Phát triển kít chẩn đoán Phytoplasma gây bệnh chổi rồng trên sắn dựa trên kỹ thuật Lamp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ TUẤN NAM PHÁT TRIỂN KÍT CHẨN ĐOÁN PHYTOPLASMA GÂY BỆNH CHỔI RỒNG TRÊN SẮN DỰA TRÊN KỸ THUẬT LAMP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, tháng 12 năm 2014 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vũ Tuấn Nam PHÁT TRIỂN KÍT CHẨN ĐỐN PHYTOPLASMA GÂY BỆNH CHỔI RỒNG TRÊN SẮN DỰA TRÊN KỸ THUẬT LAMP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Cán hướng dẫn: TS Lê Tiến Dũng TS Trần Thị Dụ Chi Hà Nội, tháng 12 năm 2014 ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Tiến Dũng TS Trần Thị Dụ Chi, tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình giảng dạy, dìu dắt tơi thời gian học tập Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán học viên làm việc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nơng nghiệp hết lịng giúp đỡ tơi thực thành công luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho quãng thời gian qua Luận văn thực với hỗ trợ kinh phí từ Trung tâm Nghiên cứu Quốc tế Nông nghiệp Nhiệt đới (International Center for Tropical Agriculture – CIAT) cho TS Lê Tiến Dũng Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Vũ Tuấn Nam i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC THUẬT NGỮ VÀ TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu sắn 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại học lịch sử canh tác 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái sắn 1.1.2.1 Đặc trưng sinh thái 1.1.2.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Vai trò sắn 1.1.4 Tình hình sản xuất sử dụng sắn giới Việt Nam 1.2 1.1.4.1 Trên giới 1.1.4.2 Ở Việt Nam Bệnh chổi rồng sắn 11 1.2.1 Bệnh sắn nói chung 11 1.2.2 Bệnh chổi rồng sắn 11 1.3 Phytoplasma 13 1.3.1 Đặc điểm sinh học phân loại 13 1.3.2 Cơ chế truyền bệnh 16 1.3.3 Các giải pháp quản lý phòng trừ phytoplasma 17 1.4 Chẩn đoán phân tử bệnh trồng gây phytoplasma 18 1.4.1 Kỹ thuật PCR 18 1.4.2 PCR-RFLP 19 i 1.4.3 Các kỹ thuật khác 19 1.4.4 Hạn chế kĩ thuật 20 1.5 LAMP, nguyên lý ứng dụng 20 1.5.1 Nguyên lý 21 1.5.2 Phát sản phẩm LAMP 24 1.5.2.1 Điện di 24 1.5.2.2 Hydroxy naphthol blue (HNB) 25 1.5.2.3 Calcein 25 1.5.2.4 Phát dựa vào kết tủa 26 1.5.3 1.5.3.1 Ưu điểm 26 1.5.3.2 Nhược điểm 30 1.5.4 1.6 Ưu điểm nhược điểm LAMP 26 Ứng dụng LAMP chẩn đoán bệnh trồng 31 Mục tiêu nghiên cứu 33 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.2 Hóa chất 35 2.1.3 Thiết bị 35 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Xác định nhiễm phytoplasma chổi rồng kỹ thuật PCR lồng 36 2.2.2 Tách dịng đoạn ADN mã hóa cho 16S rRNA vào vector pGEM-T 37 2.2.3 Thiết kế mồi LAMP 38 2.2.4 Xác định điều kiện phản ứng phù hợp cho mồi 39 2.2.5 Các phương pháp kiểm tra kết 39 ii 2.2.6 Xác định độ nhạy mồi 40 2.2.7 Xác định độ đặc hiệu mồi 40 2.2.8 Xác định mẫu bệnh từ đồng ruộng 40 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Tách dịng đoạn ADN mã hóa cho 16S rRNA vào vector pGEM-T 41 3.2 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng LAMP 42 3.3 Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho phản ứng LAMP 42 3.4 Kiểm tra kết phản ứng 43 3.4.1 Thử nghiệm chất thị màu 43 3.4.2 Kiểm tra kết thông qua kết tủa điện di 47 3.5 Độ nhạy phản ứng 50 3.6 Đánh giá khả phản ứng chéo với ADN sắn 54 3.7 Thiết kế mồi đối chứng dương nội chuẩn 55 3.8 Kiểm tra mẫu sắn thu thập từ thực địa 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 Kết luận 66 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Diện tích trồng sắn Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2011 [112] Bảng Sản lượng sắn (x 1000 tấn) trồng Việt Nam từ 1995 – 2011 [112] 10 Bảng Các mồi dùng phản ứng LAMP 22 Bảng So sánh kỹ thuật LAMP PCR [22] 29 Bảng Thành phần phản ứng PCR lồng 36 Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR lồng 37 Bảng Các chu trình nhiệt phản ứng PCR lồng 37 Bảng Thành phần hỗn hợp phản ứng LAMP 39 Bảng Trình tự mồi cho phản ứng LAMP 42 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Cây sắn Hình Diện tích, suất sản lượng sắn giới từ năm 1995 – 2012 [111] Hình Sản lượng sắn (năm 2008) nước giới [111] Hình Cây sắn bị bệnh chổi rồng 12 Hình Hình thái phytoplasma qua kính hiển vi có độ phóng đại 6000 lần [14] 14 Hình Chu trình vịng đời phytoplasma 16 Hình Cấu trúc vị trí bắt cặp mồi phản ứng LAMP [98] 21 Hình Cơ chế phản ứng LAMP [98] 23 Hình Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP gel agarose [58] 24 Hình 10 Cấu trúc phân từ HNB [70] 25 Hình 11 Phát sản phẩm LAMP dựa chất thị huỳnh quang calcein [98] 26 Hình 12 Quy trình nghiên cứu phát triển KIT chẩn đốn phytoplasma gây bệnh chổi rồng sắn dựa kỹ thuật LAMP 36 Hình 13 Sản phẩm PCR lồng ADN tách từ mẫu sắn có triệu chứng bệnh chổi rồng 41 Hình 14 Điện di sản phẩm LAMP nhiệt độ khác 43 Hình 15 Phản ứng LAMP với chất thị màu khác 44 Hình 16 Điện di sản phẩm LAMP với nồng độ HNB khác 45 Hình 17 Sản phẩm LAMP sau tối ưu điều kiện phản ứng 48 Hình 18 Kiểm tra độ nhạy phản ứng LAMP với mồi thứ 51 Hình 19 Điện di kiểm tra độ nhạy PCR với cặp mồi F3/B3 mồi thứ 52 Hình 20 Kiểm tra độ nhạy phản ứng LAMP với mồi thứ 53 Hình 21 Điện di xác định độ nhạy phản ứng PCR với cặp mồi F3/B3 mồi thứ 54 Hình 22 Điện di xác định độ đăc hiệu mồi LAMP 55 Hình 23 Điện di xác định kích thước sản phẩm cặp mồi nội chuẩn 56 Hình 24 Sự thay đổi màu sắc HNB phản ứng LAMP với nhiệt độ khác 57 v Hình 25 Xác định nhiệt độ phù hợp cho phản ứng LAMP với cặp mồi nội chuẩn 58 Hình 26 Sự thay đổi màu HNB phản ứng LAMP với cặp mồi nội chuẩn 59 Hình 27 Điện di xác định độ nhạy phản ứng LAMP với cặp mồi nội chuẩn 59 Hình 28 Vị trí thu mẫu sắn nhiễm bệnh chổi rồng 60 Hình 29 Các sắn bị nhiễm bệnh chổi rồng thu mẫu để phân tích 60 Hình 30 Đánh giá phản ứng LAMP với ADN sắn thu từ đồng ruộng thông qua chất thị màu 61 Hình 30 Điện di sản phẩm phản ứng LAMP PCR lồng mẫu ADN sắn thu từ đồng ruộng 64 vi DANH MỤC THUẬT NGỮ VÀ TỪ VIẾT TẮT Tên ký hiệu, viết tắt LAMP Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Loop-mediated Isothermal Amplification Phản ứng khếch đại đẳng nhiệt F3 Forward outer primer Mồi xi phía ngồi B3 Backward outer primer Mồi ngược phía ngồi FIP Forward inner primer Mồi xi phía BIP Backward inner primer Mồi ngược phía F1c Complementary sequence of F1 Trình tự bổ sung với F1 B1c Complementary sequence of B1 Trình tự bổ sung với B1 HNB Hydroxynaphthol Blue Xanh náp-tôn PCR Polymerase Chain Reaction Chuỗi phản ứng khuếch đại Food and Agriculture Organization of Tổ chức Nông-Lâm Lương the United Nations thực Liên Hợp Quốc Restriction fragment length Đa hình chiều dài đoạn cắt giới polymorphism hạn FAO RFLP cs CFU Cộng Đơn vị hình thành khuẩn lạc Colony-forming unit vii Hình 30 Điện di sản phẩm phản ứng LAMP PCR lồng mẫu ADN sắn thu từ đồng ruộng A: Phản ứng LAMP với cặp mồi đặc hiệu cho gen Actin; B: Phản ứng LAMP với cặp mồi đặc hiệu cho gen 16S phytoplasma; C Phản ứng PCR lồng với ADN khuôn tương ứng với phản ứng LAMP M: ADN thang chuẩn 1000 bp; (-): Mẫu âm tính khơng có ADN; H1, H2: Mẫu bệnh; W1, W2, W3: mẫu nhiễm bệnh chổi rồng 64 Kết tương đồng phản ứng PCR lồng phản ứng LAMP chứng tỏ kết phản ứng LAMP hồn tồn xác.Tuy nhiên, xét mức độ hiệu mặt thời gian yêu cầu kỹ thuật, kỹ thuật LAMP thể ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật PCR lồng Đầu tiên xét hiệu thời gian, dễ dàng nhận thấy khác biệt rõ ràng hai kỹ thuật Trong nghiên cứu này, kỹ thuật PCR lồng yêu cầu lần phản ứng PCR với thời gian tối thiểu 16 thực liên tục (hoặc ngày làm việc) phản ứng LAMP yêu cầu khoảng thực hiện, tức rút ngắn it 16 lần so với thời gian thực phản ứng PCR lồng Tiếp theo, phản ứng PCR lồng đánh giá kết thơng qua điện di LAMP đánh giá dễ dàng sau phản ứng kết thúc Và quan trọng khiến LAMP ưu điểm hẳn so với PCR lồng yêu cầu nhiệt độ cho phản ứng khuếch đại, yêu cầu thiết bị LAMP đơn giản nhiều so với PCR lồng PCR nói chung (như đề cập trên) Chính ưu điểm kỹ thuật, tiện dụng mà đảm bảo đọ xác độ tin cậy cao làm cho LAMP hồn tồn thay PCR lồng việc xác định phytoplasma mẫu sắn thu thập từ đồng ruộng Những kết thu nghiên cứu cho thấy, kit phát phytoplasma gây bệnh chổi rồng sắn phát triển từ kỹ thuật LAMP có độ nhạy cao, độ đặc hiệu độ tin cậy lớn, đáp ứng tốt yêu cầu phát sớm phytoplasma gây bệnh chổi mẫu sắn kiểm nghiệm, đó, đủ khả phục vụ tốt cho công tác chọn lọc tạo nguồn giống bệnh với hiệu cao áp dụng phổ biến, dựa tính tiện dụng kỹ thuật 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Chúng phát triển kít xác định nhanh phytoplasma gây bệnh chổi rồng sắn với thông số sau: + Điều kiện phản ứng 63°C 60 phút + Độ nhạy tối đa khoảng 10-6 nanogram ADN + Có thể xác định dương tính phản ứng thay đổi màu sắc chất thị màu HNB, điện di sản phẩm gel agarose nhuộm ethidium bromide đánh giá kết thông qua xuất kết tủa trắng magie pyrophotphat dung dịch + Phản ứng LAMP xác định chất lượng ADN mẫu sắn phát triển có điều kiện phản ứng với kit xác định bệnh chổi rồng phytoplasma gây Thử nghiệm mẫu bệnh thu từ đồng ruộng cho thấy kit có kết tốt so với phương pháp chuẩn PCR lồng lại rút ngắn thời gian phân tích xuống từ ngày thành 1-2 Kiến nghị Thử nghiệm phản ứng LAMP với chất thị khác nhau, tiến tới tạo kit với nhiều chất thị màu nhằm đơn giản kit phát phytoplasma gây bệnh chổi rồng sắn Tiếp tục phát triển thêm kit nhận dạng phytoplasma gây bệnh chổi rồng loại trồng khác nhau, dựa kết nghiên cứu 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn (2012), “Phát triển kỹ thuật LAMP (loopmediated isothermal amplification) cho việc phát nhanh xác vi khuẩn Escherichia coli O157: H7”, Tạp chí Sinh học 34(3), pp 343-346 Nguyễn Đức Thành, Mai Văn Quân, Ngô Gia Bôn, Nguyễn Hữu Hỷ, Hà Viết Cường, Trịnh Xuân Hoạt (2014), “Đặc điểm sinh học bệnh chổi rồng sắn Đồng Nai năm 2011 -2013”, Tạp chí Khoa học Phát triển 12(3), pp 325-333 Tài liệu tiếng nước Ademiluyi, F.T and H.D Mepba (2013), “Yield and Properties of Ethanol Biofuel Produced from Different Whole Cassava Flours”, ISRN Biotechnology, 2013, pp Aliotta, J.M., J.J Pelletier, J.L Ware, L.S Moran, J.S Benner, and H Kong (1996), “Thermostable Bst DNA polymerase I lacks a 3′ → 5′ proofreading exonuclease activity”, Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 12(5–6), pp 185-195 Allem, A.C (2002), “The origins and taxonomy of cassava”, Cassava: Biology, Production and Utilization, pp 1-16 Álvarez, E., G.A Llano, and J.F Mejía (2013), “Cassava diseases”, in Cassava in the Third Millennium Modern Production, Processing, Use, and Marketing Systems CIAT, Editor, CIAT Publication, Colombia, pp 165-199 Alvarez, E., P.J Manuel, M.J Fernando, B Assunta, T.N Duc, and H.T Xuan (2013), “Detection and identification of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’-related phytoplasmas associated with a witches’ broom disease of cassava in Vietnam”, Phytopathogenic Mollicutes, 3(2), pp 77-81 Ammar, E.-D and S.A Hogenhout (2006), “Mollicutes associated with arthropods and plants”, in Insect Symbiosis, Volume 2, K Bourtzis and T.A Miller, Editors, CRC Press, Taylor and Francis Group, Boca Raton, FL, USA, pp 97-118 67 Bai, X., J Zhang, A Ewing, S.A Miller, A Jancso Radek, D.V Shevchenko, K Tsukerman, T Walunas, A Lapidus, J.W Campbell, and S.A Hogenhout (2006), “Living with Genome Instability: the Adaptation of Phytoplasmas to Diverse Environments of Their Insect and Plant Hosts”, Journal of Bacteriology, 188(10), pp 3682-3696 10 Bastos, C.N and H.C Evans (1985), “A new pathotype of Crinipellis perniciosa (witches' broom disease) on solanaceous hosts”, Plant Pathology, 34(2), pp 306312 11 Bekele, B., J Hodgetts, J Tomlinson, N Boonham, P Nikolić, P Swarbrick, and M Dickinson (2011), “Use of a real-time LAMP isothermal assay for detecting 16SrII and XII phytoplasmas in fruit and weeds of the Ethiopian Rift Valley”, Plant Pathology, 60(2), pp 345-355 12 Bertaccini, A (2007), “Phytoplasmas: diversity, taxonomy, and epidemiology”, Bioscience 12, pp 673-689 13 Bertaccini, A and B Duduk (2009), “Review: Phytoplasma and phytoplasma diseases: a review of recent research”, Phytopathologia Mediterranea, 48(3), pp 355-378 14 Bertaccini, A., B Duduk, S Paltrinieri, and N Contaldo (2014), “Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases: A Severe Threat to Agriculture”, American Journal of Plant Sciences, 5, pp 1763-1788 15 Bhat, A.I., A Siljo, and K.P Deeshma (2013), “Rapid detection of Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper (Piper nigrum) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)”, Journal of Virological Methods, 193(1), pp 190-196 16 Bien, P.V., H Kim, and R.H Howeler (1996), “Cassava cultural practices in Vietnam”, in Benchmark study on Cassava Production, Processing and Marketing in Vietnam, CIAT, Editor, pp 58-97 17 Bruyn, A.D., J Villemot, P Lefeuvre, E Villar, M Hoareau, et al (2012), “East African cassava mosaic-like viruses from Africa to Indian ocean islands: molecular diversity, evolutionary history and geographical dissemination of a bipartite begomovirus”, BMC Evolutionary Biology 12, pp 228 68 18 Ceballos, H (2012), “Cassava in Colombia and the world: new prospects for a millennial crop”, in Cassava in the Third Millennium: Modern Production, Processing, Use, and Marketing Systems, B Ospina and H Ceballos, Editors, CIAT publication, Cali, Colombia, pp 1-11 19 Ceballos, H and G.D.L Cruz (2012), “Cassava Taxonomy and Morphology”, in Cassava in the third Millennium: Modern Production, Processing, Use and Marketing Systems, CIAT, Editor, CIAT, Colombia, pp 15-28 20 Champoux, J.J., W.L Drew, F.C Neidhardt, and J.J Plorde (2004), Sherris medical microbiology An introduction to infectious diseases, ed K.J Ryan and C.G Ray, Mc Graw-Hill USA, 979 p 21 Dai, T.-T., C.-C Lu, J Lu, S Dong, W Ye, Y Wang, and X Zheng (2012), “Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Phytophthora sojae”, FEMS Microbiology Letters, 334(1), pp 27-34 22 Dhama, K., K Karthik, S Chakraborty, R Tiwari, S Kapoor, A Kumar, and P Thomas (2014), “Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP): A New Diagnostic Tool Lights the World of Diagnosis of Animal and Human Pathogens: A Review”, Pakistan Journal of Biological Sciences, 17(2), pp 151166 23 Doi, Y., M Teranaka, K Yora, and H Asuyama (1967), “Mycoplasma- or PLT Group-like Microorganisms Found in the Phloem Elements of Plants Infected with Mulberry Dwarf, Potato Witches' Broom, Aster Yellows, or Paulownia Witches' Broom”, Japanese Journal of Phytopathology, 33(4), pp 259-266 24 Drapała, D and M Kordalewska (2013), “Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) as a diagnostic tool in detection of infectious diseases”, PhD Interdisciplinary Journal 1, pp 19-23 25 Duduk, B and A Bertaccini (2011), “Phytoplasma classification: taxonomy based on 16S ribosomal gene, is it enough”, Phytopathogenic Mollicutes, 1(1), pp 1-13 26 El-Sharkawy, M.A (2004), “Cassava biology and physiology”, Plant Molecular Biology, 56, pp 481–501 27 Evans, H.C (1978), “Witches' broom disease of cocoa Crinipellis perniciosa) in Ecuador”, Annals of Applied Biology, 89(2), pp 185-192 69 28 Fao (2012), “Cassava processing”, in FAO Plant Production and Protection Series No 3, M.R Grace, Editor, FAO, Rome, Italy 29 Fao (2013), Save and Grow: Cassava - A guide to sustainable production intensification, FAO Publisher, Rome, 129 p 30 Fermont, A.M., P.J.A Van Asten, and K.E Giller (2008), “Increasing land pressure in East Africa: The changing role of cassava and consequences for sustainability of farming systems”, Agriculture, Ecosystems & Environment, 128(4), pp 239-250 31 Flôres, D., I.C Haas, M.C Canale, and I.P Bedendo (2013), “Molecular identification of a 16SrIII-B phytoplasma associated with cassava witches’broom disease”, Eur J Plant Pathol, 137, pp 237-242 32 Fu, S., G Qu, S Guo, L Ma, N Zhang, S Zhang, S Gao, and Z Shen (2011), “Applications of Loop-Mediated Isothermal DNA Amplification”, Applied Biochemistry and Biotechnology 163, pp 845-850 33 Fukuta, S., T Iida, Y Mizukami, A Ishida, J Ueda, M Kanbe, and Y Ishimoto (2003), “Detection of Japanese yam mosaic virus by RT-LAMP”, Arch Virol, 148(9), pp 1713-1720 34 Fukuta, S., K Ohishi, K Yoshida, Y Mizukami, A Ishida, and M Kanbe (2004), “Development of immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of tomato spotted wilt virus from chrysanthemum”, Journal of Virological Methods, 121(1), pp 49-55 35 Gibson, N.J., C.R Newton, and S Little (1997), “A Colorimetric Assay for Phosphate to Measure Amplicon Accumulation in Polymerase Chain Reaction”, Analytical Biochemistry, 254(1), pp 18-22 36 Glass, J.I., E.J Lefkowitz, J.S Glass, C.R Heiner, E.Y Chen, and G.H Cassell (2000), “The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum”, Nature, 407(6805), pp 757-762 37 Goto, M., E Honda, A Ogura, A Nomoto, and K.-I Hanaki (2009), “Colorimetric detection of loopmediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue”, BioTechniques, 46(3), pp 167-172 70 38 Goto, M., E Honda, A Ogura, A Nomoto, and D.V.M Ken-Ichi Hanaki (2009), “Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue”, BioTechniques, 46(3), pp 167–172 39 Green, M.J., D.A Thompson, and D.J Mackenzie (1999), “Easy and Efficient DNA Extraction from Woody Plants for the Detection of Phytoplasmas by Polymerase Chain Reaction”, Plant Disease, 83(5), pp 482-485 40 Hadidi, A., H Czosnek, and M Barba (2004), “DNA Microarrays and their potential applications for the detection of plant viruses, viroids, and phytoplasmas”, Journal of Plant Pathology, 86(2), pp 97-104 41 Hall, J., S Matos, L Severino, and N Beltrão (2009), “Brazilian biofuels and social exclusion: established and concentrated ethanol versus emerging and dispersed biodiesel”, Journal of Cleaner Production, 17, (1), pp S77-S85 42 Hodgetts, J., J Tomlinson, N Boonham, I González-Martín, P Nikolić, P Swarbrick, E.N Yankey, and M Dickinson (2011), “Development of rapid infield loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for phytoplasmas”, Bulletin of Insectology 64(Supplement), pp S41-S42 43 Hogenhout, S.A., K Oshima, E.-D Ammar, S Kakizawa, H.N Kingdom, and S Namba (2008), “Phytoplasmas: bacteria that manipulate plants and insects”, Molecular Plant Pathology, 9(4), pp 403-423 44 Hoshi, A., Y Ishii, S Kakizawa, K Oshima, and S Namba (2007), “Host-parasite interaction of phytoplasmas from a molecular biological perspective”, Bulletin of Insectology, 60(2), pp 105-107 45 Irpcm (2004), “‘Candidatus Phytoplasma’, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54(4), pp 1243-1255 46 Ito, A and K Ueno (1970), “Successive chelatometric titration of calcium and magnesium using Hydroxynaphthol Blue (HNB) indicator”, Japan Analyst, 19, pp 393-397 47 James, W.D., T Berger, and D.M Elston (2011), Andrews' Diseases of the Skin: Clinical Dermatology, 11thth edition, Saunders Elsevier 968 p 71 48 Jarvis, A., J Ramirez-Villegas, B Herrera Campo, and C Navarro-Racines (2012), “Is Cassava the Answer to African Climate Change Adaptation?”, Tropical Plant Biol., 5(1), pp 9-29 49 Jędryczka, M., A Burzyńsk, A Brachaczek, W Langwiński, P Song, and J Kaczmarek (2013), “Loop-mediated isothermal amplification as a good tool to study changing Leptosphaeria populations in oilseed rape plants and air samples”, Acta Agrobotanic, 66(4), pp 93-100 50 Jensen, M.A., J.A Webster, and N Straus (1993), “Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms”, Applied and Environmental Microbiology, 59(4), pp 945-952 51 Jung, H.-Y., T Sawayanagi, S Kakizawa, H Nishigawa, W Wei, K Oshima, S.I Miyata, M Ugaki, T Hibi, and S Namba (2003), “‘Candidatus Phytoplasma ziziphi’, a novel phytoplasma taxon associated with jujube witches'-broom disease”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53(4), pp 1037-1041 52 Karanis, P and J Ongerth (2009), “LAMP – a powerful and flexible tool for monitoring microbial pathogens”, Trends in Parasitology, 25(11), pp 498-499 53 Kerr, A and K Gibb (1997), “Bacteria and Phytoplasmas as Plant Parasite”, in Plant Pathogens and Plant Diseases, P Pathogens and P Diseases, Editors, Rockvale Publication, Australia, pp 86-103 54 Kim, H., P.V Bien, R Howeler, J.J Wang, T.N Ngoan, K Kawano, and H Ceballos (2005), The history and recent developments of the cassava sector in Vietnam in Innovative technologies for commercialization: Concise papers of The Second International Symposium on Sweet potato and Cassava 14-17 June 2005, Corus Hotel, Kuala Lumpur, Malaysia: Malaysian Agricultural Research and Development Institute, International Society for Horticultural Science with cooperation of Food Biopolymer Research Group, Universiti Sains Malaysia, pp 26-27 55 Kim, H., N.V Bo, H Long, N.T Hien, H Ceballos, and R R.H (2010), Current situation of cassava in Vietnam In A New Furture for Cassava in Asia: Its Use as 72 Food, Feed and Fuel to Benefit the Poor in 8th Asian Cassava Research Workshop October 20 – 24 Vientiane, Lao PDR, pp 100-112 56 Labarre, P., K.R Hawkins, J Gerlach, J Wilmoth, A Beddoe, J Singleton, D Boyle, and B Weigl (2011), “A Simple, Inexpensive Device for Nucleic Acid Amplification without Electricity—Toward Instrument Free Molecular Diagnostics in Low-Resource Settings”, PLoS ONE 6(5), pp e19738 57 Lancaster, P.A and J.E Brooks (1983), “Cassava leaves as human food”, Econ Bot, 37(3), pp 331-348 58 Le, D.T., O Netsu, T Uehara-Ichiki, T Shimizu, I.-R Choi, T Omura, and T Sasaya (2010), “Molecular detection of nine rice viruses by a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay”, Journal of Virological Methods, 170(1–2), pp 90-93 59 Le, T.H., N.T.B Nguyen, N.H Truong, and N.V De (2012), “Development of Mitochondrial Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of the Small Liver Fluke Opisthorchis viverrini (Opisthorchiidae; Trematoda; Platyhelminthes)”, Journal of Clinical Microbiology, 50(4), pp 1178-1184 60 Lee, I.-M., R.E Davis, and D.E Gundersen-Rindal (2000), “PHYTOPLASMA: Phytopathogenic Mollicutes1”, Annual Review of Microbiology, 54(1), pp 221255 61 Lee, I.-M., D.E Gundersen-Rindal, R.E Davis, and I.M Bartoszyk (1998), “Revised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences”, International Journal of Systematic Bacteriology, 48(4), pp 1153-1169 62 Lee, I.M and R.E Davis (1986), “Prospects for in Vitro Culture of PlantPathogenic Mycoplasmalike Organisms”, Annual Review of Phytopathology, 24(1), pp 339-354 63 Lefol, C., A Caudwell, J Lherminier, and J Larrue (1993), “Attachment of the Flavescence doree pathogen (MLO) to leafhopper vectors and other insects”, Annals of Applied Biology, 123(3), pp 611-622 64 Li, R and K.-S Ling (2014), “Development of reverse transcription loopmediated isothermal amplification assay for rapid detection of an emerging 73 potyvirus: Tomato necrotic stunt virus”, Journal of Virological Methods, 200, pp 35-40 65 Li, W., J.S Hartung, and L Levy (2007), “Evaluation of DNA Amplification Methods for Improved Detection of “Candidatus Liberibacter Species” Associated with Citrus Huanglongbing”, Plant Disease, 91(1), pp 51-58 66 Lim, P.O and B.B Sears (1992), “Evolutionary relationships of a plantpathogenic mycoplasmalike organism and Acholeplasma laidlawii deduced from two ribosomal protein gene sequences”, Journal of Bacteriology, 174(8), pp 26062611 67 Liu, Y., Z Wang, Y Qian, J Mu, L Shen, F Wang, and J Yang (2010), “Rapid detection of tobacco mosaic virus using the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method”, Arch Virol, 155(10), pp 1681-1685 68 Londo, M., S Lensink, A Wakker, G Fischer, S Prieler, et al (2010), “The REFUEL EU road map for biofuels in transport: Application of the project's tools to some short-term policy issues”, Biomass and Bioenergy, 34(2), pp 244-250 69 Maruyama, F., T Kenzaka, N Yamaguchi, K Tani, and M Nasu (2003), “Detection of Bacteria Carrying the stx2 Gene by In Situ Loop-Mediated Isothermal Amplification”, Applied and Environmental Microbiology, 69(8), pp 5023-5028 70 Mcnaught, A.D and A.D Mcnaught (1997), Compendium of chemical terminology, Vol 1669, Blackwell Science Oxford p 71 Meinhardt, L.W., J Rincones, B.A Bailey, M.C Aime, G.W Griffith, D Zhang, and G.a.G Pereira (2008), “Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease of cacao: what's new from this old foe?”, Molecular Plant Pathology, 9(5), pp 577-588 72 Mkandawire, A.B., R.B Mabagala, P Guzmán, P Gepts, and R.L Gilbertson (2004), “Genetic diversity and pathogenic variation of common blight bacteria (Xanthomonas campestris pv phaseoli and X campestris pv phaseoli var fuscans) suggests pathogen coevolution with the common bean”, Phytopathology, 94(6), pp 593-603 74 73 Mondal, K.K and V Shanmugam (2013), “Advancements in the diagnosis of bacterial plant pathogens: An overview”, Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 8(1), pp 1-11 74 Mori, Y., K Nagamine, N Tomita, and T Notomi (2001), “Detection of LoopMediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 289(1), pp 150-154 75 Mori, Y and T Notomi (2009), “Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases”, Journal of Infection and Chemotherapy, 15(2), pp 62-69 76 Mullis, K.B (1987), Process for amplifying nucleic acid sequences 1987, US Patent 4,683,202 77 Nagamine, K., T Hase, and T Notomi (2002), “Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers”, Molecular and Cellular Probes, 16(3), pp 223-229 78 Njiru, Z., A Mikosza, E Matovu, J Enyaru, J Ouma, S Kibona, R Thompson, and J Ndung’u (2008), “African trypanosomiasis: Sensitive and rapid detection of the sub-genus Trypanozoon by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of parasite DNA”, International journal for parasitology, 38(5), pp 589-599 79 Notomi, T., H Okayama, H Masubuchi, T Yonekawa, K Watanabe, N Amino, and T Hase (2000), “Loop-mediated isothermal amplification of DNA”, Nucleic Acids Research, 28(12), pp e63-e63 80 Okogbenin, E., T.L Setter, M Ferguson, R Mutegi, H Ceballos, B Olasanmi, and M Fregene (2013), “Phenotypic Approaches to Drought in Cassava: Review”, Frontiers in Physiology, 4(93), pp 1-15 81 Okuda, M., M Matsumoto, Y Tanaka, S Subandiyah, and T Iwanami (2005), “Characterization of the tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB Gene Cluster of the Citrus Greening Organism and Detection by Loop-Mediated Isothermal Amplification”, Plant Disease, 89(7), pp 705-711 82 Oshima, K., T Shiomi, T Kuboyama, T Sawayanagi, H Nishigawa, S Kakizawa, S.-I Miyata, M Ugaki, and S Namba (2001), “Isolation and Characterization of 75 Derivative Lines of the Onion Yellows Phytoplasma that Do Not Cause Stunting or Phloem Hyperplasia”, Phytopathology, 91(11), pp 1024-1029 83 Parmessur, Y., S Aljanabi, S Saumtally, and A Dookun-Saumtally (2002), “Sugarcane yellow leaf virus and sugarcane yellows phytoplasma: elimination by tissue culture”, Plant Pathology, 51(5), pp 561-566 84 Patel, H., C Tscheka, and H Heerklotz (2009), “Characterizing vesicle leakage by fluorescence lifetime measurements”, Soft Matter, 5(15), pp 2849-2851 85 Peng, J., M Shi, Z Xia, J Huang, and Z Fan (2012), “Detection of cucumber mosaic virus isolates from banana by one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification”, Arch Virol, 157(11), pp 2213-2217 86 Purdy, L.H and R.A Schmidt (1996), “STATUS OF CACAO WITCHES' BROOM: Biology, Epidemiology, and Management”, Annual Review of Phytopathology, 34(1), pp 573-594 87 Ravindran, A., J Levy, E Pierson, and D.C Gross (2012), “Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Procedure as a Sensitive and Rapid Method for Detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in Potatoes and Psyllids”, Phytopathology, 102(9), pp 899-907 88 Razin, S and L Hayflick (2010), “Highlights of mycoplasma research—An historical perspective”, Biologicals, 38(2), pp 183-190 89 Razin, S., D Yogev, and Y Naot (1998), “Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(4), pp 10941156 90 Renvoize, B.S (1972), “The area of origin of Manihot esculenta as a crop plant— a review of the evidence”, Econ Bot, 26(4), pp 352-360 91 Rigano, L., M Marano, A Castagnaro, A Do Amaral, and A Vojnov (2010), “Rapid and sensitive detection of Citrus Bacterial Canker by loop-mediated isothermal amplification combined with simple visual evaluation methods”, BMC Microbiology, 10(1), pp 176 92 Rist, L., J Ser, H Lee, and L.P Koh (2009), “Biofuels: Social benefits”, Science, 326, pp 1344-a 76 93 Saharan, P., P Khatri, S Dingolia, J.S Duhan, and S.K Gahlawat (2013), “Rapid Detection of Viruses Using Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Review”, in Biotechnology: Prospects and Applications, R.K Salar, S.K Gahlawat, P Siwach, and J.S Duhan, Editors, Springer India, pp 287-306 94 Schaad, N., P Gaush, E Postnikova, and R Frederick (2001), “On-site one hour PCR diagnosis of bacterial diseases”, Phytopathology, 91, pp S79-S89 95 Seemüller, E., C Marcone, U Lauer, A Ragozzino, and M Göschl (1998), “Current Status of Molecular Classification of The Phytoplasmas”, Journal of Plant Pathology, 80(1), pp 3-26 96 Shukla, P., G Verma, R Kumar, D Singh, A Kumar, A Saxena, and R Jain (2012), “The reliable and rapid polymerase chain reaction (PCR) diagnosis for Xanthomonas axonopodis pv punicae in pomegranate”, African Journal of Microbiology Research, 6(30), pp 5950-5956 97 Smart, C.D., B Schneider, C.L Blomquist, L.J Guerra, N.A Harrison, U Ahrens, K.H Lorenz, E Seemüller, and B.C Kirkpatrick (1996), “Phytoplasma-Specific PCR Primers Based on Sequences of the 16S-23S rRNA Spacer Region”, Applied and Environmental Microbiology, 62(8), pp 2988-2993 98 Tomita, N., Y Mori, H Kanda, and T Notomi (2008), “Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products”, Nature Protocols, 3(5), pp 877–882 99 Tomlinson, J.A., N Boonham, and M Dickinson (2010), “Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas”, Plant Pathology, 59(3), pp 465-471 100 Torres, E., E Bertolini, M Cambra, C Montón, and M.P Martín (2005), “Realtime PCR for simultaneous and quantitative detection of quarantine phytoplasmas from apple proliferation (16SrX) group”, Molecular and Cellular Probes, 19(5), pp 334-340 101 Tsutsumi, N., H Yanagisawa, Y Fujiwara, and T Ohara (2010), “Detection of Potato Spindle Tuber Viroid by Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification”, Res Bull Pl Prot Japan, 46, pp 61-67 77 102 Ugent, D., S Pozorski, and T Pozorski (1986), “Archaeological manioc (Manihot) from Coastal Peru”, Econ Bot, 40(1), pp 78-102 103 Ushikubo, H (2004), “Principle of LAMP method-a simple and rapid gene amplification method”, Uirusu, 54(1), pp 107-112 104 Wanapat, M (2002), The role of cassava hay as animal feed in 7th Regional Workshop held in Rama Gardens Hotel, Bangkok, Thailand Oct, pp 504-518 105 Wei, Q.-W., C Yu, S.-Y Zhang, C.-Y Yang, K Miriam, W.-N Zhang, D.-L Dou, and X.-R Tao (2012), “One-step detection of Bean pod mottle virus in soybean seeds by the reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification”, Virology Journal, 9(1), pp 187 106 Weintraub, P.G and L Beanland (2006), “Insect Vectors of Phytoplasmas”, Annual Review of Entomology, 51(1), pp 91-111 107 Yeoh, H.H and M.Y Chew (1976), “Protein content and amino acid composition of cassava leaf”, Phytochemistry, 15(11), pp 1597-1599 108 Zhang, Z.-Y., X.-J Liu, D.-W Li, J.-L Yu, and C.-G Han (2011), “Rapid detection of wheat yellow mosaic virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification”, Virology Journal, 8, pp 550 109 Ziska, L.H., G.B Runion, M Tomecek, S.A Prior, H.A Torbet, and R Sicher (2009), “An evaluation of cassava, sweet potato and field corn as potential carbohydrate sources for bioethanol production in Alabama and Maryland”, Biomass and Bioenergy, 33(11), pp 1503-1508 110 Zreik, L., P Carle, J.M Bov, and M Garnier (1995), “Characterization of the mycoplasmalike organism associated with witches'-broom disease of lime and proposition of a Candidatus taxon for the organism,“Candidates phytoplasma aurantifolia””, International Journal of Systematic Bacteriology, 45(3), pp 449453 Tài liệu World Wide Web 111 http://faostat.fao.org/ 112 http://www.gso.gov.vn/ 78