Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (semliki forest virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở việt nam

Biểu hiện protein tái tổ hợp đặc biệt là các protein thụ thể kết cặp G-protein G-protein coupled receptor, viết tắt là GPCR phục vụ hữu ích cho các nghiên cứu phát triển thuốc, tìm hiểu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC

LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI

FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC

LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 604270

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 3

1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm 3

1.1.2 Các hệ thống vector 4

1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein 9

1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 13

1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV) 13

1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản 14

1.2.3 Tiềm năng ứng dụng khác của hệ vector SFV 17

1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp 28

2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit 29

2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân dòng 29

2.2.4 Thiết kế mồi 30

2.2.5 Khuếch đại gen nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 31

2.2.6 Cắt ADN sử dụng enzym giới hạn và chống tự nối/đóng vòng 31

2.2.7 Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit 32

2.2.8 Phản ứng nối các đoạn ADN 33

2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp 35

3.5 Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận 52 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt 53 Tài liệu tiếng Anh 53 Tài liệu tiếng web 57 PHỤ LỤC

Hình 1 Bốn họ thụ thể chính 3

Hình 2 Quy trình và thời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện khác nhau 9

Hình 3 Hệ gen SFV tự nhiên 13

Hình 4 Cấu trúc vector pSFV cơ bản 15

Hình 5 Cấu trúc vector pHelper 15

Hình 6 Mô hình hoạt động của hệ vector SFV 16

Hình 7 Cấu trúc của vector pJET1.2 23

Hình 8 Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1 25

Hình 9 Trình tự vị trí nhân dòng đa điểm của đoạn O-M7 25

Hình 10 Sơ đồ nghiên cứu tạo hệ vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8 27

Hình 11 Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cải tiến 27

Hình 12 Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cơ bản 28

Hình 13 Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α 35

Hình 14 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã vỏ capsit của SFV 38

Hình 15 Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV 39

Hình 16 Vị trí của đoạn chèn thứ 2 trong pHelper 39

Hình 17 Ảnh điện di đoạn chèn 2 trên gel agarrose 1% 40

Hình 18 Ảnh điện di sản phẩm colony PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vùng cải biến 41

Hình 19 Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7 42

Hình 20 Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8 43

Hình 21 Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA polymerase 43

Hình 25 Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8 48 Hình 26 Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 50 Hình 27 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 51

Bảng 1 Một số promoter được bổ sung vào các vectơ biểu hiện 6

Bảng 2 Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực 8

Bảng 3 Các vị trí cắt của một số protease phổ biến 8

Bảng 4 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 5 Trình tự các oligonucleotit sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 6 Phản ứng cắt với enzym giới hạn 31

Bảng 7 Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN 32

Bảng 8 Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng 33

Bảng 9 Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính 33

Bảng 10 Điều kiện của phản ứng nối linker 34

Bảng 11 Tần số biến nạp của một số lô tế bào khả biến 36

Bảng 12 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV 38

Bảng 13 Thành phần và điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 2 40

Bảng 14 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8 41

Bảng 15 Quy trình cho phản ứng nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho thụ thể NK1 44

Bảng 16 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI 44

Bảng 17 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV đã mở vòng bằng XhoI 45

Bảng 18 Thành phần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vòng của pSFV 46

Bảng 19 Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính 47

Bảng 20 Quy trình mở vòng pSFV cải biến và kiểm tra hiệu suất mở vòng 48

Bảng 21 Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến 49

Bảng 22 Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp pSFV-NK1 50

ADN Axit deoxyribonucleic

bp Base pair (Cặp bazơ nitơ)

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Axit ethylene diamine

tetraacetic) GPCR Thụ thể kết cặp G- protein

kb kilobase (= 1000 bp)

LB Lubertani Broth

NK1 Neurokinin-1

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) ARN Axit ribonucleic

SFV Semliki Forest Virut

SOC Super Optimal broth with Catabolite repression

TAE Đệm Tris/Axit acetic/EDTA

BẢNG VIẾT TẮT CÁC AXIT AMIN

Ser (S): serin Thr (T): threonin Try (W): trytophan

MỞ ĐẦU

Mặc dù là một ngành mới ra đời nhưng những thành tựu mà công nghệ sinh học phân tử (molecular biotechnology) đã mang lại là rất lớn Những bước phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học phân tử trong các lĩnh vực như

điều chế dược liệu, tạo ra kháng thể đơn dòng, sản xuất vacxin, thành công trong

giải trình tự hệ gen người đã góp phần đắc lực giúp con người trong công cuộc

đấu tranh chống bệnh tật và không ngừng cải thiện, nâng cao chất lượng cuộc

sống

Ngày nay, biểu hiện protein tái tổ hợp là một phần quan trọng của công nghệ sinh học phân tử với nhiều ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược Biểu hiện được protein quan tâm trên tế bào động vật và người có thể giúp thiết lập những mô hình điều trị bệnh bằng liệu pháp gen, bao gồm cả điều trị ung thư Biểu hiện protein tái tổ hợp đặc biệt là các protein thụ thể kết cặp G-protein (G-protein coupled receptor, viết tắt là GPCR) phục vụ hữu ích cho các nghiên cứu phát triển thuốc, tìm hiểu cấu trúc và chức năng sinh học của các thụ thể, qua đó làm sáng tỏ các con đường truyền tin nội bào Các protein thụ thể kết cặp G-protein liên quan trực tiếp đến sự phát sinh nhiều bệnh lý ở người, là “đích” có vai trò quan trọng bậc nhất trong các chương trình sàng lọc các dược chất mới Các nhà khoa học luôn mong muốn xây dựng được các hệ thống biểu hiện GPCR chủ động ở mức độ cao để dùng cho các nghiên cứu dược lý học phân tử, các thí nghiệm sàng lọc để phát hiện các dược chất mới và phát triển dược phẩm

Trên thế giới, một số hệ thống biểu hiện GPCR tiềm năng đã được thiết lập và thử nghiệm, chẳng hạn như hệ thống dịch mã phi tế bào, các hệ thống

biểu hiện ở tế bào nhân sơ (E.coli và Halobacterium salinarum) và nhân chuẩn

(nấm men, côn trùng và động vật có vú) Một số GPCR đã được biểu hiện thành công trên các hệ thống này ở mức độ cao từ 1 đến 10 mg/l môi trường nuôi cấy [19] Trong các hệ thống biểu hiện trên, hệ thống sử dụng hệ vector Semliki Forest Virut (SFV) được ghi nhận là một trong những hệ thống có nhiều đặc

điểm ưu việt và giàu tiềm năng ứng dụng [34] Tuy vậy, hiện nay SFV không

được thương mại hóa rộng rãi do sự độc quyền sử dụng tại một số phòng thí

nghiệm của các hãng dược phẩm (như Roche, Novartis)

Với tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực sinh – y – dược và hệ vector SFV cơ bản được tặng từ GS Kenneth Lundstrom (hãng dược phẩm Roche, Thụy Sĩ) và nguồn cADN mã hóa cho thụ thể kết cặp G-protein neurokinin 1 (NK1) của người Việt Nam đã được phân lập và nhân dòng thành công từ đề tài

ĐT-PTNTĐ.2011-G/04, chúng tôi đề xuất và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam” với mục tiêu lâu dài là xây đựng được hệ thống biểu

hiện các protein GPCR có thể được dùng như một công cụ công nghệ sinh học hiệu quả trong các nghiên cứu về sinh học thụ thể ở người Việt Nam sau này,

đồng thời phục vụ cho các nghiên cứu dược lý học, sàng lọc và phát triển dược

phẩm ở cấp độ phân tử và tế bào

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR)

1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm

Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào, truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tin nội bào dẫn đến đáp ứng

tế bào giúp cơ thể đáp ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường Để thực hiện

được chức năng đó, thụ thể có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hoặc một số

phân tử tín hiệu đặc thù được gọi là phối tử (ligand) và phức hệ “ligand – thụ thể” sẽ khởi đầu một quá trình truyền tin nội bào và gây nên đáp ứng tế bào [3]

Có 4 họ thụ thể chính (Hình 1), trong đó thụ thể kết cặp G-protein (viết tắt là GPCR) là họ protein lớn và đa dạng nhất ở người [33] Thụ thể kết cặp G-protein là nhóm thụ thể xuyên màng sinh chất và hoạt động nhờ sự kết cặp với một loại protein hoạt động bởi liên kết với GTP (tức là G-protein) GPCR dẫn truyền tín hiệu cho nhiều dạng phối tử, bao gồm các hóc môn, peptit thần kinh, các chemokine…Trong cơ thể, các GPCR được biểu hiện trên hầu hết các kiểu

tế bào và ước tính có đến 1000 GPCR khác nhau ở người [52]

Hình 1 Bốn họ thụ thể chính (nguồn:Gunnar Schulte, 2008 [18])

Sự thay đổi về mật độ cũng như trạng thái hoạt hóa của các GPCR là nguyên nhân trực tiếp gây nên nhiều bệnh cấp tính và mãn tính như tiểu đường, các bệnh tim, trầm cảm, viêm nhiễm và ung thư [31] Các GPCR là đích tác

động chính của hơn 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng trong điều trị

Riêng năm 2001, nhóm thuốc này đem đến doanh thu trên 30 tỷ USD và ước tính con số hiện nay còn cao hơn [25]

Mặc dù GPCR có ý nghĩa thực tiễn to lớn song có hai trở ngại lớn khi sử dụng các GPCR tự nhiên (native) trong các nghiên cứu dược lý học phân tử và sàng lọc thuốc Thứ nhất là các GPCR tự nhiên thường chỉ được biểu hiện ở mức

độ rất thấp (khoảng vài fmol/mg protein màng tế bào) nên thường không sẵn có

để dùng cho các thí nghiệm sàng lọc Thứ hai là trong các mô hình thử nghiệm ở

các động vật thí nghiệm, các GPCR thường đồng thời tồn tại ở nhiều dạng phụ (subtype) khác nhau hoặc các dạng biến thể (variants/polymorphic alleles) khác nhau, dẫn đến có thể có những nhận định nhầm về khả năng tương tác của các

“thuốc thử” (test compound) với các thụ thể đích nếu đối tượng thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên không đại diện cho nhóm phổ biến nhất (các alen kiểu dại) Có thể nhận thấy những khó khăn trên có thể được khắc phục bằng việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện các GPCR tái tổ hợp của người Các GPCR tái tổ hợp được biểu hiện ở mức độ cao sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein Chính bởi vậy, xây dựng các hệ thống biểu hiện GPCR nhanh và hiệu quả là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng và mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong sàng lọc và nghiên cứu phát triển dược phẩm

Đến nay, đã có hơn 2600 vector được chia làm 3 nhóm chính là plasmit

(nguồn gốc từ vi khuẩn), phagơ (nguồn gốc từ virut) và nhiễm sắc thể nhân tạo [46] Chuyển gen vào các tế bào động vật có thể tiến hành bằng cách gây nhiễm các phagơ mang gen tái tổ hợp quan tâm hoặc chuyển gen trực tiếp thông qua plasmit Có rất nhiều vector biểu hiện trên động vật có vú có nguồn gốc từ virut

được dùng trong sản xuất protein, liệu pháp gen và phát triển vacxin mới (Phụ

lục-1)

Hiệu quả biểu hiện gen đặc biệt là trong các tế bào động vật có vú không

đơn thuần thể hiện ở tốc độ sản xuất protein mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố

như các nhân tố kiểm soát phiên mã và dịch mã, quá trình biên tập và sự ổn định của ARN, số lượng bản sao của gen ngoại lai, khả năng gây độc của các protein tái tổ hợp với tế bào cũng như các đặc tính di truyền của tế bào chủ

Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thuận tiện với mục đích

sử dụng Không có hệ vector nào toàn năng cho chuyển gen và biểu hiện mà cần

có sự chọn lựa tùy theo mục đích và kích thước của đoạn gen được tạo dòng [66] Các vector liên tục được cải tiến thuận lợi cho việc chuyển gen, sản xuất và thu hồi protein ngoại lại một cách hiệu quả Dưới đây tóm lược một số xu hướng cải tiến vector phổ biến và ý nghĩa của chúng

1.1.2.1 Tạo các vector ADN từ hệ gen virut có bản chất ARN

Nhiều virut có hệ gen ARN có tiềm năng phát triển thành các vector biểu hiện mạnh Các phiên bản vector ADN của virut ARN được thiết lập là một bước cải tiến lớn đem lại các hệ thống biểu hiện mạnh hơn (đặc biệt ở tế bào

động vật có vú), dễ dàng thao tác với các enzym và thuận lợi cho quá trình chèn

các đoạn ADN ngoại lai đồng thời hạn chế được các bước xử lý trong điều kiện chuyên biệt dành cho ARN và dịch mã ARN có mũ đầu 5’ trong ống nghiệm [6] Nhiều nghiên cứu xây dựng vector ADN dựa trên hệ vector ARN gốc đã được tiến hành, chẳng hạn như các hệ vector ADN có nguồn gốc từ ARN hệ gen của virut Sindbis [54]

1.1.2.2 Thêm hoặc cải tiến các vùng điều khiển

Những hiểu biết ngày càng sâu sắc về các trình tự mã cho các tín hiệu

điều khiển quá trình phiên mã, biên tập mARN và dịch mã có thể thêm vào

vector giúp chúng ta chủ động điểu khiển hiệu suất biểu hiện theo ý muốn Trình tự Kozak GCC(A/G) CCATGG ở động vật có xương sống hoặc trình tự tương đương CAAAACATG ở côn trùng bất cứ khi nào xuất hiện đều làm tăng hiệu suất dịch mã ARN [1] Ngoài ra, đoạn trình tự này còn khuyến

khích loại bỏ các vùng có thể ức chế dịch mã nằm ngược dòng ATG hay vùng cấu trúc thứ cấp ở đầu 5’ không mã hóa [15]

Lựa chọn các trình tự tăng cường hay các promoter mạnh có hiệu suất phiên mã cao để thêm hoặc thay thế cho promoter gốc của vector sẽ giúp tắng cường mức độ biểu hiện protein Bảng 1 trình bày một số promoter có thể thêm vào vector biểu hiện trên động vật có vú

Bảng 1 Một số promoter được bổ sung vào các vector biểu hiện

(nguồn: Gerstein, 2001 [15])

SV40 muộn Gen muộn của virut simian 40 1.1

* Promoter SV40 sớm được coi là có độ mạnh là 1để so sánh với các promoter khác

Nhiều tín hiệu kết thúc phiên mã của sinh vật nhân sơ đã được nghiên cứu và được sử dụng rộng rãi trong các vector biểu hiện Ở sinh vật nhân chuẩn, trình tự ATCAAA(A/T)TAGGAAGA đã được xác định là vùng kết thúc phiên

mã của chín gen được nghiên cứu [36]

Đuôi polyadenin – polyA (50-250 phân tử adenyl nối tiếp nhau) thêm sau

mARN có vai trò quan trọng giúp ổn định và dịch chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất để dịch mã Mặc dù trình tự polyA cách xa điểm khởi đầu dịch mã nhưng

nó có tác dụng tăng cường sự tái hoạt động của ribosom nên trực tiếp làm tăng cường hiệu suất dịch mã [1] Có một số tín hiệu polyadenin hóa hiệu quả đã

được sử dụng trong vector biểu hiện của động vật có vú có nguồn gốc từ gen mã

cho hoóc môn tăng trưởng của bò, β- globin chuột, đơn vị phiên mã sớm của SV40 và gen mã cho thymidine kinase của Herpes simplex

Các mã kết thúc (TAG, TAA, TGA) cũng có thể xem xét để thêm vào sau vùng nhân dòng đa điểm nhằm tăng cường sự kết thúc dịch mã trong trường hợp các đoạn cài mã gen ngoại lai thiếu các mã này hoặc để tăng hiệu quả hoạt động của các yếu tố kết thúc dịch mã (RF) [1]

1.1.2.3 Mở rộng và đa dạng hóa các vùng nhân dòng đa điểm

Các phiên bản vector đầu tiên dựa trên trình tự nguyên gốc của plasmit hoặc phage có vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site-MCS) rất hạn chế Các vị trí nhân dòng đa điểm là nơi mà các enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu tái bản để tránh bị cắt nhầm Để thuận lợi cho quá trình nhân dòng gen ngoại lai, các vector gốc thường được bổ sung thêm các đoạn nối (linker) mang

vị trí nhân dòng đa điểm mới Các vị trí nhân dòng đa điểm mới phải đảm bảo không có trong trình tự gốc của vector, ưu tiên cho các enzym giới hạn tạo được

đầu tương thích với nhiều enzym giới hạn khác [2]

1.1.2.4 Thêm các vùng gen giúp sàng lọc thể tái tổ hợp

Các gen kháng kháng sinh giúp chọn lọc các dòng tế bào chứa vector tái

tổ hợp thường được thêm vào hầu hết các vector Các gen kháng kháng sinh hay

được sử dụng là gen mã họ kháng sinh penicillin (bao gồm ampicillin) tác động

ức chế hình thành thành tế bào vi khuẩn hoặc kanamycin, tetracyclin và

chloramphenicol ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn thông qua ức chế sinh tổng hợp protein vi khuẩn

Các gen báo cáo (reporter genes) giúp xác định plasmit có chứa đoạn

chèn gen ngoại lai mong muốn cũng có thể được cài vào vector Gen lacZ là một

gen báo cáo điển hình, mã hóa cho β-galactosidase có khả năng cắt galactose Vị

trí nhân dòng đa điểm nằm trong gen LacZ và nếu đoạn chèn được cài thành

công vào vector sẽ làm bất hoạt β-galactosidase Chính vì vậy, tế bào chứa vetor

có đoạn chèn quan tâm có thể được xác định bằng phương pháp chọn khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường chứa X-gal [2]

1.1.2.5 Thêm các đoạn epitop và các vị trí cắt của protease

Trong vài năm gần đây, một số epitop peptit và protein rất nhỏ còn được gọi là các đuôi ái lực (affinity-tag) được gắn vào protein tái tổ hợp để tăng cường sản xuất các protein này [22] Các đuôi ái lực này có đặc điểm chung là: không gây đáp ứng miễn dịch; tinh sạch một bước bằng cột lọc có chất gắn thích hợp; có ảnh hưởng tối thiểu lên cấu trúc và hoạt động sinh học của protein tái tổ

hợp mà nó gắn vào; có thể loại bỏ dễ dàng và đặc hiệu để sản xuất các protein dạng nguyên gốc; phân tích protein tái tổ hợp đơn giản và chính xác trong quá trình tinh sạch; áp dụng được cho một số loại protein khác nhau Mỗi loại đuôi ái lực được tinh sạch với một loại đệm đặc hiệu và trong một số trường hợp các

đoạn peptit này có thể không cần loại bỏ khỏi protein đích Các đoạn peptit nhỏ được sử dụng nhiều nhất hiện nay là poly-Arg-tag, FLAG-tag, poly-His-tag, c-

myc-tag, S-tag và Strep II-tag Trình tự của một số đuôi ái lực phổ biến được trình bày trong Bảng 2

Bảng 2 Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực

Đuôi ái lực Số

axit amin

thước (kDa)

S-transferase

Các trình tự mã hóa cho vị trí cắt của protease cũng thường được thêm vào sau trình tự của các đuôi ái lực để loại bỏ các đuôi ái lực này và thu hồi dạng protein tái tổ hợp nguyên bản Các vị trí cắt của một số protease được trình bày trong Bảng 3 Các vị trí cắt của protease được lựa chọn sao cho không có vị trí tương tự trong protein tái tổ hợp được quan tâm

Bảng 3 Các vị trí cắt của một số protease phổ biến Protease Trình tự nhận biết Tài liệu tham khảo

1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein

Biểu hiện protein tái tổ hợp đã trở thành công cụ chủ chốt trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong vòng 20 năm trở lại đây Mặc dù có nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển khá tốt cho các protein hòa tan trong tế bào nhân sơ và nhân thật, thì đến nay biểu hiện hiệu suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức lớn Khả năng biểu hiện GPCR mức

độ thấp có liên quan chủ yếu tới cấu trúc và hình dạng của các loại protein này

Các GPCR với 7 vùng xuyên màng được tạo ra ở mức độ thấp do yêu cầu cuộn gập, vận chuyển và khả năng gây độc tính đối với tế bào

Hình 2 Quy trình và thời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái tổ hợp trong các hệ

thống biểu hiện khác nhau (nguồn: Nambi, 2003 [43])

Trong phần này, các tính chất cũng như những thành tựu của các hệ thống biểu hiện bao gồm hệ thống dịch mã phi tế bào, các vector nhân sơ và nhân chuẩn sử dụng cho việc biểu hiện mạnh các GPCR tái tổ hợp sẽ được trình bày tóm lược (xem thêm Hình 2) Đa phần trong số chúng đã được sử dụng cho việc

biểu hiện GPCR tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng: không có một hệ thống nào là toàn năng cho việc biểu hiện mức độ cao tất cả các loại GPCR

1.1.3.1 Hệ thống dịch mã phi tế bào

Hệ thống dịch mã phi tế bào được xây dựng từ dịch thủy phân E.coli hoặc

dịch thủy phân tế bào mầm lúa mì Hệ thống chứa các nhân tố tham gia phản

ứng phiên mã và dịch mã đồng thời được cung cấp thêm liên tục các nucleotit,

các axit amin và các hợp chất thiết yếu khác [37]

Hệ thống biểu hiện phi tế bào áp dụng để dịch mã nhanh các sản phẩm PCR mã cho các protein hòa tan đơn giản với lượng lớn cỡ hàng chục milligram một cách nhanh chóng (khoảng 4 ngày) Tuy nhiên, hệ thống dịch mã phi tế bào vẫn tồn tại nhiều hạn chế như chi phí cao, quy trình kỹ thuật phức tạp Sự biểu hiện của các protein xuyên màng lớn, đặc biệt là các GPCR chưa từng thành công bằng sử dụng hệ thống này [26]

1.1.3.2 Biểu hiện ở tế bào nhân sơ

Ưu điểm của biểu hiện trên các tế bào nhân sơ là chi phí rẻ, đơn giản,

nhanh (khoảng 11 ngày) và dễ mở rộng quy mô sản xuất các protein tái tổ hợp Tuy nhiên, hệ biểu hiện này có nhược điểm cơ bản là không có cơ chế biến đổi sau dịch mã nên các protein phức tạp và lớn, như GPCR, thường được biểu hiện

ở dạng không có hoạt tính đầy đủ do không được cuộn gập chính xác hoặc được

biến đổi sau dịch mã như dạng tự nhiên [43]

Tuy vậy, đến nay một số GPCR đơn giản đã được biểu hiện bởi hệ thống

này nhằm nghiên cứu cấu trúc E.coli, Halobacterium salinarum, Lactococcus lactis là những chủng vi khuẩn được dùng làm tế bào chủ biểu hiện phổ biến hơn

cả 11 GPCR gắn đuôi His ở đầu C đã được biểu hiện trên E.coli với hiệu suất

biểu hiện khác nhau từ 0.1 đến 10% tổng số protein tế bào [24] Thụ thể muscaricnic M1 và serotonin 5-HT2C đã được tiến hành biểu hiện trên

H.salinarum [53] L lactis là một vi khuẩn Gram dương thường được sử dụng

để biểu hiện các protein màng nhằm xác định dạng prokaryote nguyên gốc [28]

1.1.3.3 Biểu hiện ở nấm men

Ưu điểm của biểu hiện protein tái tổ hợp ở tế bào nấm men là dễ nuôi

cấy, thu được sinh khối lớn và có hệ thống biến đổi sau dịch mã gần tương đồng với tế bào động vật Thụ thể dopamine D1A ở người đã được biểu hiện thành

công ở Saccharomyces cerevisiae và được thu hồi nhờ đuôi His6 [4] Nấm

Schizosaccharomyces pombe sở hữu hệ thống truyền tín hiệu giống động vật có

vú và có thể glycosyl hóa, thụ thể dopamine D2 ở người đã được biểu hiện trên

màng nấm S pombe với lượng cao gấp ba lần so với biểu hiện trên S.cerevisiae [44] Nấm Pichia pastoris được đánh giá là chủng nấm biểu hiện gen tốt nhất

bởi khả năng biến đổi sau dịch mã bao gồm glycosyl hóa, tạo các liên kết disulfit

và phân cắt protein [7] Khoảng 100 GPCR trong chương trình nghiên cứu hệ gen cấu trúc của MePNet đã được biểu hiện thành công với hiệu suất 95% ở các

tế bào P.pastoris

Mặc dù vậy, thành tế bào nấm dày thường được coi là một trong những trở ngại cho hiệu suất tinh sạch và thu hồi protein tái tổ hợp Bên cạnh đó, quy trình sản xuất GPCR ở nấm men cũng thường tốn nhiều thời gian (khoảng 18 ngày)

1.1.3.4 Biểu hiện ở các tế bào côn trùng

Ưu điểm lớn nhất của biểu hiện ở các tế bào côn trùng là tế bào côn trùng

sở hữu một lượng lớn các quy trình cải biến giống với động vật có vú Thêm nữa, các tế bào côn trùng được nuôi cấy trong môi trường bán tổng hợp nên dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất protein mặc dù chi phí cao hơn so với nuôi cấy nấm men và vi khuẩn

Hệ thống vector baculovirut lây nhiễm trên tế bào côn trùng được đánh giá là một trong những hệ thống biểu hiện GPCR hiệu quả nhất [35] Virut thuộc nhóm này được sử dụng phổ biến hơn cả là virut Autograha californica nuclear polyhedrosis (AcMNPV) AcMNPV có thể lây nhiễm các dòng tế bào côn trùng như Sf9 và Sf21 và nhân lên trong chúng Nhờ promoter của baculovirut hoạt

động mạnh, các gen ngoại lai được biểu hiện mạnh và có thể được tích lũy với

lượng lớn trong giai đoạn muộn của pha đóng gói hạt virut mới (thường kéo dài khoảng 2 giờ) Thời gian của một quy trình sản xuất protein GPCR tái tổ hợp kể

tử khi bắt đầu phân lập gen đích vào khoảng 21 ngày [23] Hệ thống vector baculovirut đến nay đã được sử dụng thành công trong sản xuất nhiều thụ thể GPCR, như các thụ thể adrenegic, opioid, histamine, serotonine … nhưng chủ yếu phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các thụ thể Các protein xuyên màng được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện baculovirut thường

có hiệu suất thu protein vào khoảng 18 đến 71 pmol/mg protein, nghĩa là tăng hàng nghìn lần so với mức biểu hiện trong tự nhiên [38]

Tuy nhiên, sự khác biệt chính giữa tế bào động vật có vú và côn trùng luôn tồn tại, ví dụ như quá trình N-glycosyl hóa ở tế bào côn trùng đơn giản hơn

và chứa nhiều manose hơn tế bào động vật có vú [21]

1.1.3.5 Biểu hiện trên tế bào động vật có vú

Vật chủ tối ưu biểu hiện các gen mã cho GPCR của động vật có vú hiển nhiên chính là các tế bào động vật có vú với đầy đủ các cơ chế biến đổi, vận chuyển cũng như sự có mặt của G-protein Các vector virut nhiễm trên tế bào

động vật có vú có thể cải thiện mức độ biểu hiện một cách hiệu quả nhờ có khả

năng di chuyển từ tế bào chủ này sang tế bào chủ khác và có các promoter rất mạnh, những promoter này được đánh giá là “đỉnh cao” của biểu hiện gen Gần như phần lớn các protein màng được sản xuất một lượng lớn trong môi trường nuôi cấy huyền phù dựa trên hệ thống biểu hiện của Semiliki Forest virut (SFV) Đây là một loại alpha virut có hệ gen ARN mạch đơn Hiệu quả biểu hiện các protein xuyên màng của người bởi hệ thống SFV trong một số trường hợp tỏ ra hiệu quả hơn so với hệ thống biểu hiện baculovirut, có lẽ nhờ khả năng biến đổi protein sau dịch mã ở các dòng tế bào động vật có vú, như CHO, HEK hay U20S Các vector SFV đến nay đã được ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR và mức độ biểu hiện trong phần lớn trường hợp là rất cao khi đo bằng phối tử đánh dấu và Western blot [32] Tuy vậy, so với hệ thống biểu hiện của baculovirut, hệ thống biểu hiện của SFV có giá thành cao hơn và vẫn luôn cần sự quan tâm đáng kể về khía cạnh an toàn sinh học khi thao tác

1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT)

1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV)

SFV là virut có hệ gen ARN (+) thuộc họ Togaviridae, chi Alpha virut

Nó được phân lập lần đầu tiên từ muỗi ở Uganda năm 1944 [49] Đây là một virut có cấu trúc tương đối đơn giản Hệ gen SFV dài 11442 nucleotit (không tính mũ 5’ và đuôi poly A) với 2 khung đọc mở mã cho 2 chuỗi polyprotein (xem Hình 3) SFV có 4 protein phi cấu trúc (non-structural proteins, viết tắt là nsPs) từ nsP1 đến nsP4 cấu thành nên enzym ARN replicase, còn lại là các protein cấu trúc vỏ capsit (protein C) và vỏ ngoài (protein E1, E2, E3) Một protein nhỏ 6 kD được mã hóa trong vùng gen cấu trúc không được dùng để cấu thành virut mới Các protein cấu trúc được mã hóa bởi đoạn ARN được ký hiệu

là 26S, trong khi các protein phi cấu trúc được dịch mã từ ARN 42S của hệ gen

Cả protein cấu trúc và phi cấu trúc được tạo thành từ sự phân tách 2 chuỗi polyprotein nhờ cơ chể cắt sau dịch mã [50]

Hình 3 Hệ gen SFV tự nhiên (nguồn: Lundstrom K., 2003 [32])

Trong chi Alpha virut, SFV được coi là hệ thống biểu hiện gen tốt bởi vòng đời virut ngắn, phổ vật chủ rộng, có khả năng tự nhân hệ gen của bản thân

và chỉ cần bộ máy dịch mã của vật chủ để tái tạo [14]

Trong chu trình nhân lên (tái bản) thông thường, SFV lây nhiễm vào tế bào chủ và khởi đầu quá trình nhân lên bằng cách dịch mã ở 2/3 đầu 5’ của đoạn ARN(+) Đoạn polyprotein được dịch mã sẽ phân cắt thành 4 protein phi cấu trúc hình thành nên enzym ARN replicase Phức hệ ARN replicase có đích là trình tự đầu 3’ của ARN (+), chúng tổng hợp lên sợi ARN (-) có chiều dài đầy

đủ từ sợi ARN (+) Protein cấu trúc cần cho lắp ráp virut trưởng thành được mã

hóa bởi 1/3 đoạn gen còn lại của hệ gen virut, vùng này được sao chép bằng enzym SFV replicase và dịch mã cho ra protein vỏ Protein vỏ capsit nhận tín hiệu đóng gói nằm ở vùng mã hóa cho nsP2 và cùng với sợi ARN có chiều dài

đầy đủ tạo nên nucleocapsit [13] Cấu trúc này dung hợp và mọc chồi từ màng tế

bào để tạo thành dạng virut trưởng thành có khả năng lây nhiễm

SFV không gây bệnh truyền nhiễm ở người, mặc dù có một báo cáo về một đợt bùng phát sốt nhẹ trong binh lính Pháp ở Cộng hòa Trung Phi được giả thiết là do SFV [39] Nhìn chung, SFV được coi là ít nguy hiểm cho nhân viên phòng thí nghiệm hơn các togavirut khác Vì những lí do này, SFV được phân loại là virut an toàn sinh học độ 3 ở Mỹ, nhưng có một số khuyến cáo rằng mọi hoạt động vẫn nên được tiến hành ở độ 2 (U S HHS Publication no (CDC) 93-

8395, 1993) Ở Liên Minh Châu Âu, SFV được xếp là virut an toàn sinh học độ

2 (E C Council Directive 93/88/EEC, 1993) Các vector biểu hiện SFV không mang các gen cấu trúc được xếp vào an toàn sinh học độ 2 ở cả Mỹ và Châu Âu [11]

1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản

Hệ vector SFV cơ bản chúng tôi được tặng bởi GS Kenneth H Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) gồm vector nhân dòng các gen quan tâm pSFV dài 11489 bp và vector biểu hiện các protein cấu trúc pHelper dài 8650

bp Hai vector này có bản chất là ADN, cấu trúc cụ thể của chúng được nêu ở dưới đây

1.2.2.1 Cấu trúc của pSFV cơ bản

pSFV chứa trình tự mã hóa cho phức hệ replicase gồm 4 protein phi cấu trúc (kí hiệu từ nsP1đến nsP4) dài 7381 Nu (nsP1: 86-1096 (737 axit amin), nsP2: 1697-4090 (798 axit amin), nsP3: 4091-5536 (482 axit amin), nsP4: 5537-

7378 (614 axit amin) Theo sau là vùng nhân dòng đa điểm và đoạn gen mã hóa cho protein cấu trúc đã bị xóa đi phần lớn (∆sP) Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV rất hạn chế nhưng có thể cải tiến thêm các vị trí nhận biết cho các enzym mới bằng cách thêm những đoạn oligonucleotit thích hợp Ngoài ra, pSFV được cải tiến với promoter mạnh CMV, 3 mã kết thúc nằm liên tiếp nhau sau vị trí nhân dòng đa điểm, đuôi polyadenyl và tín hiệu kết thúc phiên mã của virut SV40

Hình 4 Cấu trúc vector pSFV cơ bản

1.2.2.2 Cấu trúc của pHelper

Vùng gen mã hóa cho protein phi cấu trúc của vector pHelper bị xóa bỏ phần lớn, chỉ giữ lại nguyên vẹn vùng gen mã hóa cho các protein cấu trúc (sPs) tham gia vào việc đóng gói virut pHelper có các promoter CMV/T7, promoter subgenomic, đuôi polyadenyl đảm bảo cho quá trình phiên mã các gen cấu trúc invivo có thể diễn ra

Hình 5 Cấu trúc vector pHelper

Sự đồng biến nạp các ARN từ vector pSFV và vector helper theo tỉ lệ mol 1:1 vào cùng một dòng tế bào tạo ra sự đóng gói invivo của ARN tái tổ hợp hình thành nên các hạt virut SFV (Hình 6)

Hình 6 Mô hình hoạt động của hệ vector SFV

Nhìn chung, hệ SFV cơ bản được thiết kế có những ưu điểm sau:

- 2 plasmit riêng biệt của virut đều biến nạp nhanh và đơn giản, thu hoạch virut trưởng thành sau 1-2 ngày, không yêu cầu tái tổ hợp

- Dải vật chủ lây nhiễm rộng, cho phép chọn được các dạng biến đổi sau dịch mã phù hợp

- Sản lượng protein cao, có thể tạo ra 25% tổng số protein của tế bào và có thể tạo ra lượng protein đủ cho cả một gia đình sống trong vài năm

- Có tính an toàn cao nhờ các yếu tố:

+ Các vector cADN được sử dụng đều có nguồn gốc từ một dòng đã

được làm suy yếu khả năng gây bệnh

+ Các gen cấu trúc và các gen tái bản của SFV được tách và tái cấu trúc thành 2 vector riêng biệt (replicon và helper) nên virut này mất khả năng tái sản xuất qua mỗi chu kì tế bào Chính vì lí do này, hệ vector SFV còn được gọi là hệ vector virut “tự tự tử”

+ Phức proteinp62 (gồm E3và E2) không được phân tách thành 2 tiểu phần do có 3 thay đổi về axit amin Để tránh hoạt hóa virut, p62 phải

được cắt nhờ chymotrysin, nên virut chỉ nhiễm sau khi hoạt hóa bằng

chymotrypsin

1.2.3 Tiềm năng ứng dụng khác của hệ vector SFV

Hệ vector SFV không chỉ là một trong những hệ vector biểu hiện GPCR hiệu quả nhất, phục vụ đắc lực cho các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm mà còn

có rất nhiều tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác Dưới đây là một số

ứng dụng nổi bật của hệ vector SFV

1.2.3.1 Ứng dụng trong liệu pháp gen

Mục đích ban đầu khi nghiên cứu về SFV là tìm hiểu hoạt tính sinh bệnh của nó, tuy nhiên có một số đặc điểm của SFV cho thấy nó có thể được cải biến

để chữa bệnh hơn là những tác hại mà nó gây ra

Nghiên cứu các dòng tế bào nhiễm SFV cho thấy: vùng gen mã hóa cho protein phi cấu trúc của SFV cần cho sự cảm ứng chết theo chương trình (apoptosis) Sự mất phần gen nsP2 hủy bỏ đồng thời sự cảm ứng apoptosis và sự tổng hợp ARN virut [17] Cảm ứng chết theo chương trình bởi SFV không phụ thuộc p53, do đó không gây thương tổn cho ADN tế bào Một cơ chế khả thi giải thích cho sự cảm ứng chết theo chương trình do SFV là sự hoạt hóa protein kinase phụ thuộc ARN mạch đôi [30] Vì các tế bào H358a chết theo chương trình không phụ thuộc p53 do SFV hoặc vector SFV là các tế bào ung thư phổi

của người mang đột biến mất p53, điều này gợi ý về tính khả thi của việc dùng SFV và vector SFV để cảm ứng apoptosis ở tế bào ung thư

Vector SFV có mức độ biểu hiện cao và có khả năng gây dừng quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ cũng như kích hoạt chết theo chương trình của

tế bào chủ nên được nhắm đến sử dụng trong liệu pháp gen để điều trị ung thư Bằng cách đếm tế bào theo dòng, số lượng tế bào chết theo chương trình tăng mạnh khi biến nạp virut SFV-LacZ vào dòng tế bào u tuyến tiền liệt và sinh thiết thu từ người bệnh [56] Tiêm ARN SFV-LacZ cũng kéo dài sự sống của chuột BALB/c bị ung thư [55] Chuyển gen interleukin-12 (IL12) chuột nhờ vector SFV cho thấy có thể gây suy thoái và ức chế khối u B16 thông qua việc ức chế hình thành mạch máu quanh khối u [5] Các nghiên cứu cho thấy không có dấu hiệu bị đầu độc ở chuột đã xử lý SFV-IL12 và hiệu quả chống khối u có thể

được tăng cường bằng việc cách tiêm nhắc lại hạt SFV tái tổ hợp

1.2.3.2 Ứng dụng trong sản xuất vacxin

Các vector SFV được coi là một công cụ vector dẫn truyền gen lý tưởng làm vacxin cho người và động vật Đầu tiên, sự sao chép ARN của SFV diễn ra

ở tế bào chất, không có nguy cơ dung hợp gen của virut vào nhiễm sắc thể tế bào

chủ Các nghiên cứu khác cũng cho thấy, nhiều người và động vật không có miễn dịch tiền nhiễm chống lại vector SFV Khả năng gây chết theo chương trình do nhiễm virut giúp hệ gen của virut không tồn tại dai dẳng trong các mô

và giải phóng các protein kháng nguyên mã hóa từ gen ngoại lai Một lợi thế nữa

là SFV có phạm vi vật chủ rộng, xâm nhiễm nhiều loại tế bào

Vector SFV có thể dùng để nghiên cứu để biểu hiện protein kháng nguyên từ nguồn gen của vi sinh vật độc hại ngoại lai, loại trừ được khả năng có mặt của đối tượng Trong cơ thể, vacxin virut tái tổ hợp kích thích tốt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với các loại kháng nguyên ngoại lai Tiêm tĩnh mạch hạt SFV tái tổ hợp biểu hiện gen cúm NP dẫn đến đáp ứng dịch thể với mật độ kháng thể cao trong chuột BALB/c [56] Tối thiểu 100 hạt SFV-NP xâm nhiễm

sẽ gây đáp ứng độc mạnh cho tế bào T và sau một lần tiêm tăng cường miễn dịch nhớ của tế bào T kéo dài hơn 40 ngày sẽ được thiết lập [57] Khỉ Pigtail

được tiêm chủng với hạt SFV tái tổ hợp biểu hiện gp160 của virut suy giảm

miễn dịch ở khỉ (SIV) được bảo vệ khỏi căn bệnh gây chết người này [41] Gần

đây, hạt SFV biểu hiện kháng nguyên kháng khối u P815 đã tạo ra phản ứng

mạnh của tế bào T và bảo vệ cơ thể chống lại sự phát triển của khối u P815 Ngoài ra, kỹ thuật tiêm trực tiếp axit nucleic đã được sử dụng cho vector SFV Tiêm vector SFV ARN đã chèn gen cúm NP vào cơ chuột đã thu được đáp

ứng dịch thể cao [56] Lợi ích của việc sử dụng ARN trần gây miễn dịch là độ an

toàn cao hơn do ARN trần kém bền và không có sự sát nhập vào hệ gen của tế bào chủ Gần đây, vector ARN trần biểu hiện glycoprotein gp41 HIV-1 được tiêm vào bắp chuột để hình thành kháng thể đơn dòng [16] Vector ADN SFV mới được xây dựng gây đáp ứng miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch cao hơn các plasmit ADN thông thường Trong các nghiên cứu khác, vector SFV (dạng ARN hoặc ADN) và hạt SFV tái tổ hợp được ứng dụng để tạo ra các kháng nguyên đơn dòng chống lại các protein prion [27]

1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV

Mặc dù có nhiều ứng dụng khác nhau và có khả năng biểu hiện gen hiệu quả, vector SFV vẫn cần được cải tiến thêm Sau đây là các yếu tố có thể cải tiến

trong hệ vector SFV

1.2.4.1 Vùng nhân dòng đa điểm

Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV rất hạn chế (chỉ có vị trí nhận biết của 3 enzym), chúng ta có thể cải tiến bằng cách bổ sung thêm các vị trí nhận biết enzym giới hạn mới giúp việc nhân dòng các gen sẽ trở nên linh hoạt và thuận lợi nhờ có thể lựa chọn thêm nhiều tổ hợp các enzym giới hạn phục vụ cho

nhân dòng và biểu hiện các gen GPCR mong muốn

1.2.4.2 Yếu tố tăng cường dịch mã

Frolov và Schlesinger (1994) đã tìm thấy đoạn trình tự tăng cường dịch

mã nằm ở gen mã hóa vỏ capsit xuất hiện ở Sindbis virut, một virut có cấu trúc khá tương đồng và cùng nhóm phân loại với SFV[12] Nhiều nghiên cứu sau này

đã cho thấy, khi thêm vùng tăng cường trên vào các vector biểu hiện, không

những không làm giảm tốc độ phiên mã mARN mà còn tăng cường khả năng

dịch mã lên 10 đến 100 lần [10] Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy trên SFV có 102 nucleotit đầu tiên mã hóa cho protein vỏ capsid cũng có khả năng tăng cường dịch mã cho những gen xuôi chiều và cùng nằm trong khung đọc mở với đoạn trình tự này [48] Thêm đoạn trình tự mã hóa cho vỏ capsit SFV vào trước vị trí nhân dòng có thể biểu hiện GPCR hàm lượng cao như một protein liên hợp với protein vỏ capsit

1.2.4.3 Gắn FLAG-tag

FLAG-tag hay FLAG octapeptit có bản chất là đuôi polypeptit gồm 8 axit amin ưa nước có thể gắn vào protein quan tâm (Bảng 1) Cấu trúc của FLAG-tag

đã được tối ưu để tương thích với protein mà nó gắn vào Đây là đoạn polypeptit

ưa nước hơn so với hầu hết các epitop thông thường khác và do vậy ít có khả

năng gây biến tính hoặc bất hoạt các protein mà nó gắn vào FLAG peptit liên kết với kháng thể M1 Protein tái tổ hợp có gắn đuôi FLAG-tag có thể được phân lập bằng sắc kí ái lực và được xác định bằng kháng thể tương tác với đoạn FLAG-tag Protein tái tổ hợp được gắn FLAG-tag đã được biểu hiện trong nhiều loại tế bào, từ vi khuẩn tới nấm men và tế bào động vật có vú [29]

FLAG-tag có thể được gắn vào đầu N hoặc đầu C của phân tử protein tái

tổ hợp, tuy nhiên có nhiều kháng thể chỉ có thể nhận biết các epitop khi chúng ở

đầu tận cùng N của protein FLAG-tag có thể được sử dụng liên hợp với các tag

có ái lực khác như His-tag hay myc-tag Ngoài ra, FLAG-tag ở đầu tận cùng N

có thể được loại bỏ dễ dàng từ các protein sau khi chúng đã được phân lập bằng cách xử lý với protease như enterokinase [51]

1.2.4.4 Đuôi polyhistidin (His-tag) và vị trí thrombin

Tinh sạch protein với đuôi polyhistidin (His-tag) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất và đã áp dụng thành công trong các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở nhân sơ, nấm, các tế bào động vật có vú và tế bào côn trùng nhiễm virut baculo [47] Histidin là axit amin tương tác mạnh nhất với các ion kim loại nhờ dễ dàng hình thành liên kết giữa nhóm cho điện tử trên vòng imidazole của nó với kim loại Polyhistidin (His-tag) là một đoạn axit amin chứa

ít nhất 5 histidin, thường được gắn vào đầu tận cùng C hoặc N của protein tái tổ hợp và có thể được loại bỏ bởi các endopeptidase như Qiagen TAGZyme

His-tag thường được sử dụng để tinh sạch protein tái tổ hợp qua sắc kí ái lực của đuôi His-tag với các ion kim loại chuyển tiếp như Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2 +

được cố định trên chất nền và các chuỗi axit amin đặc hiệu [20] His-tag cũng được sử dụng để phát hiện protein trong các phản ứng tương tác sử dụng kháng

thể Anti-HisG, phản ứng ELISA, Western blot cũng như các phản ứng phân tích miễn dịch khác Đuôi His–tag có thể được loại bỏ nhờ có vị trí cắt thrombin có trình tự SGLVPR (liên kết peptit sẽ cắt giữa V và P) Vị trí thrombin được gắn vào nhiều hệ vector cho phép loại bỏ vùng ngược chiều, chủ yếu là các đuôi ái lực

Hệ vector SFV là một hệ thống tiềm năng với nhiều ưu điểm, có thể được nghiên cứu cải tiến thêm nhằm phục vụ cho biểu hiện protein màng nói chung và các GPCR nói riêng ở mức độ cao Mặc dù vậy chưa có nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến hệ vector này Ở Việt Nam, sử dụng hệ SFV để biểu hiện các GPCR là hướng nghiên cứu mới song có nhiều tiềm năng phục vụ cho các nghiên cứu dược lý phân tử và sàng lọc dược chất từ các nguồn dược liệu tự nhiên của Việt

Nam Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát

triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen

mã hóa thụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam”với mục tiêu nghiên cứu chính là: phát triển hệ vector SFV

dựa trên vector SFV cơ bản cho phép biểu hiện các GPCR tái tổ hợp mà bước

đầu là gen mã thụ thể Neurokinin 1 với đủ hoạt tính với hiệu suất cao

Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu trên, chúng tôi đã tiến hành một số nội

dung nghiên cứu sau:

1) Hoàn thiện quy trình chuẩn bị các lô tế bào khả biến DH5α có hiệu suất biến nạp đủ cao cho phép nhân dòng tất cả các plasmit của hệ vector SFV

cơ bản một cách thuận tiện, dễ dàng

2) Chuyển hệ vector SFV cơ bản và được cải biến vào các tế bào khả biến DH5α để lưu giữ, nhân dòng

3) Cải biến hệ vector SFV cơ bản

4) Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản và hệ vector SFV cải biến

5) Sàng lọc chủng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp SFV mang gen mã hóa NK1

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Các chủng vi khuẩn

- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α đã đột biến, có những thiếu hụt thuận lợi

cho biến nạp và nhân nhanh plasmit hoặc cosmit tái tổ hợp mua của hãng Invitrogen (Mỹ)

- Chủng vi khuẩn chứa plasmit pJET1.2 mang gen tái tổ hợp mã hóa cho thụ thể NK1 (pJET1.2-NK1) được cung cấp bởi PGS.TS Võ Thương Lan, trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội

Hình 7 Cấu trúc của vector pJET1.2

Trình tự đoạn cADN mã hóa cho thụ thể NK1 được đưa vào vetor pJET1.2:

GATATGGATAACGTCCTCCCGGTGGACTCAGACCTCTCCCCAAACATCTCCACTAACACCACGGTCATTG

TGGTGACCTCTGTGGTGGGCAACGTGGTAGTGATGTGGATCATCTTAGCCCACAAAGGAATGAGGACAGT GACGAACTATTTTCTGGTGAACCTGGCCTTCGCGGAGGCCTCCATGGCTGCATTCAATACAGTGGTGAAC TTCACCTATGCTGTCCACAACGAATGGTACTACGGCCTGTTCTACTGCAAGTTCCACAACTTCTTTCCCA TCGCCGCTGTCTTCGCCAGTATCTACTCCATGGCGGCTGTGGCCTTTGATAGGTACATGGCCATCATACA TCCCCTCCAGCCCCGGCTGTCAGCCACAGCCACCAAAGTGGTCATCTGTGTCATCTGGGTCCTGGCTCTC

CTGCTGGCCTTCCCCCAGGGCTACTACTCAACCACAGAGACCATGCCCAGCAGAGTCGTGTGCATGATCG AATGGCCAGAGCATCCGAACAAGATTTATGAGAAAGTGTACCACATCTGTGTGACTGTGCTGATCTACTT CCTCCCCCTGCTGGTGATTGGCTGTGCATACACCGTAGTGGGAATCACACTATGGGCCAGTGAGATCCCC GGGGACTCCTCTGACCGCTACCACGAGCAAGTCTCTGCCAAGCGCAAGGTGGTCAAAATGATGATTGTCG TGGTGTGCACCTTCGCCATCTGCTGGCTGCCCTTCCACATCTTCTTCCTCCTGCCCTACATCAACCCAGA TCTCTACCTGAAGAAGTTTATCCAGCAGGTCTACCTGGCCATCATGTGGCTGGCCATGAGCTCCACCATG TACAACCCCATCATCTACTGCTGCCTCAATGACAGGTTCCGTCTGGGCTTCAAGCATGCCTTCCGGTGCT GCCCCTTCATCAGCGCCGGCGACTATGGGGGGCTGGAAATGAAATCCACCCGGTATCTCCAGACCCAGGG CAGTGTGTACAAAGTCAGCCGCCTGGAGACCACCATCTCCACAGTGGTGGGGGCCCACGAGGAGGAGCCA GAGGACGGCCCCAAGGCCACACCCTCGTCCCTGGACCTGACCTCCAACTGCTCTTCACGAAGTGACTCCA AGACCATGACAGAGAGCTTCAGCTTCTCCTCCAATGTGCTCTCCTAGGCCACAGGGCCTTTGGCAGGTGC

AGCCCCCACTGCCTTTGACCTGCCTCCCTTCATGCATGGAAATTCCCTTCATCTGGAACCATCAGAAACA CCCTCACACTGGGACTTG

2.1.2 Hệ vector SFV

Hệ vector SFV cơ bản gồm vector pSFV và vector pHelper là quà tặng từ

TS Kenneth H Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) tặng có cấu trúc như

trình bày ở phần tổng quan (xem mục 1.2.2, các hình 4 – 6)

2.1.3 Các cặp mồi PCR và các đoạn oligonucleotit dùng để cải biến vector

Các cặp mồi PCR dùng để nhân các phân đoạn ADN đặc hiệu của vector SFV hoặc của gen NK1 được thiết kế bằng các phần mềm (Primer Premier 5 và PerPrimer, Ver 1.1.14) có vị trí được minh họa trên hình 8 và có trình tự được trình bày trên bảng 4 Các đoạn oligonucleotit được dùng để cải biến vector,

đoạn trình tự đa nhân dòng O-M7 và đoạn nối (linker) M3 – M4 lần lượt được

Hình 8 Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1

Bảng 5 Trình tự các oligonucleotit sử dụng trong nghiên cứu Tên

Tạo linker chứa trình

tự của Flag-tag, tag, vị trí Thrombin

His-(gọi là đoạn O-M6)

(Màu xám: đoạn chứa trình tự của Flag-tag, màu vàng: đoạn chứa trình tự của

His 10 -tag, màu hồng: đoạn chứa trình tự của Thrombin)

Hình 9 Trình tự vị trí nhân dòng đa điểm của đoạn O-M7

2.1.4 Các nhóm hóa chất chính được sử dụng

- Nhóm hóa chất cải biến vector SFV gồm có: các hóa chất sử dụng trong phản ứng nhân bản gen cần phân tích (PCR) như đệm, dNTP, MgCl2, các

polymerase, mồi đặc hiệu, các enzym giới hạn và đệm tương ứng với các enzym

- Nhóm hóa chất chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp plasmit vào tế bào DH5α gồm dung dịch CaCl2 0.1M, dung dịch MgCl2 2M, dung dịch MgCl2-CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2), dung dịch Glucosse 1M, dung dịch KCl

250 mM, môi trường LB lỏng để tăng trưởng chủng ban đầu, kháng sinh thích hợp (ampicillin), môi trường SOC

- Nhóm các hóa chất tách plasmit gồm Sol I ( glucose 50 mM; đệm HCl, 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM); Sol II (NaOH 0,2N, 1% SDS); Sol III (CH3COOK 5M: 60 ml, CH3COOH băng: 11,5 ml, H2O: 28,5 ml, Rnase 10 mg/ml không chứa DNase) Phenol: chloroform: isoamylalcohol được trộn theo

Tris-tỷ lệ 25:24:1 về thể tích, trong đó phenol có pH 8.0; ethanol; đệm TE (10 mM Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 có chứa EDTA 1mM); isopropanol; dung dịch axetate kali 5M

- Nhóm hóa chất cho phản ứng cắt – nối ADN được cung cấp bởi Fermentas gồm các enzyme giới hạn FastDigest, T4 DNA ligase, FastAPThermosensitive Alkaline Phosphatase (FTAP), đoạn Klenow

- Nhóm các hóa chất điện di gồm agarose, đệm TAE, ethidium bromide, thang chuẩn ADN

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR gồm AccuPrep PCR Purification Kit 3034-1 của Bioneer), Kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas) Các hoá chất đều đảm bảo độ tinh sạch và được cung cấp bởi các hãng uy tín trên thế giới: Bioneer (Hàn Quốc), Thermo Scientific (Mỹ), Merck (Đức), IDP (Mỹ), Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ),…

(K-2.1.5 Trang thiết bị nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện bằng các trang thiết bị, máy móc phục vụ nghiên cứu sinh học phân tử - tế bào tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein và Phòng thí nghiệm Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chúng tôi tiến hành xây dựng 2 vector cải biến là pSFV-M7 và pSFV-M8

từ vector cơ bản là pSFV Hai vector cải biến sẽ có thêm đoạn tăng cường dịch

mã (gen mã hóa vỏ capsit của SFV), FLAG-tag, HIS10-tag, vị trí Thrombin, vùng nhân dòng đa điểm được thiết kế thêm các vị trí enzym cắt mới theo sơ đồ thí nghiệm hình 10 cADN mã gen NK1 được cài vào các vector pSFV theo các bước trong hình 11, 12

Hình 10 Sơ đồ nghiên cứu tạo vector cải tiến pSFV-M7 và pSFV-M8

Hình 11 Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong

vector pSFV cải tiến