tính chất rất nguy hiểm của Salmonella

tính chất rất nguy hiểm của Salmonella

1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Salmonella nguyên nhân gây bệnh ngộ độc thực phẩm cho người diện rộng mối đe dọa cho sức khoẻ cộng đồng Chúng phân bố rộng rãi đất, nước, gia súc, thực phẩm…trong thịt sản phẩm gia cầm nguồn bệnh quan trọng Các báo cáo Thành viên cho Hội đồng Châu Âu năm 1995 công nhận bệnh ngộ độc thực phẩm đặc biệt Salmonella Campylobacter vấn đề quan trọng cho sức khoẻ cộng đồng Vì tính chất nguy hiểm Salmonella, tất tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm nước xếp Salmonella vào nhóm khơng phép có mặt Hiện nay, khoảng 2500 kiểu huyết Salmonella xác định qua nghiên cứu cho thấy tất chủng mà có số có khả gây bệnh Nếu có phương pháp phân biệt chủng Salmonella gây bệnh với chủng lành tính tạo thuận lợi việc mua bán trao đổi hàng hóa nước Đồng thời việc phân biệt chủng giúp ích nhiều việc điều tra kiểm soát dịch bệnh vi khuẩn gây 1.2 Mục đích Phân biệt chủng Salmonella có khả xâm nhiễm gây bệnh với chủng lành tính 1.3 Yêu cầu −Khảo sát khả gây bệnh, gây chết chuột chủng Salmonella −Khảo sát khả xâm nhiễm chủng Salmonella vào gan lách chuột −Nghiên cứu khả xâm nhiễm chủng Salmonella vào quan thuộc hệ tiêu hóa chuột gồm: dày, gan, lách, ruột non ruột già −Khảo sát khả tái xâm nhiễm chủng Salmonella vào quan hệ tiêu hóa chuột Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ SALMONELLA 2.1.1 Đặc điểm sinh vật học Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella [23] 2.1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Salmonella 32 giống họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaccea Salmon Smit phân lập vào năm 1885 từ lợn mắc bệnh dịch tả Salmonella vi khuẩn gram âm, dạng hình que, hai đầu trịn, có kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1,0 - 3,0 µm, khơng hình thành giáp mô nha bào [1, 3, 6, 11, 25, 31, 35] Phần lớn vi khuẩn thuộc giống Salmonella di động nhờ vào tiên mao, vi khuẩn có từ đến 12 tiên mao chung quanh thân, trừ S gallinarum S pullorum khơng có lơng nên khơng di động [6, 11, 35] 2.1.1.2 Tính chất ni cấy Salmonella vi khuẩn hiếu khí tùy nghi phát triển tốt điều kiện hiếu khí, chúng sống nhiệt độ từ 5,2 - 46,20C pH từ 3,7 - 9,5, phát triển tốt 37oC pH 6,8 - 7,2 Salmonella dễ phát triển môi trường dinh dưỡng thông thường nuôi cấy khoảng 24 giờ, môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) phải ni cấy 48 [1, 3, 6, 11] Trên môi trường canh sau ni cấy - làm đục nhẹ môi trường, sau 18 làm đục đều, ni cấy lâu 24 mơi trường có lắng cặn Trên mơi trường thạch thường vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S tròn, lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám Đơi tạo khuẩn lạc dạng R, kích thước khuẩn lạc thường khoảng – mm Trên môi trường thạch MacConkey vi khuẩn Salmonella mọc thành khuẩn lạc trịn, đường kính – mm, suốt, khơng màu, sáng, nhẵn bóng, lồi Trên mơi trường thạch SS (Shigella - Salmonella) Salmonella hình thành khuẩn lạc trịn, bóng khơng màu hay có màu hồng có tâm đen Trên mơi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) Salmonella cho khuẩn lạc suốt, khơng màu hay có màu nhuốm đỏ đơi có tâm đen, thường xuất vùng đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc Salmonella phát triển mạnh Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant Green Phenol Red Lactose Agar) Salmonella cho khuẩn lạc trịn, màu trắng hồng, mơi trường xung quanh đỏ hồng Trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc có màu đen, thường có ánh kim bao quanh [3, 6, 11, 12, 25, 34] 2.1.1.3 Sức đề kháng Salmonella bị tiêu diệt nhiệt độ 500C giờ, 700C 15 phút, 1000C phút Chúng sống sót môi trường thạch nhiệt độ -10 0C 115 ngày, sống từ - tháng thịt ướp muối với tỷ lệ 29% nhiệt độ - 120C Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khơ, nước đóng băng tồn Salmonella khoảng - tháng, nước tự nhiên chúng sống - tháng Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng diệt vi khuẩn nước sau giờ, nước đục sau Salmonella bị diệt clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3% 15 20 phút [6, 11] 2.1.1.4 Đặc tính sinh hóa Salmonella có biểu đặc tính sinh hóa chủ yếu bảng 2.1, dựa vào đặc điểm mà người ta định hướng phân biệt với vi khuẩn đường ruột khác [3, 6] Bảng 2.1 Các biểu sinh hóa Salmonella Phản ứng sinh hóa Biểu Maltose + Glucose + Lactose H2S +/Gas + Lysine decarboxylase + Citrate Ure Nitrate + Indol Voges Proskauer Chú thích: (-) âm tính, (+)dương tính 2.1.1.5 Đặc điểm biến dị di truyền Trong nuôi cấy Salmonella, đặc biệt nuôi cấy lâu ngày mơi trường tổng hợp Salmonella biến dị khuẩn lạc kháng nguyên Các biến dị thường gặp là:[11, 17] −Biến dị S - R: vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc dạng S trơn, bóng láng, bờ đều, có kháng nguyên O đặc hiệu Qua thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến dị, khuẩn lạc trở nên nhám, xù xì, gồ ghề, người ta gọi dạng R, biến thành dạng kháng ngun O khơng đặc hiệu −Biến dị O - H: ni cấy ảnh hưởng số hóa chất mơi trường acid fenic… vi khuẩn bị biến dị lơng, chúng khơng di động cịn kháng ngun O −Biến dị kháng ngun H: vi khuẩn có lơng biến dị từ phase sang phase 2, có nghĩa biến dị từ phase đặc hiệu sang phase không đặc hiệu 2.1.2 Đặc điểm phân loại Dựa vào lai DNA - DNA, Bergey’s (1994) chia giống Salmonella thành loài Salmonella enterica (hay gọi S cholerasuis) S bongori [10, 25, 33] S bongori loài hiếm, S enterica phân bố rộng khắp nơi giới phổ vật chủ chúng rộng Loài S enterica chia thành lồi phụ lồi sau: S enterica enterica hay cịn gọi S enterica I S enterica salamae hay gọi S enterica II S enterica arizonae hay gọi S enterica IIIa S enterica diarizonae hay gọi S enterica IIIb S enterica houtenae hay gọi S enterica IV S enterica indica hay gọi S enterica VI Loài phụ S enterica I chiếm khoảng 99% số dòng phân lập được, chúng tìm thấy hầu hết động vật máu nóng Các lồi phụ khác phân lập động vật máu lạnh mơi trường Các lồi phụ S enterica phân biệt dựa các đặc điểm sinh hóa bảng 2.2 Bảng 2.2 Đặc tính sinh hóa lồi phụ thuộc Salmonella Đặc điểm sinh hóa Nhóm phụ IIIa IIIb + + ONPG I - II - Lactose - - + Dulcitol + + Malonate - Gelatine - 1 IV - V + VI D3 (+)2 - - + - - - + D3 + - + - - - + - + + - + KCN + + O-Nitrophenyl-β-D-Glucoside, Không sử dụng kéo dài thời gian ni cấy chúng sử dụng, số kiểu huyết nhóm sử dụng 2.1.3 Phân loại dựa theo cấu trúc kháng nguyên Hiện nay, phương pháp vào đặc tính sinh hóa để phân loại Salmonella, việc dựa vào cấu trúc kháng nguyên để xác định kiểu huyết Salmonella sử dụng phổ biến Mỗi dịng Salmonella xác định chủ yếu thơng qua loại kháng nguyên sau: Pili Hình 2.2 Vị trí loại kháng nguyên Salmonella −Kháng nguyên O (kháng nguyên màng tế bào, somatic): nằm màng vi khuẩn phóng thích vào mơi trường nuôi cấy Kháng nguyên đặc trưng cấu trúc lypopolysaccharide - protein Loại kháng nguyên coi nội độc tố vi khuẩn, có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu qua mao mạch làm thay đổi tạm thời thẩm thấu mao quản Kháng nguyên bền nhiệt, chúng không bị phân hủy nhiệt độ 2000C 2giờ Chúng bị phân hủy môi trường acid tạo thành phần bản: Phần lipide, có cấu trúc tương tự tất loài vi khuẩn thuộc đường ruột khác, phần qui định khả gây độc vi khuẩn gọi nội độc tố Phần phần có nguồn gốc từ polysaccharide, gồm nhóm hydro nằm ngồi, dùng để phân biệt kiểu huyết Salmonella Nhóm polysaccharide bên có chức phân biệt dạng khuẩn lạc Do có khác lồi Salmonella phương diện cấu tạo kháng nguyên O nên người ta chia Salmonella thành 34 nhóm có ký hiệu sau: A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1 … E4, F, G1, G2, X, Y, Z, 49, 50 Mỗi nhóm huyết học gồm số lồi vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo số thành phần định Ví dụ nhóm A, S paratyphi A, kháng nguyên O gồm thành phần (I), II, XII thành phần I có khơng, thành phần II thành phần đặc biệt thiếu dùng để phân biệt mặt huyết học với nhóm khác −Kháng nguyên H (kháng ngun lơng, flagella): có chất protein bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy 700C hay tác dụng cồn, enzyme phá hủy protein, không bị ảnh hưởng formol 0,5% Kháng ngun H khơng có tác dụng gây bệnh, khơng tạo miễn dịch Salmonella chứa nhóm kháng nguyên H, chúng mã hóa gen khác có liên quan mật thiết với nhau, thời điểm có gen biểu thành hai nhóm kháng nguyên gọi phase, phase1 phase Phase 1, phase đặc hiệu, bao gồm 28 loại kháng nguyên lông biểu thị chữ La tinh: a, b, c,…z Phase 2, phase khơng đặc hiệu, nhiều dịng Salmonella chứa loại kháng nguyên, gồm loại biểu thị số Ả Rập 1, 2, 3,…hay chữ La Tinh e, n, x,… Kháng thể kháng kháng nguyên H gây ngưng kết vi khuẩn lông roi Sự ngưng kết tạo thành mảng kết tụ, chúng bị tách yếu tố có khả cắt lông roi vi khuẩn −Kháng nguyên Vi (kháng nguyên vỏ, capsule): bọc kháng nguyên O gọi kháng nguyên bề mặt có liên quan mật thiết với endotoxin Kháng nguyên Vi Salmonella bị biến đổi nhiệt độ 1000C 15 phút tác dụng với cồn 90%, chúng ổn định formol 0,5% Kháng nguyên thường tìm thấy chủng: S typhi, S paratyphi C S dublin, chúng không tham gia vào việc gây bệnh Ngày người ta có khuynh hướng không đặt tên cho chủng Salmonella nữa, mà chủng biểu thị thông qua kháng nguyên O H, số có thêm kháng nguyên Vi Theo hệ thống phân loại Kaufman - White, có 2500 kiểu huyết Salmonella xác định Mỗi kiểu huyết xác định theo công thức gọi kiểu công thức kiểu kháng nguyên Đối với kiểu huyết thuộc lồi phụ I thường đặt theo tên, ví dụ S enteritidis, S typhi,… vào kiểu cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu dựa vào kháng nguyên O, S enterica I chia thành nhóm: A, B, C1, C2, D, E1, E4, F, G Trong đó, Salmonella nhóm E thường gây bệnh nhẹ với triệu chứng sốt, tiêu chảy, tỷ lệ bệnh diễn biến tỷ lệ tử vong thấp, Salmonella nhóm B C gây bệnh với tỷ lệ cao tỷ lệ chết tùy thuộc vào chủng vi khuẩn số lượng vi khuẩn xâm nhập vào, thường bé sơ sinh có tỷ lệ bệnh tỷ lệ tử vong cao so với lứa tuổi khác nước chất điện giải khác [3, 25, 29, 33, 35] Bảng 2.3 Cấu trúc kháng nguyên vài Salmonella thường gặp (Jay, 2000) Nhóm Lồi/kiểu huyết Kháng nguyên A S paratyphi A B S schottmuelleri 1, 4, (5), 12 b 1, S typhimurium 1, 4, (5), 12 i 1, S hirschfeldii 6, 7, (Vi) c 1, S choleraesuis 6, (c) 1, S oranienburg 6, m, t - S montevideo 6, g, m, s (p) (1, 2, 7) C2 S newport 6, e, h 1, D S typhi 9, 12, (Vi) d - S enteritidis 1, 9, 12 g, m (1, 7) S gallinarum 1, 9, 12 - - 3, 10 e, h 1, C1 E1 S anatum O 1, 2, 12 Kháng nguyên H Phase Phase a (1, 5) Ghi chú: - có mặt yếu tố đảo ngược phage, ( ) vắng mặt 2.1.4 Phân loại theo mục đích miễn dịch học Về dịch tễ học, Salmonella chia thành nhóm: −Nhóm nhiễm người: Gồm kiểu huyết S typhi, S paratyphi A, S paratyphi C Chúng tác nhân gây sốt thương hàn phó thương hàn Sốt thương hàn có thời gian ủ bệnh dài, thân nhiệt tăng cao thường tỷ lệ tử vong cao S typhi phân lập từ máu, từ phân nước tiểu bệnh nhân có vấn đề đường ruột Triệu chứng bệnh phó thương hàn nhẹ thương hàn −Nhóm gây bệnh thú: Gồm kiểu huyết S gallinarum (gia cầm), S dublin (bò), S abortus-equi (ngựa), S abortus-ovis (cừu), S choleraesuis (heo) −Nhóm khơng kí chủ: gây bệnh người thú, thường tìm thấy thức ăn Để có biểu bệnh mật độ vi khuẩn đưa vào thể phải đạt khoảng 10 7- 109 CFU/ g [29] 2.1.5 Phân loại độc tố: Salmonella có loại nội độc tố:[ 7, 27, 33] 2.1.5.1 Độc tố LT (Heat- labile toxin) hay gọi độc tố đường ruột (enterotoxin): độc tố đường ruột chịu nhiệt: Được phát lần vào năm 1975 Koupal Deibel Môi trường tìm thấy tốt để sản xuất độc tố BHI (Brain Heart Infusion Broth) có chứa 2% Casamino acid Những yếu tố dinh dưỡng glycerol, biotin Mn2+ làm tăng khả tạo độc tố Đồng thời, độc tố tạo nhiều phase ổn định định trình tăng trưởng, thích hợp khoảng pH - cao hơn, nhiệt độ 370C đặc biệt phải thông khí Độc tố LT khơng bền với nhiệt 1000C, có trọng lượng phân tử khoảng 110 kDa, điểm đẳng điện vào khoảng 4,3 - 4,8 Cơ chế tác động: độc tố LT hoạt hóa men adenylcylase tế bào, làm gia tăng c-AMP (cycle- adenosin- 5- monophotphate) c-AMP kích thích tăng tiết bicarbonate khỏi tế bào ruột đồng thời ức chế Na+ vào bên tế bào ruột, kết cuối gây tiêu chảy, nước, gây xung huyết mụn loét 2.1.5.2 Độc tố ST (Heat- stable toxin) hay gọi độc tố tế bào (cytotoxin): Vào năm 1962, nhà nghiên cứu Châu Âu hoạt tính độc tố ST ly trích từ Salmonella Độc tố hoạt động khoảng pH - 9, bị phá hủy xử lý với trypsin protease Độc tố bền với nhiệt, hoạt tính 121oC 15 phút, trọng lượng phân tử khoảng 32 kDa Cơ chế tác động tương tự LT ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng c- GMP (Guanyl- cyclase monophotphate) tế bào dẫn đến nước tập trung vào ruột non sau 18 - 24 dẫn đến tiêu chảy 2.1.6 Dịch tễ học 2.1.6.1 Tác nhân truyền bệnh Salmonella diện khắp nơi tự nhiên Thực phẩm Salmonella thường điện sản phẩm có nguồn gốc từ thịt gia súc, gia cầm Ngoài ra, Salmonella diện trứng, sữa, sản phẩm thủy sản trai ốc sống, nước bẩn… Thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật nguồn gây ngộ độc Salmonella trừ rau ăn sống rau diếp, cà chua,… nguy hiểm bón phân tươi rửa nước bẩn Kem, nước đá làm nước bẩn truyền bệnh Phân người bệnh người lành mang vi khuẩn mãn tính làm bẩn nguồn nước, thức ăn,… [3, 4, 7, 8, 12, 13, 18, 25, 31] 10 2.1.6.2 Động vật cảm thụ Salmonella phân lập loại gia súc heo, bò…, gia cầm gà, chim, vịt…, thú thí nghiệm chuột bạch, thỏ, chuột lang Bệnh từ heo lây sang bị, chó, người Heo ổ chứa tự nhiên quan trọng, ảnh hưởng đến sức khoẻ cộng đồng Bệnh thường xảy đực [7, 10] 2.1.6.3 Nơi chứa mầm bệnh Máu, phủ tạng đặc biệt gan, lách, chất tiết, phân chứa vi khuẩn thể bại huyết cấp tính Một số trường hợp thú khoẻ mang mầm bệnh, tỷ lệ biến đổi tuỳ theo điều kiện, phương thức chăn nuôi Trong trường hợp này, Salmonella sống hoại sinh ruột, hạch ruột, túi mật, phân, hạch hầu … Bằng thực nghiệm nhà khoa học chứng minh S typhimurium diện với tỷ lệ 93,5% hạch amygdale, 71% manh tràng, 55% hạch bạch huyết hàm 45% hạch bạch huyết van hồi tràng heo giết mổ vào tuần thứ 20 - 28 sau nhiễm Một số, tìm thấy dịch tiết đường sinh dục, dịch hoàn [3, 10, 14] 2.1.6.4 Đường xâm nhập Salmonella xâm nhập vào thể chủ yếu qua đường tiêu hóa thơng qua thức ăn, nước uống bị nhiễm, dụng cụ chăm sóc, vận chuyển… Đơi chúng xâm nhiễm qua đường hô hấp, qua đường sinh dục qua con, trứng qua đường tiêm phúc mạc da [10] 2.1.6.5 Sự đề kháng vật chủ với bệnh Salmonella a Rào cản thể ký chủ Hệ tiêu hóa hệ thống bao gồm quan tiêu hóa miệng, họng, thực quản, dày, ruột non, ruột già, trực tràng hậu môn Sau thể ký chủ ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, để xâm nhiễm vào bên gây bệnh, vi khuẩn Salmonella phải sống sót vượt qua rào cản tự bảo vệ ký chủ Rào cản Salmonella có ký chủ chun biệt hay khơng tích cực [3, 4, 9, 19, 29] −Đối với ký chủ không chuyên biệt: Khả chống lại định cư xâm nhiễm Salmonella vào quan ký chủ tương đối khác 30 2,8 x 109 S enteritidis 99.303 2,5 x 108 1,4 x 108 S enteritidis 02.158 9,0 x 107 1,5 x108 S typhimurium 1,3 x 108 1,8 x 108 S typhimurium 02.157 1,4 x 107 Chết Bệnh Khỏe mạnh Khỏe mạnh Bệnh Bệnh Khỏe mạnh Khỏe mạnh Bệnh Bệnh Bệnh Bệnh Bệnh Bệnh Khỏe mạnh Khỏe mạnh 8,2 x 105 2,5 x 102 0 5,3 x 102 2,1 x 104 1,8 x 101 8,9 x 101 2,1 x 104 4,7 x 102 9,5 x 103 1,3 x 103 2,2 x 102 0 2,1 x 106 5,2 x 102 0 3,6 x 102 3,2 x 103 0 1,2 x 102 3,2 x 103 5,5 x 101 4,4 x 103 2,0 x 103 3,0 x 102 0 Kết bảng 4.3 cho thấy chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả xâm nhiễm vào gan lách hai quan chuột Ngoại trừ, chủng S enteritidis 99.303 S typhimurium 02.157 với mật độ gây nhiễm tương ứng 2,5 x 108 1,4 x 107 CFU/ml khơng có khả xâm nhiễm vào gan, lách, đồng thời biểu bệnh lý chuột chủng không rõ ràng mật độ gây nhiễm cao xâm nhiễm vào gan, lách với mật độ cao Ở chủng S enteritidis 99.303 có khả gây chết chuột, mật độ Salmonella diện gan 8,2 x 105 lách 2,1 x 106 CFU/ml Kết cho thấy để gây chết chuột trước 14 ngày, mật độ gây nhiễm vào phải lớn 109 CFU/ml, Salmonella diện gan, lách với mật độ cao từ 105 – 106 CFU/g Các chủng cịn lại cho thấy có khả xâm nhiễm vào gan, lách với mật độ thấp nên không làm chết chuột 4.2.2 Mật độ xâm nhiễm vào gan lách chuột chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Thí nghiệm khảo sát khả xâm nhiễm vào gan lách chủng Salmonella từ thực phẩm tiến hành tương tự chủng từ bệnh phẩm Khảo sát thực 10 chủng Salmonella, kết thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Mật độ xâm nhiễm vào gan lách chuột chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm 31 Chủng Samonella SP 1b Salmonella SP 1a Salmonella SP 2a Salmonella SB 10 Salmonella SB 11 Salmonella Ô13 Salmonella B34 Salmonella M14 Salmonella VTr11 Salmonella H51 Kết Mật độ Salmonella gây nhiễm (CFU/ml) Biểu chuột Mật độ Salmonella (CFU/g) Gan Khỏe mạnh 3,3 x 102 Khỏe mạnh Khỏe mạnh 6,6 x 1010 Khỏe mạnh Khỏe mạnh 4,8 x 109 Khỏe mạnh Bệnh 4,9 x 103 5,9 x 1010 Khỏe mạnh Khỏe mạnh 2,5 x 108 Khỏe mạnh 6,1 x 101 Khỏe mạnh 1,5 x 109 Khỏe mạnh Khỏe mạnh 2,4 x 1011 Khỏe mạnh Khỏe mạnh 8,3 x 101 1,5 x 108 Khỏe mạnh 8,3 x 101 Khỏe mạnh 5,7 x 107 Khỏe mạnh Bệnh 5,7 x 103 4,8 x 108 Khỏe mạnh 1,4 x 102 bảng 4.4 cho thấy 10 chủng Salmonella phân 1,1 x 108 Lách 4,0 x 102 0 0 8,1 x 103 0 8,5 x 101 0 0 0 0 2,2 x 104 2,0 x 102 lập từ thực phẩm có chủng khơng có khả xâm nhiễm vào gan lách chuột sau bị gây nhiễm, chủng cịn lại có khả xâm nhiễm vào gan hay lách với mật độ thấp, từ 1,0 x 101 – 1,0 x 104 CFU/g Trong 14 ngày theo dõi chuột sau gây nhiễm khơng thấy có biểu bệnh lý, ngoại trừ Samonella SB 10 H51 Chủng Salmonella SB 10 H51 có khả gây bệnh chuột, với mật độ xâm nhiễm vào gan lách từ 1,0 x 103 – 1,1 x 104 CFU/g Như vậy, chủng Salmonella phân lập từ thực phẩm khơng có khả gây bệnh hay có khả gây bệnh với biểu bệnh tương đối nhẹ có xù lông không bị giảm cân sau 14 ngày theo dõi 4.2.3 So sánh khả xâm nhiễm vào gan lách chủng Salmonella từ bệnh phẩm từ thực phẩm Qua kết bảng 4.3 bảng 4.4 thấy có khác biệt rõ ràng khả gây bệnh gây chết xâm nhiễm vào quan nội tạng gan lách chuột chủng Salmonella phân lập từ bệnh phẩm thực phẩm Tất chủng Salmonella từ 32 bệnh phẩm có khả xâm nhiễm vào gan lách chuột, ngoại trừ hai chủng S enteritidis 99.303 chủng S typhimurium 02.157 với mật độ gây nhiễm thấp khơng đủ để gây bệnh chuột khơng có khả xâm nhiễm vào gan lách Nhưng tăng mật độ gây nhiễm lên chúng gây bệnh xâm nhiễm vào gan lách chuột với mật độ cao Trong đó, chủng Salmonella từ thực phẩm, trừ chủng Salmonella SB 10 H51 có khả gây bệnh chuột, chủng cịn lại khơng có khả xâm nhiễm hay xâm nhiễm vào gan hay lách với mật độ thấp từ 83 – 250 CFU/g Từ ta kết luận rằng, chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả xâm nhiễm gây bệnh mạnh chủng có nguồn gốc từ thực phẩm Qua kết thí nghiệm cho phép kết luận độc lực chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thấp, chí số chủng không biểu độc lực gây nhiễm vào chuột thí nghiệm 33 4.3 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG XÂM NHIỄM SALMONELLA VÀO CÁC CƠ QUAN CỦA HỆ TIÊU HÓA CHUỘT 4.3.1 Khả xâm nhiễm vào quan hệ tiêu hóa chuột chủng Salmonella nuôi cấy môi trường nhân tạo 4.3.1.1 Khả xâm nhiễm vào quan thuộc hệ tiêu hóa chuột chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm Các đối tượng khảo sát nghiên cứu gồm: dày, ruột non ruột già, gan lách chuột Thí nghiệm thực nhằm mục đích nghiên cứu khả chống lại rảo cản thể vật chủ Salmonella sau chúng đưa vào thể chuột đường tiêu hóa Chủng chọn khảo sát S enteritidis 99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm người Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cung cấp Sở dĩ chủng chọn chúng có độc lực cao số chúng khảo sát Thí nghiệm thực với đối chứng chuột không gây nhiễm Salmonella Kết khảo sát đối chứng cho thấy không phát Salmonella quan khảo sát Kết khảo sát chuột bị gây nhiễm thể bảng 4.5 biểu đồ 4.1 Bảng 4.5 Mật độ xâm nhiễm vào quan thuộc hệ tiêu hóa chuột chủng S enteritidis 99.303 34 6,00 Mật độ nhiễm Thời gian sau (CFU/ml) 5,50 Mật độ Salmonella (CFU/g) nhiễm MẬT ĐỘ XÂM NHIỄM (tính theo logN) Lách Dạ dày 15 phút 4,6 x 103 8,9 x 103 2,9 x 104 0 5,00 Gan 8,9 x 103 1,5 x 104 2,7 x 103 0 2 Ruột non Ruột già ngày 1,4 x 103 6,0 x 102 8,3 x 101 1,4 x 103 3,7 x 103 2,8 x 102 3,9 x 104 2,9 x 105 9,9 x 101 0 2,3 x 103 9,7 x 103 0 2,4 x 103 8,7 x 103 0 7,5 x103 6,6 x 104 2,5 x 102 0 14 ngày 2,00 3,1 x 103 13 ngày 2,50 11 ngày 3,00 ngày 1,2 x 10 3,50 ngày 4,0 x 10 ngày 4,00 1,9 x 10 ngày 4,50 1,1 x 103 9,5 x 103 0 1,50 1,00 0,50 0,00 15' 2h Gan Lách Dạ dày Ruột non 11 13 NGÀY Ruột già 14 35 4.3.1.2 Khả xâm nhiễm vào quan thuộc hệ tiêu hóa chuột chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Thí nghiệm tiến hành tương tự với chủng bệnh phẩm Chủng chọn thí nghiệm Salmonella SP 1a Sở dĩ chọn chủng để đại diện cho nhóm Salmonella khơng có khả biểu bệnh chuột Kết khảo sát thể bảng 4.6 biểu đồ 4.2 Bảng 4.6 Mật độ xâm nhiễm vào quan thuộc hệ tiêu hóa chuột chủng Salmonella SP 1a Mật độ gây nhiễm Thời gian Mật độ Salmonella (CFU/g) (CFU/ml) gây nhiễm Gan Lách Dạ dày 1,7 x 1010 15 phút ngày ngày 10 ngày 12 ngày 14 ngày 5,5 x 102 8,3 x 101 2,2 x 103 2,4 x 103 0 0 6,8 x 103 4,0 x 103 2,2 x 103 2,8 x 103 1,5 x 102 0 0 8,8 x 103 4,0 x 103 1,0 x 102 4,4 x 102 0 0 0 Ruột non Ruột già 0 0 2,1 x 102 0 0 0 0 0 0 0 0 36 MẬT ĐỘ XÂM NHIỄM (tính theo logN) 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 15' 2h Gan Lách Dạ dày Ruột non 10 12 NGÀY 14 Ruột già Biểu đồ 4.2 Biểu diễn khả xâm nhiễm Salmonella SP 1a vào quan thuộc hệ tiêu hóa Kết bảng 4.6 biểu đồ 4.2, cho thấy Salmonella SP 1a tìm thấy gan lách giai đoạn sớm, sau 15 phút gây nhiễm chúng trì cớ quan đến ngày thứ 7, sau chúng bị đào thải hồn tồn ngồi thể Ở dày, vi sinh vật tìm thấy đến ngày thứ với mật độ 440 CFU/g, ruột non chúng tìm thấy ngày thứ Riêng ruột già khơng tìm thấy vi sinh vật sau 14 ngày gây nhiễm kết thí nghiệm cho thấy chủng Salmonella SP 1a có nguồn gốc thực phẩm có khả xâm nhiễm vào nội tạng gan, lách chuột, chúng khơng có khả biều bệnh độc lực kém, sau ngày xâm nhiễm chúng bị thể chuột loại thải hoàn toàn thể Kết thí nghiệm giải thích sau 14 ngày theo dõi sau gây nhiễm lại không phát Salmonella gan lách chuột kết mục 4.1.2 4.2.2 4.3.1.3 So sánh khả xâm nhiễm vào quan thuộc hệ tiêu hóa chuột chủng bệnh phẩm chủng từ thực phẩm 37 So sánh hai kết mục 4.3.1.1 4.3.1.2, cho thấy chủng S enteritidis 99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả xâm nhiễm vào gan, lách cao thời gian tồn lâu so với chủng Salmonella SP 1a có nguồn gốc từ thực phẩm Chủng từ bệnh phẩm S enteritidis 99.303 tồn sau 14 ngày gan lách chuột, mật độ chúng quan chưa có chiều hướng giảm Trong chủng từ thực phẩm Salmonella SP 1a sau ngày bị loại thải hồn tồn khỏi quan Cịn ruột non ruột già chủng có nguồn gốc từ bệnh phẩm hay thực phẩm khơng có khả xâm nhiễm hay có xâm nhiễm với mật độ thấp chúng không tồn lầu ống tiếu hóa Ngồi kết cho ta thấy dường khơng có mối liên hệ tính gây bệnh với khả xâm nhiễm vào quan thuộc ống tiêu hóa Salmonella 4.3.2 Khả tái xâm nhiễm chủng Salmonella Mục đích thí nghiệm nghiên cứu thay đổi độc lực sau Salmonella qua trình xâm nhiễm vào vật chủ 4.3.2.1 Khả tái nhiễm vào quan hệ tiêu hóa chuột chủng Salmonella từ bệnh phẩm Chủng S enteritidis 99.303 gây nhiễm vào thể chuột, nuôi chuột bị nhiễm khoảng - ngày Dịch gan chuột bị nhiễm xác định mật độ Salmonella sử dụng để gây nhiễm trở lại vào chuột khỏe mạnh Thí nghiệm tái gây nhiễm vào chuột, mổ chuột theo khoảng thời gian, quan sát quan hệ tiêu hóa định lượng mật độ Salmonella quan Kết thí nghiệm thể bảng 4.7 Bảng 4.7 Mật độ S enteritidis 99.303 dịch gan tái xâm nhiễm vào quan hệ tiêu hóa theo thời gian Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Mật độ Salmonella (CFU/g) Thời gian Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già 38 10 ngày 14 ngày 1,9 x 103 3,3 x 102 2,0 x 103 3,9 x 102 4,5 x 102 5,2 x 103 3,5 x 102 6,3 x 102 1,4 x 102 2,1 x 102 8,0 x 101 4,4 x 102 7,2 x 102 4,1 x 102 0 58 x 102 8,0 x 101 MẬT ĐỘ XÂM NHIỄM (tính theo logN) 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Gan Lách 10 Dạ dày Ruột non NGÀY 14 Ruột già Biểu đồ 4.3 Khả tái xâm nhiễm chủng S enteritidis 99.303 từ dịch gan vào hệ tiêu hóa chuột Kết bảng 4.7 biểu đồ 4.3, ta thấy chủng S enteritidis 99.303 có khả tái xâm nhiễm xuyên qua ống tiêu hóa mật độ gây nhiễm thấp, 1,9 x 103 từ dịch gan chuột Sau tái xâm nhiễm chúng có khả trì dày đến 14 ngày Sau ngày tìm thấy vi sinh vật nhiễm khắp quan khảo sát gan, lách, dày, ruột non ruột già chúng không bị đào thải suốt 14 ngày theo dõi Mật độ chúng nhiễm vào quan cao so với nuôi cấy môi trường nhân tạo BHI Mật độ Salmonella tái nhiễm gan lách cao với mật độ tế bào gây nhiễm vào ban đầu, chứng tỏ Salmonella tăng trưởng lên sau xâm nhiễm vào quan Từ kết kết luận chủng S enteritidis 99.303 phát triển mơi trường in vivo có khả xâm nhiễm gây 39 bệnh mạnh so với nuôi cấy chúng mơi trường nhân tạo (in vitro) Nói cách khác độc lực tăng lên chúng lần sống sót thích nghi với các điểu kiện chống cự thể vật chủ Hiện tượng do: (1) Chủng Salmonella thích nghi với khả xâm nhiễm, (2) Mơi trường in vivo hoạt hóa gen gây độc Salmonella gen bị kìm hãm ni cấy chúng mơi trường nhân tạo, (3) Chủng S enteritidis 99.303 gốc có độc lực giảm thời gian bảo quản cấy chuyền nhiều lần 4.3.2.2 Khả tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột chủng Salmonella từ thực phẩm Cách tiến hành thí nghiệm tương tự chủng Salmonella từ bệnh phẩm Chủng Salmonella từ thực phẩm dùng khảo sát Salmonella SP 1a Chủng Salmonella cho xâm nhiễm vào chuột, nuôi chuột bị nhiễm sau – ngày, dịch gan chuột bị nhiễm định lượng Salmonella tái gây nhiễm vào chuột Kết thí nghiệm thể bảng 4.8 Bảng 4.8 Mật độ Salmonella SP 1a tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột theo thời gian Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Thời gian ngày 5,5 x 103 ngày Mật độ Salmonella (CFU/ml) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già 0 2,0 x 102 0 90 0 5,5 x 10 1,5 x 10 ngày 4,2 x 10 9,8 x 10 0 12 ngày 0 0 40 MẬT ĐỘ XÂM NHIỄM (tính theo logN) 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Gan Lách Dạ dày Ruột non NGÀY 12 Ruột già Biểu đồ 4.4 Khả tái xâm nhiễm chủng Salmonella SP 1a từ dịch gan vào hệ tiêu hóa Qua kết thể bảng 4.8 biểu đồ 4.4, cho thấy chủng Salmonella SP 1a có khả tái nhiễm có khả sống sót dày đến ngày thứ trì gan lách đến ngày thứ Mật độ nhiễm vào gan vào lách cao so với nuôi cấy chúng nôi trường nhân tạo BHI, chí cao mật độ tế bào nhiễm ban đầu, chúng có khả tăng trưởng bệnh quan Song chúng khơng tìm thấy ruột non ruột già Qua 12 ngày Salmonella xâm nhiễm quan bị đào thải hoàn toàn Về biểu bệnh lý, chúng tái nhiễm vào gan lách mạnh so với ban đầu khơng có khả biểu bệnh chuột Qua kết cho thấy mặt dù chủng Salmonella SP 1a trải qua thích nghi mơi trường vật chủ (in vivo) độc lực chúng kém, chúng bị hệ thống phòng vệ vật chủ loại bỏ khỏi thể 41 4.3.2.3 So sánh khả tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột S enteritidis 99.303 Salmonella SP 1a Căn vào kết mục 4.3.2.1 4.3.2.2, cho thấy chủng S enteritidis 99.303 có khả xâm nhiễm vào tồn phận ta khảo sát gan, lách, dày, ruột non ruột già với mật độ tương đối cao so với mật độ tế bào nhiễm vào ban đầu Trong đó, chủng Salmonella SP1a nhiễm vào gan, lách khơng có khả bám vào thành ruột non, ruột già Ở dày chủng S enteritidis 99.303 từ bệnh phẩm có thời gian tồn lâu so với chủng Salmonella SP 1a từ thực phẩm Sau 12 ngày gây nhiễm chủng Salmonella SP 1a bị đào thải hồn tồn, chủng S enteritidis 99.303 trì mật độ xâm nhiễm cao quan hệ tiêu hóa chuột Từ kết cho thấy chủng Salmonella từ bệnh phẩm thực phẩm sau tái nhiễm có khả xâm nhiễm vào gan lách mạnh so với ban đầu nuôi cấy môi trường nhân tạo BHI Từ kết luận chủng Salmonella có nguồn gốc từ mơi trường in vivo có khả xâm nhiễm thích nghi mạnh so với phân lập từ môi trường in vitro 4.4 KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA MÔI TRƯỜNG XUNG QUANH ĐẾN CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Để khẳng định Salmonella nhiễm gây bệnh cho chuột có nguồn gốc từ gây nhiễm, khơng có nhiễm bẩn từ yếu tố bên ngồi, lơ thí nghiệm chúng tơi tiến hành phân tích Salmonella thức ăn nước uống chuột Bên cạnh đó, lơ thí nghiệm có chuột dùng làm đối chứng âm, chuột cho uống nước hấp vô trùng thay cho dịch vi khuẩn Chuột dùng làm đối chứng âm nuôi cách biệt với chuột gây nhiễm, điều kiện khảo sát thực tương tự lơ thí Kết cho thấy yếu tố bên thức ăn, nước uống, môi trường nuôi chuột không bị nhiễm Salmonella Các chuột lơ đối chứng âm khơng có dấu hiệu bệnh lý, chúng khỏe mạnh, nhanh nhẹn tăng trọng Kết khảo sát quan hệ tiêu hóa gan, lách, dày, ruột non ruột già cho thấy khơng có diện Salmonella Qua kết trên, loại bỏ khả xâm nhiễm Salmonella yếu tố bên thức ăn, nước uống, môi trường xung quanh 42 43 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Những nghiên cứu thực bước đầu so sánh khác khả xâm nhiễm, gây bệnh gây chết chuột chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm từ thực phẩm Từ kết nhận cho phép rút kết luận sau: - Có khác biệt rõ rệt khả xâm nhiễm, gây bệnh gây chết chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm từ thực phẩm.,4/4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả gây bệnh gây chết chuột Trong 10 chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm có 2/10 chủng có khả gây bệnh cịn 8/10 chủng khơng có khả gây bệnh, khơng có chủng có khả gây chết chuột Như chủng Salmonella từ bệnh phẩm có độc lực mạnh chủng từ thực phẩm - Có khác biệt khả xâm nhiễm vào gan lách chuột chủng Salmonella từ bệnh phẩm từ thực phẩm 4/4 chủng từ bệnh phẩm có khả xâm nhiễm vào gan lách chuột 5/10 chủng từ thực phẩm có khả xâm nhiễm vào Hầu khơng có khác biệt khả xâm nhiễm vào dày, ruột non ruột già chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm từ thực phẩm - Các chủng Salmonella nuôi cấy mơi trường tổng hợp nhân tạo có khả xâm nhiễm gây bệnh so với chủng qua giai đoạn sinh trưởng môi trường tự nhiên nội tạng chuột 5.2 ĐỀ NGHỊ Nếu nghiên cứu thực tiếp tục, đề nghị tiến hành với nội dung sau: - Nghiên cứu thời gian Salmonella bị đào thải hoàn tồn khỏi thể chuột chủng khơng gây bệnh chưa đủ liều gây chết chuột - Tiến hành khảo sát chủng Salmonella với số lượng lớn hơn, đặc biệt chủng Salmonella từ thực phẩm môi trường - Nghiên cứu khác biệt di truyền, biểu gen tham gia trình xâm nhiễm gây bệnh chủng Salmonella từ bệnh phẩm Salmonella từ thực phẩm, môi trường 44 ... chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm 28 STT 10 Chủng Salmonella SP 1b Salmonella SP 2a Salmonella SP 1a Salmonella SB 10 Salmonella SB11 Salmonella Ô13 Salmonella B34 Salmonella M14 Salmonella. .. chuột chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm 31 Chủng Samonella SP 1b Salmonella SP 1a Salmonella SP 2a Salmonella SB 10 Salmonella SB 11 Salmonella Ô13 Salmonella B34 Salmonella M14 Salmonella. .. trúc kháng nguy? ?n Hiện nay, phương pháp vào đặc tính sinh hóa để phân loại Salmonella, việc dựa vào cấu trúc kháng nguy? ?n để xác định kiểu huyết Salmonella sử dụng phổ biến Mỗi dịng Salmonella