Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis 10

Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis sạch bằng quy trình nuôi trong hệ kín

41 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 42 2.1 Phương pháp chủng Spirulina Nguồn giống Giống Spirulina cung cấp từ Phịng Cơng nghệ biến đổi sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới – Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam Giống phân lập giữ môi trường Zarrouk chứa 1,5% agar Dịch sinh khối chuẩn bị môi trường Zarrouk dạng dịch ni điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phịng thí nghiệm đạt nồng độ sinh khối khoảng 0,6 g/l Việc nuôi Spirulina môi trường dịch thể thực hệ ống thủy tinh Spirulina chủng (tinh giống) tia cực tím (UV) ni rửa mơi trường Zarrouk vơ trùng 2.1.1 Tia UV [30] Sử dụng bóng UV cơng suất 15 W, công suất đầu tia UV 4,9 W Cách làm: sau 15 ngày nuôi, dịch nuôi Spirulina chiếu UV với thời gian 0, 5, 10, 15, 30, 60 phút Khoảng cách đến bóng đèn UV 50 cm, có khuấy dịch ni máy khuấy từ chiếu UV với tốc độ 155-175 vịng/phút Độ sâu dịch ni 1-2 cm Sau chiếu UV, Spirulina giữ 22-24 điều kiện phịng thí nghiệm Tiếp theo, mẫu nhuộm fucshine quan sát kính hiển vi Dịch ni cấy lên môi trường thạch-cá-peptone để phát khuẩn lạc vi khuẩn nhiễm tạp Dịch nuôi đánh giá Spirulina cho chủng xuất vi khuẩn tạp sau hai ngày nuôi 2.1.2 Môi trường Zarrouk vô trùng Cách làm: sau 15 ngày nuôi, Spirulina ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút 7-10 phút, thu phần sinh khối lắng xuống đưa lại vào môi trường Zarrouk vô trùng (1210C, 15 phút) Khuấy nhẹ tiếp tục ly tâm, thu sinh khối lắng xuống, ly tâm lặp lại ba lần Ở lần sau cùng, thu lấy sinh khối cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng Khi xuất sợi Spirulina phát triển thu lấy phần đầu sợi cho vào ống nghiệm chứa sẵn môi trường Zarrouk vơ trùng, để n nhiệt độ phịng Sau khoảng 12-14 nuôi, sinh khối ống nghiệm rửa qua 5-7 ống nghiệm khác chứa môi trường 43 Zarrouk vô trùng Spirulina rửa cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng, lại tiếp tục thu lấy sợi Spirulina phát triển ra, đưa vào ống nghiệm chứa môi trường Zarrrouk vô trùng, để nuôi 12-14 điều kiện phịng thí nghiệm, lặp lại trình thu sinh khối Kiểm tra mức độ khiết Spirulina nhuộm fucshine quan sát kính hiển vi, dịch nuôi cấy lên môi trường thạch - cá - peptone để phát khuẩn lạc vi khuẩn nhiễm tạp Dịch nuôi đánh giá Spirulina cho chủng sau hai lần kiểm tra mà không xuất vi khuẩn tạp nhiễm Môi trường Zarrouk [5] Bảng 2.1 Thành phần môi trường Zarrouk Hóa chất Khối lượng (g/l) NaHCO3 16,80 NaNO3 2,50 NaCl 1,00 K2HPO4 0,50 MgSO4 0,20 CaCl2 0,04 K2SO4 1,00 FeSO4 0,01 Na- EDTA 0,08 Dung dịch A5 ml/l Dung dịch A6 ml/l Độ pH – 10 - Dung dịch A5: + H3BO3 2,86 g/l + MnCl2.4H2O 1,81 g/l 44 + ZnSO4.7H2O 0,22 g/l + CuSO4.5H2O 0,08 g/l + MoO3 0,01 g/l - Dung dịch A6: + NH4VO3 229 x 10-4 g/l + K2Cr2(SO4)3.24H2O 960 x 10-4 g/l + NiSO4.7H2O 478 x 10-4 g/l + Ti2(SO4)3 400 x 10-4 g/l + Co(NO3)2.6H2O 44 x 10-4 g/l + NaWO4 179 x 10-4 g/l EDTA = Ethylene Diamine Tetra Acetat 2.2 Xác định nồng độ tế bào ban đầu để ni Spirulina Thí nghiệm sau: ni Spirulina với nồng độ tế bào 0,1; 0,2; 0,3 0,4 g/l mơi trường Zarrouk Bố trí sau: 200 ml dịch ni chứa chai PET thể tích 330 ml, có lắp, chất liệu polyethylen (PE), ni tĩnh, điều kiện phịng thí nghiệm Sự thay đổi nồng độ tế bào theo dõi trọng lượng khô theo ngày nuôi vào khoảng 4-5 chiều Từ giá trị trên, so sánh kết kết luận giá trị tối ưu 2.3 Hệ thống nuôi Spirulina 2.3.1 Thiết kế hệ thống Spirulina nuôi hai hệ thống: hở (trong điều kiện tự nhiên) kín (trong điều kiện có điều khiển) Khí sục vào hệ hở hệ kín lọc bơng thủy tinh (BTT) than hoạt tính (THT) xếp xen kẽ thành lớp (BTT-THT-BTT-THT-BTT) Hệ kín rửa dung dịch có độ pH 9-10 trước đưa vào nuôi S platensis 2.3.1.1 Hệ hở 45 Hệ hở làm từ chậu 30 lít, thể tích dịch ni 10-20 lít, chất liệu polyvinylclorua (PVC) 2.3.1.2 Hệ kín Hệ kín ống hình trụ làm từ thủy tinh PE suốt Đường kính 3,1 cm, đường kính ngồi 3,3 cm, chiều dài ống 120 cm, độ truyền suốt 95%, ống nối với nhờ nối PVC có khả lắp vào tháo dễ dàng 2.3.2 Hoạt động hệ thống 2.3.2.1 Hoạt động hệ hở Đối với hệ thực vị trí với hệ kín (để có cường độ ánh sáng), sử dụng môi trường Zarrouk để nuôi, thời gian theo dõi từ 10-30 ngày Chế độ đảo trộn: liên tục suốt q trình ni máy sục khí Các tiêu tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein sinh khối thu kết thúc q trình ni ghi nhận để từ so sánh với hệ kín 2.3.2.2 Hoạt động hệ kín Thí nghiệm Về cường độ ánh sáng vận tốc dịng khí: Spirulina ni hai vị trí tương ứng với hai chế độ ánh sáng bảng 2.2 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm cường độ ánh sáng vận tốc dịng khí a) Dưới ánh nắng trực tiếp b) Có mái che Vận tốc dịng khí Vận tốc dịng khí (m/giây) (m/giây) 0,1 0,2 0,3 0,1 0,2 0,3 Sục khí liên tục q trình nuôi Chỉ tiêu theo dõi: thời gian tăng trưởng, suất sinh khối, hàm lượng protein sắc tố 46 Thí nghiệm Về thời gian sục khí thực theo bảng 2.3 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm thời gian sục khí Nguồn carbon, cường Thời gian sục khí độ ánh sáng, vận tốc Chỉ tiêu theo dõi dịng khí Khơng sục - Thời gian tăng ngày (7-17 giờ) Bicarbonate, cường độ trưởng ánh sáng vận tốc - Năng suất sinh dịng khí tìm thí khối nghiệm Sục khí 9-10 giờ/ngày vào ban - Hàm lượng protein sắc tố Sục khí liên tục thời gian ni Thí nghiệm Về nguồn carbon cung cấp cho S platensis bảng 2.4 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm nguồn carbon cung cấp cho S platensis Nguồn carbon Không khí bicarbonate CO2 khơng khí Mơi trường Cường độ ánh sáng, vận tốc dịng khí Zarrouk Cường độ ánh sáng vận Zar- tốc dịng khí tìm thí nghiệm CO2 từ lên men cồn Zar- Chỉ tiêu theo dõi: thời gian tăng trưởng, suất sinh khối, hàm lượng protein sắc tố Chú giải: mơi trường Zar- mơi trường Zarrouk khơng có NaHCO3 47 Ngồi ra, hiệu suất sử dụng khí CO2 phân tích nhằm xem xét khả dùng nguồn khí lên men cồn cho ni Spirulina quy mô lớn đề xuất giải pháp để tận dụng nguồn CO2 tinh 2.4 Phương pháp lên men cồn ethylic [6], [8] Nguyên liệu Giống nấm men Mật rỉ Bình lên men thể tích 25 lít Mơi trường Hansen (xem bảng 2.5) Bảng 2.5 Thành phần mơi trường Hansen Hóa chất Khối lượng (g/l) Peptone 10 Glucose 50 KH2PO4 MgSO4 7H2O Nước cất Đủ 1000 ml 48 Quy trình lên men cồn ethylic tiến hành theo sơ đồ 2.1 Giống nấm men chủng tăng sinh Mật rỉ pha lỗng đến nồng độ đường 15-20 % mơi trường Hansen Tăng sinh môi Lên men trường mật rỉ pha lỗng bình 25 lít, 3-7 ngày Thu khí CO2 - Xác định hàm lượng - Sục vào hệ thống ni Sơ đồ 2.1 Quy trình lên men cồn ethylic 2.5 Xác định nồng độ CO2 Nồng độ CO2 xác định máy TELAIRE 7001 (CO2/Temperature Monitor, USA), đo từ 0-10000 ppm lớn hơn, độ xác ± 50 ppm Nguyên tắc hoạt động: máy TELAIRE 7001 dựa khác biệt nồng độ CO2 bên bên ngồi để tính lượng CO2 có mẫu phân tích 2.6 Xác định cường độ ánh sáng độ truyền suốt vật liệu làm hệ thống Cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng xác định máy LI-250A Light Meter với cảm biến lượng tử LI-190SA Cường độ ánh sáng quang hợp số lượng lượng tử ánh sáng tới nằm dải sóng 400-700 nm đơn vị thời gian đơn vị diện tích µmol s-1m-2 = µE s-1m-2 = 6.022 X 1017 photons s-1m-2 49 Độ truyền suốt % độ truyền suốt = AS2 ×100 AS1 Trong đó: AS1 cường độ ánh sáng bề mặt ống, µmol s-1m-2, AS2 cường độ ánh sáng bề mặt ống, µmol s-1m-2, 100 số chuyển sang phần trăm 2.7 Xác định độ oxy hòa tan Độ oxy hòa tan xác định máy SIGMA 950 với đầu dò oxy Nguyên tắc: dựa theo cực phổ oxy máy Để đo lượng oxy hòa tan máy bao gồm: điện cực làm việc kim loại quý (bằng Pt) điện cực đối Ag Dung dịch điện phân KCl, màng làm teflon Một hiệu điện tạo hai điện cực làm oxy tạo bị khử qua màng Lượng bị khử với lượng oxy hòa tan tạo ra, xác định lượng oxy hòa tan ban đầu 2.8 Phương pháp thu hoạch sinh khối [19], [20] Sinh khối Spirulina thu hoạch theo hai cách: lọc chân không máy AUTOSCIENCE lọc trọng lực vải polyeste Hiệu suất lọc tính độ chênh lệch sinh khối trước sau lọc theo cách sau: thể tích V ml dịch nuôi chưa lọc, dịch thu sau lọc chân không lọc vải đem sấy 100-1050C đến trọng lượng khơng đổi Hiệu suất tính theo cơng thức sau: HSlck = m2 × 100 m1 HSlv = m3 ×100 m1 Trong đó: HSlck hiệu suất lọc chân không, %, HSlv hiệu suất lọc vải, %, m1 khối lượng sau sấy dịch chưa lọc, g, m2 khối lượng sau sấy dịch lọc chân không, g 50 m3 khối lượng sau sấy dịch lọc vải 2.9 Phương pháp xác định trọng lượng khô sinh khối [38] Nguyên tắc Dựa vào bay nước nhiệt để tính độ chênh lệch khối lượng trước sau sấy Dụng cụ Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ Bình hút ẩm Cân phân tích, độ xác 0,0001 g Hóa chất Dung dịch HCl (pha loãng 1:1 với nước cất) Khi dùng, lấy 0,5 ml dung dịch pha thành 100 ml nước cất để sử dụng Cách tiến hành Sấy giấy lọc nhiệt độ 70oC qua đêm, để nguội đem cân, ghi lại trọng lượng G1 Lấy 10 ml dịch nuôi, lọc qua giấy lọc Rửa phần giấy lọc HCl để loại khoáng lẫn sinh khối Giấy lọc với sinh khối giấy lọc sấy 700C qua đêm Làm nguội bình hút ẩm đem cân, ghi lại trọng lượng G2 Kết Trọng lượng khô (DW) xác định theo công thức DW = G2 − G1 x1000 10 (g/l) Trong đó: 10 thể tích dịch ni, ml, 1000 số chuyển đổi từ ml sang l, G2 trọng luợng giấy lọc sinh khối sấy, g, G1 trọng luợng giấy lọc sấy, g 51 2.10 Tính số Renolds [28] Số Renolds (Re) đường ống tính theo cơng thức sau: Re = VxD Kv Trong đó: Kv độ nhớt động học nước 300C 1,141 x 10-6 m/s2, D đường kính ống, m, V vận tốc chất lỏng, m/s 2.11 Tính suất sinh khối (P) [34] Xt − X0 (g/l/ngày) t − t0 P= Trong : X0 nồng độ sinh khối thời gian t0 (ngày thứ 1), g/l, Xt nồng độ sinh khối thời gian t (ngày có nồng độ sinh khối cao nhất) sau t0 (ngày), g/l 2.12 Định lượng chlorophyll [14], [28] Nguyên tắc: dựa vào bước sóng hấp phụ cao chlorophyll để thu lấy giá trị A đo mầu Dụng cụ Máy đồng hóa tốc độ cao Hóa chất Methanol tuyệt đối Cách tiến hành Lấy 10 ml mẫu đem lọc, thu phần giấy lọc cho vào ống 20 ml có vạch chia thể tích thêm 5-15 ml methanol Đồng hóa mẫu với tốc độ 5000-15000 vòng/phút, 5-10 phút Sau đồng hóa để nhiệt độ phịng 10-20 phút Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm tốc độ 8000-10000 vòng/phút, 5-7 phút 52 Thu phần dịch nổi, mầu trong, đem đo bước sóng 665 nm với dung dịch methanol làm mẫu chứng Ghi nhận hai giá trị tương ứng A665 Tính kết Chlorophyll tổng (mg/g) = 13,9 xA665 x10 a Trong đó: A665 độ hấp thu chlorophyll bước sóng 665 nm, 13,9 hệ số hấp thu chlorophyll bước sóng 665 nm, a khối lượng mẫu có 10 ml dịch phân tích, g 2.13 Định lượng phycocyanin [14] Nguyên tắc Phycocyanin có độ hấp phụ cực đại bước sóng 618 nm, dựa vào giá trị A đo để tính hàm lượng phycocyanin có mẫu phân tích Dụng cụ Máy đo cường độ mầu Máy đồng hóa ULTRA-TURRAX T8 (IKA-WERKE, 5000–25000 vịng/phút, 100w, Germany) Máy ly tâm lạnh Hóa chất Dung dịch đệm phosphate 100mM (10,64g K2HPO4 5,29g KH2PO4 pha lít nước cất, pH 7) Cách tiến hành Lấy 10 ml mẫu, lọc, thu phần giấy lọc, cân a g từ sinh khối lọc cho vào ống ly tâm, sau cho 10 – 15 ml dung dịch đệm phosphate vào ống ly tâm, lắc kỹ Đồng hóa mẫu khoảng thời gian 5-10 phút, tốc độ 10000-15000 vòng/phút máy ULTRA-TURRAX T8 Để 370C 24 đồng hồ Khi đủ thời gian, đem ly tâm tốc độ 3500 vòng/phút thời gian 10 phút 53 Sau ly tâm, thu phần dịch đo cường độ mầu bước sóng 618 nm, sử dụng đệm phosphate làm mẫu chứng Tính kết Phycocyanin (mg/g) = A618 x10 3,39 xa Trong đó: a trọng lượng sinh khối thí nghiệm, g, A618 giá trị hấp thu đo mẫu, 3,39 hệ số hấp thu phycocyanin bước sóng 618 nm 2.14 Định lượng carotenoid [16] Nguyên tắc: dựa vào tính tan dung mơi hữu để tách chiết carotenoid khỏi nguyên liệu Dựa vào giá trị A thu đo mầu để tính hàm lượng carotenoid có nguyên liệu Dụng cụ Giấy lọc Phễu tách Máy quang phổ so mầu Bể ổn nhiệt Hóa chất Diethyl ether Ethanol 960 Dung dịch KOH 60% Dung dịch NaCl 9% Na2SO4 khan Cách làm Cân a g mẫu khô (hoặc V ml mẫu dạng lỏng, lọc qua giấy lọc, lấy phần giấy lọc làm thí nghiệm) cho vào cốc 100 ml Thêm 10-20 ml KOH 60%, lắc kỹ, đồng hóa mẫu máy để bể ổn nhiệt 500C 5-10 phút 54 Ly tâm mẫu với tốc độ 8000-10000 vòng/phút, phút Chuyển phần dịch vào phễu tách thêm 15-25 ml diethyl ether 20-30 ml NaCl 9% Trộn kỹ để dịch phân làm hai lớp: mầu xanh dưới, mầu vàng Cẩn thận, thu lấy phần mầu xanh Thêm NaCl 9% lặp lại bước dịch tách thành hai lớp mầu vàng mầu trắng suốt Tách thu lấy phần dịch mầu vàng, cho thêm lượng nhỏ Na2SO4 vào để hấp thu nước Thêm diethyl ether vào dịch mầu vàng tới 25 ml trộn 10 Đo mầu bước sóng 450 nm với dung dịch diethyl ether làm mẫu chứng Tính kết quả: Carotenoid (mg/g) = A450 x 25 260 xa Trong đó: A450 độ hấp phụ đo bước sóng 450 nm, a trọng lượng mẫu thí nghiệm, g, 260 hệ số hấp thu carotenoid bước sóng 450 nm 2.15 Định lượng carbohydrate [3] Nguyên tắc: định lượng dựa phản ứng mầu đặc trưng cho đường với diện H2SO4 Sự xác kết tùy thuộc vào: Độ dụng cụ Độ tinh khiết thuốc thử H2SO4 Nhiệt độ cố định suốt thời gian đun Hoá chất Cồn 80o, cồn 90o 55 Phenol 5% cồn H2SO4 đậm đặc Dung dịch đường saccharose 0,1%: 500 mg saccharose, sấy khô 60oC hoà tan 500 ml nước cất Cách tiến hành Bước Ly trích đường Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau cân xác – g nguyên liệu nghiền nhuyễn chứa khoảng – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh 50 ml, cho thêm 10 ml cồn 90o vào Đun cốc nồi cách thủy cho sôi lần (mỗi lần sôi lấy cốc cho nguội bớt đặt trở lại) Khuấy que thủy tinh, để nguội, lọc qua giấy lọc (giữ cặn, không đổ cặn lên giấy lọc) Sau thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi lần nồi cách thủy Để nguội, lọc Tiếp tục làm khoảng lần Sau đưa cặn lên giấy lọc tráng cốc – lần cồn 80o nóng (nước tráng cho lên giấy lọc) Dịch lọc cho bay nhiệt độ phòng đun nhẹ nồi cách thủy để cồn bay hết Pha loãng cặn thu với nước cất thành 50 ml Để lắng, dung dịch đem mầu để xác định hàm lượng đường, pha lỗng dung dịch đường tùy theo nồng độ đường có dung dịch nhiều hay Bước Thực phản ứng mầu Hút ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm thêm vào ml dung dịch phenol 5% Sau cho xác ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm (không để giây acid vào thành ống) Để 10 phút lắc, giữ nồi cách thủy 10 – 20 phút 25 – 30oC để mầu Bước Xây dựng đường chuẩn Lấy bình định mức 100 ml bổ sung bảng 2.6 56 Bảng 2.6 Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn saccharose Bình Saccharose 0,1% (ml) Nước cất (ml) 1 99 2 98 3 97 4 96 5 95 6 94 7 93 Chuẩn bị ống nghiệm, cho vào ống bảng 2.7 Bảng 2.7 Thí nghiệm phản ứng mầu đường saccharose Ống Dung dịch saccharose Phenol 5% (ml) H2SO4 Nồng độ saccharse (ml) (μg) 1 ml bình số 1 10 ml bình số 20 ml bình số 30 ml bình số 40 ml bình số 5 50 ml bình số 60 ml bình số 70 ml nước cất 57 Mầu bền vững vài Xác định cường độ mầu máy quang phổ so mầu bước sóng 490 nm Tính kết Vẽ đường cong chuẩn: trị số mật độ quang ống mẫu phải trừ trị số mật độ quang ống thử khơng Từ đó, ta xây dựng đường cong chuẩn Mặt khác, trị số mật độ quang dung dịch đường cần định lượng phải trừ trị số mật độ quang ống thử không, dựa vào đường chuẩn để suy nồng độ x μg, từ tính lượng đường mẫu 2.16 Định lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [3] Nguyên tắc Chất đạm vơ hố H2SO4 đậm đặc thành amonsulphat (NH4)2SO4 Muối đem cho tác dụng với kiềm mạnh NaOH giải phóng NH3: H2SO4đđ Chất đạm → (NH4)2SO4 Xúc tác (NH4)2SO4 + NaOH → 2NH3 + H2O + Na2SO4 Sau đó, lượng NH3 nước lơi sang bình tam giác có chứa lượng thừa H3BO3 mà H3BO3 tự phân ly: H3BO3 → HBO2 + H2O Khi cất đạm, NH3 bay sang phản ứng với HBO2 NH4OH + HBO2 → NH4 + BO-2 + H2O BO2- Là bazơ mạnh, dung dịch bình hứng chuyển từ mầu tím đỏ sang mầu xanh mạ Lượng BO2- tạo thành tương đương với NH3 đẩy trình cất đạm Xác định BO2- cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N Giai đoạn chuẩn độ kết thúc dung dịch chuyển từ mầu xanh mạ sang mầu tím đỏ BO2- + H+ → HBO2 58 Dụng cụ Máy Kjeldahl Burret 25 ml Bếp đun Bình chưng cất Hố chất Dung dịch H2SO4 đậm đặc Dung dịch NaOH 32% Dung dịch HCl 0,25N Chất xúc tác: hỗn hợp 60g selenium + 75g CuSO4 + 865g K2SO4 Hỗn hợp chị thị mầu: Hoà tan 0,624g methyl đỏ 250 ml cồn tuyệt đối Hoà tan 1,28g Bromocresol blue 50 ml cồn tuyệt đối Trộn dung dịch trên, bổ sung 96 ml HCl 0,25N Bổ sung đến lít cồn tuyệt đối Dung dịch acid boric 4% với thị mầu: làm tan 80g acid boric 1800 ml nước cất, đun nóng chút Để nguội bổ sung 25 ml hỗn hợp chất thị mầu Bổ sung đến lít nước cất Cách tiến hành Bước Vơ hố mẫu Tùy theo hàm lượng đạm có mẫu mà khối lượng mẫu vơ hóa nhiều hay ít, Cân a g mẫu nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung g chất xúc tác ml H2SO4 đậm đặc đặt lên bếp tiến hành phá mẫu tủ hút, đun đến dung dịch có mầu xanh suốt, tiếp tục đun thêm 30 phút Để nguội nhiệt độ phòng Khi phá mẫu xong, để nguội bổ sung 50 ml nước cất, trộn để nguội, lắp vào máy chưng cất 59 Bước Chưng cất mẫu Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 30ml NaOH 32% Khởi động quy trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung dịch thị mầu Ngừng chưng cất dịch chưng cất khơng cịn NH3 (thử giấy quỳ) Chuẩn độ HCl 0,25N Ngừng chuẩn độ xuất mầu phớt đỏ Tính kết Thơng qua lượng HCl 0,25N ta biết acid boric kết hợp với NH3 từ biết lượng NH3 giải phóng từ mẫu ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035 g nitơ % nitơ tổng (Ntổng) = VHCl 0,25 x0, 0035 a x100 Trong đó: VHCl thể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ, ml, a trọng lượng mẫu đem xác định, g Sau có kết Ntổng, tính hàm lượng protein trực tiếp nguyên liệu dựa theo công thức sau: % protein thô = % Ntổng x 6,25 2.17 Định lượng lipid phương pháp Soxhlet [3] Nguyên tắc Dùng ete nóng để hịa tan tất chất béo tự thực phẩm Sau làm bay hết ete, cân chất béo cịn lại tính hàm lượng lipid 100 g mẫu Dụng cụ hóa chất Máy Soxhlet Bếp đun Giấy lọc Ete dầu hoả Cách tiến hành Sấy giấy lọc kích thước x cm đến trọng lượng không đổi 60 Cân xác m g ngun liệu sấy khơ nghiền nhỏ cho vào giấy lọc, gói lại theo hình trụ, cân trọng lượng mẫu giấy trước chiết rút lipid Đặt giấy lọc có chứa mẫu vào trụ chiết bắt đầu chiết với ete dầu hỏa Sau chiết xong (khoảng đồng hồ), lấy mẫu ra, để tủ hút cho dung môi bay hết, sau sấy 1050C đến trọng lượng khơng đổi Tính kết Hàm lượng lipid có 100 g ngun liệu tính theo cơng thức sau: X= P−P x100 m Trong đó: X hàm lượng lipid có ngun liệu độ khơ tuyệt đối, %, P khối lượng gói nguyên liệu trước chiết lipid, g, P1 khối lượng gói nguyên liệu sau chiết lipid sấy, g, m khối lượng mẫu đem phân tích, g 2.18 Phương pháp xác định tổng nấm men, nấm mốc [7] Nguyên tắc: nấm men nấm mốc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cần nguồn carbon hữu từ môi trường bên Dựa vào đặc điểm để sử dụng kỹ thuật pha loãng, trải đếm khuẩn lạc mơi trường Plate Count Agar (PCA) Mơi trường hóa chất Môi trường tổng hợp PCA (casein, dịch chiết nấm men, dextrose, agar) Quy trình phân tích sơ đồ 2.2 61 Đồng pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 … Trải 0,1 ml mẫu lên đĩa thạch PCA, ủ nhiệt độ phòng 5-7 ngày Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính theo CFU/g CFU/ml Sơ đồ 2.2 Quy trình định lượng tổng nấm men, nấm mốc 2.19 Kiểm tra E coli Phương pháp ISO 16649-2 : 2001 2.20 Kiểm tra Salmonella Phương pháp ISO 6579 : 2002 2.21 Phương pháp xử lý thống kê SPSS ... điện tạo hai điện cực làm oxy tạo bị khử qua màng Lượng bị khử với lượng oxy hịa tan tạo ra, xác định lượng oxy hòa tan ban đầu 2.8 Phương pháp thu hoạch sinh khối [19], [20] Sinh khối Spirulina. .. dịch A6: + NH4VO3 229 x 10- 4 g/l + K2Cr2(SO4)3.24H2O 960 x 10- 4 g/l + NiSO4.7H2O 478 x 10- 4 g/l + Ti2(SO4)3 400 x 10- 4 g/l + Co(NO3)2.6H2O 44 x 10- 4 g/l + NaWO4 179 x 10- 4 g/l EDTA = Ethylene... phần sinh khối lắng xuống đưa lại vào môi trường Zarrouk vô trùng (1210C, 15 phút) Khuấy nhẹ tiếp tục ly tâm, thu sinh khối lắng xuống, ly tâm lặp lại ba lần Ở lần sau cùng, thu lấy sinh khối cấy