,169 13,906 18,011 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /8.822/21652 /13.618/34562 mAU 520nm,4nm (1.00) /17.755/39343 Độ thu hồi mẫu củ dền -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B7 Nền mẫu củ dền lặp lần 8,822 13,618 17,756 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /13.721/35575 mAU 520nm,4nm (1.00) /8.972/21676 /17.833/38552 Thời gian lưu (phút) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B8 Nền mẫu củ dền lặp lần Thời gian lưu (phút) 8,972 13,721 17,833 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /8.909/22501 /17.833/39520 /13.709/35334 mAU 520nm,4nm (1.00) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B9 Nền mẫu củ dền lặp lần 8,909 13,709 17,833 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /13.681/35627 mAU 520nm,4nm (1.00) /8.906/21711 /17.803/39691 Thời gian lưu (phút) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B10 Nền mẫu củ dền lặp lần Thời gian lưu (phút) 8,906 13,681 17,803 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /8.808/48934 /17.750/80747 /13.588/70965 mAU 520nm,4nm (1.00) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B11 Nền mẫu củ dền lặp lần 8,808 13,588 17,750 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin /13.710/71815 mAU 520nm,4nm (1.00) /8.945/50525 /17.785/81024 Thời gian lưu (phút) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B12 Nền mẫu củ dền lặp lần Thời gian lưu (phút) 8,945 13,710 17,760 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin Phụ lục C: Sắc kí đồ phân tích mẫu thực BCT01 mAU 520nm4nm (1.00) 75 /17.549/725424 /14.210/2035526 100 /9.183/60901 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Thời gian lưu (phút) 9,183 14,210 17,549 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin BCT02 mAU 520nm,4nm (1.00) 90 80 70 50 40 /9.082/29168 30 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 /17.437/329676 /14.133/906004 60 15.0 17.5 Thời gian lưu (phút) 9,082 14,133 17,437 Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin KLT01 /13.317/1147184 mAU 520nm4nm (1.00) 50 40 30 /17.528/25394 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Thời gian lưu (phút) 13,317 17,528 Chất phân tích cyanidin pelargonidin 17.5 KLT02 mAU 520nm,4nm (1.00) 15.0 10.0 7.5 5.0 pel/18.049/23066 /12.423/36951 cya/13.072/105504 12.5 2.5 0.0 -2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Thời gian lưu (phút) 13,072 18,049 Chất phân tích cyanidin pelargonidin 17.5 RD01 mAU 520nm4nm (1.00) /14.194/34784 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Thời gian lưu (phút) 14,194 Chất phân tích cyanidin 15.0 17.5 15.0 17.5 RD02 mAU 520nm,4nm (1.00) -1 -2 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 -Mẫu RD02 khơng phát chất phân tích CD01 mAU 520nm4nm (1.00) 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 17.5 -Mẫu CD01 khơng phát chất phân tích CD02 mAU 520nm,4nm (1.00) -1 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 -Mẫu CD02 khơng phát chất phân tích ... u đề tài: ? ?Xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký” Với m c tiêu sau đây: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký lỏng... phân tích hàm lượng anthocyanin số lồi th c vật Tác giả trình bày số dung môi tách chiết anthocyanin kết ác định hàm lượng anthocyanin số nguyên liệu tươi phương pháp pH vi sai Hàm lượng anthocyanin. .. HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI