Nghiên cứu sự ức chế phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri nhằm phát hiện độc tính của nước sinh hoạt nhiễm một số kim loại nặng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - KIỀU THỊ HÒA NGHIÊN CỨU SỰ ỨC CHẾ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN Vibrio fischeri NHẰM PHÁT HIỆN ĐỘC TÍNH CỦA NƯỚC SINH HOẠT NHIỄM MỘT SỐ KIM LOẠI NẶNG LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2016 MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG BIỂU ix MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Tổng quan ô nhiễm kim loại nặng nguồn nƣớc sinh hoạt Việt Nam .4 1.1.1 Các khái niệm liên quan 1.1.2 Kim loại nặng ảnh hưởng chúng đến người 1.1.2.1 Cadimi (Cd) 1.1.2.2 Đồng (Cu) 1.1.2.3 Các kim loại khác .7 1.1.3 Hiện trạng ô nhiễm kim loại nặng nguồn nước sinh hoạt Việt Nam .9 1.1.3.1 Ô nhiễm kim loại nặng nƣớc mặt .9 1.1.3.2 Ô nhiễm kim loại nặng nƣớc ngầm 11 1.2 Một số phƣơng pháp phát ô nhiễm kim loại nặng 13 1.2.1 Phương pháp hóa học đánh giá phát ô nhiễm kim loại nặng 13 1.2.1.1 Phƣơng pháp hấp phụ nguyên tử lửa F - AAS 13 1.2.1.2 Phƣơng pháp khối phổ plasma cảm ứng ICP - MS 15 1.2.2 Phương pháp sinh học đánh giá độc tính kim loại nặng nước .17 1.3 Một số đặc tính Vibrio fischeri giúp đánh giá độc tính nƣớc 19 1.3.1 Cấu trúc, hình thái đặc điểm di truyền vi khuẩn Vibrio fischeri 19 ii 1.3.1.1 Cấu trúc, hình thái 19 1.3.1.2 Các đặc điểm di truyền qui định khả phát quang 20 1.3.2 Cơ chế liên quan đến khả phát quang vi khuẩn Vibrio fischeri 21 1.3.2.1 Cơ chế phát quang sinh học .21 1.3.2.2 Cơ chế tác động đến khả phát quang sinh học 22 1.3.3 Môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu Vibrio fischeri 23 1.3.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy .23 1.3.3.2 Các điều kiện nuôi cấy .24 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.2 Hóa chất trang thiết bị .25 2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Máy móc trang thiết bị .26 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu, phân tích đánh giá chất lượng nước cấp sinh hoạt 27 2.3.1.1 Phƣơng pháp lấy mẫu nƣớc 27 2.3.1.2 Phƣơng pháp phân tích đánh giá chất lƣợng nƣớc 27 2.3.2 Phương pháp, kĩ thuật vi sinh 28 2.3.2.1 Kĩ thuật phân lập sàng lọc vi khuẩn 28 2.3.2.2 Các kĩ thuật cấy vi sinh 29 2.3.2.3 Kĩ thuật chụp huỳnh quang nhuộm Gram 29 2.3.2.4 Kĩ thuật sinh học phân tử 29 iii 2.3.2.5 Phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng lỏng 32 2.3.2.6 Phƣơng pháp xác định tốc độ sinh trƣởng .33 2.3.2.7 Phƣơng pháp xác định cƣờng độ phát quang 33 2.3.2.8 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào .33 2.3.2.9 Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn tới cƣờng độ phát quang .34 2.3.3 Phương pháp xác định độc tính kim loại nặng .34 2.3.3.1 Xác định ảnh hƣởng nồng độ kim loại đến cƣờng độ phát quang .34 2.3.3.2 Xác định ảnh hƣởng hỗn hợp kim loại tới cƣờng độ phát quang 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Kết chất lƣợng nƣớc sinh hoạt số đơn vị quân đội 36 3.2 Phân lập xác định đặc điểm sinh học chủng Vibrio fischeri .37 3.2.1 Kết phân lập sàng lọc vi khuẩn từ nước đầm tôm .37 3.2.2 Hình thái, cấu trúc vi khuẩn Vf3 .38 3.2.3 Nhận dạng vi khuẩn đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S 39 3.2.3.1 Tách chiết ADN hệ gen chủng vi khuẩn Vibrio fischeri 39 3.2.3.2 Nhân đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S chủng vi khuẩn Vibrio fischeri PCR 40 3.2.3.3.Giải trình tự gen mã hóa cho ARNr 16S chủng vi khuẩn Vibrio fischeri 41 3.2.4 Nghiên cứu lựa chọn môi trường điều kiện nuôi cấy Vibrio sp Vf3 42 3.2.5 Ảnh hưởng mật độ tế bào tới cường độ phát quang Vibrio sp Vf3 47 iv 3.3 Nghiên cứu ức chế phát quang Vibrio sp Vf3 số kim loại nặng .48 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ Cd2+ tới cường độ phát quang Vibrio sp Vf3 ngưỡng độc tính .49 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ Cu2+tới cường độ phát quang Vibrio sp Vf3 ngưỡng độc tính 51 3.3.3 So sánh độc tính Cd2+, Cu2+ Vibrio sp Vf 52 3.3.3.1 So sánh độc tính Cd2+, Cu2+ Vibrio sp Vf3 thơng qua giá trị EC10 .52 3.3.3.2 So sánh độc tính Cd2+, Cu2+ Vibrio sp Vf3 thông qua giá trị EC50 .52 3.3.3.3 So sánh độc tính Cd2+, Cu2+ Vibrio sp Vf3 thông qua giá trị EC90 .53 3.3.5 Ảnh hưởng hỗn hợp Cu2+ Cd2+ đến cường độ phát quang Vibrio sp Vf3 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Tài liệu Tiếng Việt 57 Tài liệu Tiếng Anh 58 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TCCP Tiêu chuẩn cho phép BTNMT Bộ Tài nguyên Môi trƣờng BYT Bộ Y tế RLU (Relative Light Units) Đơn vị ánh sáng tƣơng đối OD600 (Optical Density 600 nm) Mật độ quang học bƣớc sóng 600 nm WHO (World Health Organization) Tổ chức y tế giới JECFA (Joint Expert Committee of Food Additives) Ủy ban chuyên gia phụ gia thực phẩm IARC (International Agency for Research on Cancer) Tổ chức ung thƣ giới F - AAS (Flame Atomic Absorption Spectrometry) Phƣơng pháp hấp phụ nguyên tử lửa ICP - MS (Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry) Phƣơng pháp khối phổ plasma cảm ứng vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bệnh itai - itai cấu trúc xương .5 Hình 2: Hàm lượng sắt nước giếng khoan, giếng đào nơng thơn 12 Hình 3: Cấu trúc tế bào vi khuẩn Vibrio fischeri 20 Hình 4: Trình tự gen 16S rARN Vibrio fischeri ngân hàng gen 20 Hình 5: Vùng gen qui định khả phát quang Vibrio fischeri 21 Hình 6: Cơ chế điều hòa phát quang sinh học Vibrio fischei .22 Hình 7: Cơ chế tác động đến khả phát quang Vibrio fischeri gây hai độc chất 23 Hình 1: Máy Delta Tox II …………………………………………… ……… 26 Hình 2: Máy ICP - MS ……………………………………………………… 26 Hình 3: Chu trình nhiệt kĩ thuật PCR gen 16S rARN…………… … …31 Hình 1: Phân lập cấy zic zac vi khuẩn môi trường Photobacterium 38 Hình 2: Ảnh chụp huỳnh quang Vf3 39 Hình 3: Ảnh nhuộm Gram Vf3 39 Hình 4: Điện di kiểm tra gel agarose 1% ADN tổng số 40 Hình 5: Điện di kiểm tra gel agarose 1% sản phẩm PCR đoạn gen 16S rARN chủng vi khuẩn nghiên cứu 41 Hình 3.6: So sánh trình tự đoạn gen 16S rARN Vf3 với trình tự đoạn gen 16S rARN Vibrio fischeri 42 Hình 7: Đồ thị tương quan tốc độ sinh trưởng (thể qua giá trị OD600, đơn vị A) cường độ phát quang (thể qua giá trị photon light, đơn vị RLU) Vibrio sp Vf3 Photobacterium MT K 2% 43 vii Hình 8:Vibrio sp Vf3 nuôi lỏng MT K 2% (trái), Photobacterium (phải) sau 23h 45 Hình 9: Mức độ phát quang Vibrio sp Vf3 môi trường Photobacterium MT K 2%, sau 23h 46 Hình 10: Ảnh hưởng mật độ tế bào tới cường độ phát quang Vibrio sp Vf 47 Hình 11: Sự ảnh hưởng Cd2+ đến cường độ phát quang Vibrio sp Vf3 49 Hình 12: Sự ảnh hưởng Cu2+ đến cường độ phát quang Vibrio sp Vf3 51 Hình 13: Ảnh hưởng hỗn hợp kim loại đến cường độ phát quang Vibrio sp Vf3 (nồng độ Cd2+ 2,5 mg/l nồng độ Cu2+ thay đổi từ 0,5 - 60mg/l) 54 Hình 14: So sánh ảnh hưởng hỗn hợp hai kim loại tác động CuSO4 tới khả phát quang Vibrio sp Vf3 55 viii