Nghiên cứu chất lượng đất, nước của khu vực Ramsar Xuân Thuỷ - Nam Định trong bối cảnh nước biển dâng : Luận án TS. Khoa học môi trường và bảo vệ môi trường: 62 44 03 03

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Phạm Kiên Cƣờng NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Phạm Kiên Cƣờng NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trin ̀ h nghiên cƣ́u mà th ực dƣới hƣớng dẫn GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Các số liê ̣u, kế t quả nêu luâ ̣n án là trung thƣ̣c và chƣ a tƣ̀ng đƣơ ̣c công bố bấ t kỳ công trình khác NCS Phạm Kiên Cường LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, PGS.TS Nguyễn Thi ̣ Vân Anh , người thầy tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình làm luận án nghiên cứu sinh Tôi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Cấp ủy thủ trưởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học Công nghệ Quân sự, anh chị bạn bè đồng nghiệp Viện Công nghệ mới, thành viên nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái tổ hợp Phòng Sinh học nano ứng dụng, tḥc Phịng Thí nghi ệm trọng điểm Cơng nghê ̣ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tôi xin gửi lời cảm ơn đ ến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng ch ức Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điề u kiê ̣n cho tơi h ọc tập, hồn thành thủ tục cần thiết nghiên cứu sinh Tôi xin chân thành cám ơn đến TS Đặng Thị Lụa, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I TS Trần Thị Tuyết Hoa, Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp chia sẻ thơng tin q trình thử ng hiê ̣m ứng dụng thực tế sản phẩm đề tài luận án Luận án thực với tài trợ kinh phí đề tài thuộc chương trình Trọng điểm cấp nhà nước Bộ Khoa học Công nghệ tài trợ, mã số KC.04.09/11-15 thân hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tư cách nghiên cứu sinh đề tài Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới bố , mẹ, vợ, con, gia đình, người bên tôi, cổ vũ, động viên và tạo điề u kiê ̣n tḥn lợi cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án NCS Phạm Kiên Cường MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU ̣ VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 11 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM .14 1.1.1 Vị trí phân loại virus gây bệnh đốm trắng tôm .14 1.1.2 Cấu trúc WSSV 16 1.1.3 Hệ gen WSSV 22 1.1.4 Bệnh đốm trắng WSSV gây tôm .28 1.1.5 Chẩn đoán WSSV 32 1.2 NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV 34 1.2.1 Một số biện pháp phòng chống WSSV 34 1.2.2 Protein VP28 nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV 40 1.2.3 Các protein bề mặt khác nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV 46 1.3 BÀO TỬ B subtilis VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE .48 1.3.1 Bào tử B subtilis đặc tính hình thành bào tử .48 1.3.2 Một số protein bề mặt B subtilis 50 1.3.3 Biểu protein ngoại lai bề mặt bào tử 52 2.1 NGUYÊN LIỆU 54 2.1.1 Mẫu tôm thử nghiệm .54 2.1.2 Các hoá chất nguyên vật liệu 54 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ 56 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56 2.3.1 Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh 56 2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B subtilis 56 2.3.3 Tách chiết, định lƣợng DNA 57 2.3.4 Nhân dòng, biểu VP28 E coli B subtilis 60 2.3.5 Phát hiện, định lƣợng tinh VP28 64 2.3.6 Thử nghiệm khả phòng WSSV bào tử B subtilis tái tổ hợp 68 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72 3.1 NHÂN DÕNG, XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƢNG CỦA GEN vp28 TỪ CÁC MẪU WSSV THU NHẬN Ở VIỆT NAM .72 3.1.1 Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằ ng PCR 72 3.1.2 Nhân dòng gen mã hóa VP28 vào vector pGEM-T 74 3.1.3 Xác định trình tự nghiên cứu tính đa hình gen mã hóa VP28 .75 3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 79 3.2.1 Biể u hiê ̣n VP28 hệ thống vector pET28b E coli 79 3.2.2 Biểu VP28 dạng dung hợp với protein CotB bề mặt bào tử B subtilis .84 3.3 KHẢ NĂNG PHÕNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG CỦA BÀO TỬ B subtilis BIỂU HIỆN VP28 TRÊN BỀ MẶT 99 3.3.1 Sự tồn bào tử B subtilis biểu VP28 ruột tôm thẻ chân trắng 99 3.3.2 Khả kích thích miễn dịch tôm thẻ chân trắng bào tử B subtilis biểu VP28 102 3.3.3 Đánh giá khả bảo hộ tôm thẻ chân trắng bào tử tái tổ hợp .105 KẾT LUẬN .114 KIẾN NGHỊ 114 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .115 TÀI LIỆU THAM KHẢO .116 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate BSA Albumin huyết bò (Bovine Serum Albumin) Cm Chloramphenicol dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate DSM Môi trƣờng tạo bào tử Difco (Difco Sporulation medium) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GST Glutathione S-transferase IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa Kilodalton LB Luria Bertani NBT p- nitro blue tetrazolium chloride PAGE Điện di gel polyacrylaminde (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PVDF Polyvinylidere Fluoride SDS Sodium Dodecyl Sulphate GST Glutathione S-transferase TSA Tryptic Soy Agar TTFC Phân đoạn đầu C độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the tetanus toxin) WSSV Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tên gọi virus gây bệnh đốm trắng qua giai đoạn 15 Bảng 1.2: Các gen mã hóa protein cấu trúc WSSV 26 Bảng 1.3: Một số giáp xác nhiễm bệnh đốm trắng 30 Bảng 1.4: Các chiến lƣợc vaccine chống WSSV để bảo vệ tôm 46 Bảng 1.5: Một số protein lớp áo bào tử vi khuẩn B subtilis 51 Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sƣ̉ du ̣ng nghiên cƣ́u nhân bản và biể u hiê ̣n gen vp28 55 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR .59 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng Real-time PCR 60 Bảng 2.4: Thành phần gel cô gel tách acrylamide SDS-PAGE 66 Bảng 1: Các mẫu tôm nhiễm WSSV thu nhận từ các địa điểm khác 72 Bảng 3.2: Một số sai khác trình tự nucleotide acid amin VP28 thu nhận Việt Nam so với trình tự công bố (AY168644) 78 Bảng 3.3: Sự hình thành sinh khối bào tử B subtilis tái tổ hợp số môi trƣờng khác .95 Bảng 3.4: Sự hình thành bào tử tái tổ hợp môi trƣờng DSM các thời gian khác 96 Bảng 3.5: Độ sống vi khuẩn mẫu thức ăn trộn bào tử B subtilis biểu VP28 100 Bảng 3.6: Số copy dung dịch WSSV 107 DANH MỤC HÌ NH Hình 1.1: Vị trí WSSV phát sinh chủng loại [124] 16 Hình 1.2: Cấu trúc virion WSSV dƣới kính hiển vi điện tử [54] .17 Hình 1.3: Hình ảnh mô ruột tôm (Procambarus clarkii) sau 48 lây nhiễm WSSV dƣới kính hiển vi điện tử .17 Hình 1.4: Vị trí các protein cấu trúc WSSV [97] .18 Hình 1.5: Cấu trúc liên kết màng VP19, VP24, VP26, VP28 VP51A [21] 19 Hình 1.6: Mô hình 3D phức hợp protein vỏ xuyên màng [21] 19 Hình 1.7: Mô hình tổ chức hệ gen DNA vịng sợi đơi WSSV-CN .23 Hình 1.8: Bản gel SDS-PAGE 12% nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB) protein vỏ WSSV (EP) protein lõi nucleocapsid (NP) [120] .25 Hình 1.9: Tôm sú bị bệnh đốm trắng, dƣới vỏ đầu ngực thấy rõ các đốm trắng [6].28 Hình 1.10: Sơ đồ hệ thống miễn dịch ở tôm [98] .35 Hình 1.11: Cơ chế kích thích miễn dịch khơng đặc hiệu tơm bị kích thích β-glucan [3] 36 Hình 1.12: Cấu trúc không gian protein VP28 [97] 42 Hình 1.13: Hình dạng nội bào tử B subtilis [27] .48 Hình 1.14: Cấu tạo nội bào tử B subtilis [27] .49 Hình 1.15: Mô hiǹ h bi ểu protein ngoa ̣i b ề mặt bào tử B subtilis sử dụng protein lớp áo bào tử Protein dung hợp gồm phần màu xanh dƣơng protein chuyên chở phần màu hồng protein ngoại lai [74] 52 Hình 3.1: Nhân vp28 PCR từ các mẫu tôm nhiễm WSSV các địa điểm 73 Hình 3.2: Điện di gel agarose sản phẩm PCR kiểm tra có mặt vp28 các thể biến nạp sử dụng cặp mồi pGEM Fw/Rv cặp mồi VP28.1 Fw/Rv 74 Hình 3.3: So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide gen vp28 từ các mẫu WSSV thu thâ ̣p đƣơ ̣c và trình tƣ̣ vp28 Việt Nam đã công bố trƣớc (AY168644) 77 Hình 3.4: Điện di gel agarose sản phẩm cắt vector biểu vector nhân dòng mang gen vp28 enzyme giới hạn sau tinh 80 Hình 3.5: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen vp28 các khuẩn lạc 80 Hình 3.6: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu VP28 E coli .81 Hình 3.7: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra độ tinh VP28 83 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt giới hạn pDG364-cotB-gst-sep, pDG364-cotB, pGEM-vp28 với hai cặp enzyme EcoRI HindIII 86 Hình 3.9A: Điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c t đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn gen mã hóa VP28 pDG364-cotB bằ ng că ̣p mờ i vp 28, cotB pDG364 .87 Hình 3.9B: Điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c t đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn gen mã hóa VP28 pDG364-cotB-GST bằ ng că ̣p mồ i pDG 364 vp28 88 Hình 3.10: Kiểm tra có mặt gen dung hợp DNA hệ gen B subtilis .89 Hình 3.11: Kiểm tra có mặt gen cotB-vp28 hệ gen B subtilis 90 Hình 3.12: Bào tử quan sát dƣới kính hiển vi 91 Hình 3.13: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu VP28 bào tử B subtilis .92 Hình 3.14: Ảnh chụp phân tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu CotB-VP28 CotB-GST-VP28 bề mặt bào tử B subtilis 94 Hình 3.15: Mức độ bền nhiệt bào tử tái tổ hợp 96 Hình 3.16: Mức độ bền với muối bào tử tái tổ hợp 97 Hình 3.17: Mức độ bền với pH bào tử tái tổ hợp .98 Hình 3.18: Thức ăn tôm thẻ chân trắng sau trộn bào tử B subtilis dạng dại PY79 dạng tái tổ hợp cotB-VP28 hay cotB-GST-VP28 99 recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis", Fish and Shellfish Immunology 25, pp 315-320 17 Campadelli-Fiume G., Amasio M., Avitabile E., Cerretani A., Forghieri C., Gianni T., Menotti L (2007), "The multipartite system that mediates entry of herpes simplex virus into the cell", Reviews in Medical Virology 17, pp 313326 18 Cerenius L., Lee B L., Soderhall K (2008), "The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity", Trends in Immunology 29, pp 263-271 19 Cerenius L., Soderhall K (2004), "The prophenoloxidase-activating system in invertebrates", Immunological Reviews 198, pp 116-126 20 Chang C F., Su M S., Chen H Y., Lo C F., Kou G H., Liao I C (1999), "Effect of dietary b-1,3-glucan on resistance to white spot syndrome virus (WSSV) in postlarval and juvenile Penaeus monodon", Diseases of Aquatic Organisms 36, pp 163–168 21 Chang Y S., Liu W J., Lee C C., Chou T L., Lee Y T., Wu T S., Huang J Y., Huang W T., Lee T L., Kou G H., Wang A H., Lo C F (2010), "A 3D model of the membrane protein complex formed by the white spot syndrome virus structural proteins", PloS One 5, pp 10718-10728 22 Chazal N., Gerlier D (2003), "Virus entry, assembly, budding, and membrane rafts", Microbiology and Molecular Miology Reviews 67, pp 226-237 23 Chen L L., Leu J H., Huang C J., Chou C M., Chen S M., Wang C H., Lo C F., Kou G H (2002), "Identification of a nucleocapsid protein (VP35) gene of shrimp white spot syndrome virus and characterization of the motif important for targeting VP35 to the nuclei of transfected insect cells", Virology 293, pp 44-53 24 Citarasu T., Sivaram V., Immanuel G., Rout N., Murugan V (2006), "Influence of selected Indian immunostimulant herbs against white spot syndrome virus (WSSV) infection in black tiger shrimp, Penaeus monodon with reference to 118 haematological, biochemical and immunological changes", Fish and Shellfish Immunology 21, pp 372-384 25 Do T T H., Jasmani S., Jayasankar V., Wilder M (2010), "Na/K-ATPase activity and osmo-ionic regulation in adult whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei exposed to low salinities", Aquaculture 304, pp 88-94 26 Do T T H., Wang T., Bayley M., Phuong T N (2010), "Osmoregulation, growth and moulting cycles of the giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) at different salinities", Aquaculture 41, pp 135-143 27 Driks A (1999), "Bacillus subtilis spore coat", Microbiology and Molecular Biology Reviews 63, pp 1-20 28 Duc L H., Cutting S M (2003), "Bacterial spores as heat stable vaccine vehicles", Expert Opinion on Biological Therapy 3, pp 1263-1270 29 Durand D., Lightner D V., Nunan L M., Redman R M., Mari J., Bonami J R (1996), "Application of gene probes as diagnostic tools for White Spot Baculovirus (WSBV) of Penaeid shrimp", Diseases of Aquatic Organisms 27, pp 59–66 30 Durand S., Lightner D V., Redman R M., J.R J R B (1997), "Ultrastructure and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV)", Diseases of Aquatic Organisms 29, pp 205–211 31 Escobedo-Bonilla C M., Vega-Pa S., Mejía-Ruiz C H (2015), "Efficacy of double-stranded RNA against white spot syndrome virus (WSSV) nonstructural (orf89, wsv191) and structural (vp28, vp26) genes in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei ", Journal of King Saud University - Science 27, pp 182–188 32 Flegel T W (1997), "Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand", World Journal of Microbiology and Biotechnology 13, pp 433–442 34 Fu L L., Shuai J B., Xu Z R., Li J R., Li W F (2010), "Immune responses of Fenneropenaeus chinensis against white spot syndrome virus after oral delivery 119 of VP28 using Bacillus subtilis as vehicles", Fish and Shellfish immunology 28, pp 49-55 35 Hao N V., Te B Q., Loan L T P., Yen L T P., Thanh L M (1997), "Pathogens in cultured shrimp in Southern Vietnam In: Flegel TW and MacRae IH Diseases in Asian aquaculture III", Fish health section, Asian Fisheries Society Manila, pp 233–239 36 Harwood C R., Cutting S M (1990), "Molecular Biological Methods for Bacillus", Chichester, England., John Wiley & Sons Ltd Chichester United Kingdom, pp 27–74 37 Hoffmann J A., Reichhart J M (2002), "Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective", Nature Immunology 3, pp 121-126 38 Hou C L., Cao Y., Xie R H., Wang Y Z., Du H H (2011), "Characterization and diagnostic use of a monoclonal antibody for VP28 envelope protein of white spot syndrome virus", Virologica Sinica 26, pp 260-266 39 Huang C., Zhang X., Lin Q., Xu X., Hu Z., Hew C L (2002), "Proteomic analysis of shrimp white spot syndrome viral proteins and characterization of a novel envelope protein VP466", Molecular and Cellular Proteomics 1, pp 223231 40 Huang J., Song X L., Yu J., Yang C H (1995), "Baculoviral hypodermal and hematopoietic necrosis - study on the pathogen and pathology of the explosive epidemic disease of shrimp", Marine Fish Research 16, pp 1–10 41 Inouye K., Yamano K., Ikeda N., Kimura T., Nakano H., Momoyama K., Kobayashi J., Miyajima S (1996), "The penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV), which causes penaeid acute viremia (PAV)", Fish Pathology 31, pp 39-45 42 Isticato R., Cangiano G., Tran H T., Ciabattini A., Medaglin D., Oggioni M R., Felice M D., Pozzi G (2001), "Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores", Journal of Bacteriology 183, pp 294–301 120 43 Jariyapong P., Weerachatyanukul W., Direkbusarakom S., Hirono I., Wuthisuthimethavee S., Chotwiwatthanakun C (2015), "Enhancement of shrimp immunity against white spot syndrome virus by Macrobrachium rosenbergii nodavirus-like particle encapsulated VP28 double-stranded RNA", Aquaculture 446, pp.325–332 44 Jha R K., Xu Z R (2005), "Production of recombinant enveloped structural proteins from the Chinese WSSV isolate", Indian Journal of Clinical Biochemistry 20, pp 136-141 45 Jha R K., Xu Z R., Bai S J., Sun J Y., Li W F., Shen J (2007), "Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris", Fish and Shellfish Immunology 22, pp 295-307 46 Jiang Y S., Zhan W B., Wang S B., Xing J (2006), "Development of primary shrimp hemocyte cultures of Penaeus chinensis to study white spot syndrome virus (WSSV) infection", Aquaculture 253, pp 114–119 47 Jiravanichpaisal P., Soderhall K., Soderhall I (2004), "Effect of water temperature on the immune response and infectivity pattern of white spot syndrome virus (WSSV) in freshwater crayfish", Fish and Shellfish Immunology 17, pp 265-275 48 Jiravanichpaisal P., Soderhall K., Soderhall I (2006), "Characterization of white spot syndrome virus replication in in vitro-cultured haematopoietic stem cells of freshwater crayfish, Pacifastacus leniusculus", Journal of General Virology 87, pp.847–854 49 Kono T., Biswas G., Fall J., Mekata T., Hikima J., Itami T., Sakai M (2015), "Adjuvant effects of poly I:C and imiquimod on the immunization of kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) with a recombinant protein, VP28 against white spot syndrome virus", Aquaculture 446, pp 236–241 50 Kim C S., Kosuke Z., Nam Y K., Kim S K., Kim K H (2007), "Protection of shrimp (Penaeus chinensis) against white spot syndrome virus (WSSV) 121 challenge by double-stranded RNA", Fish and Shellfish Immunology 23, pp 242-246 51 Lan Y., Lu W., Xu X (2002), "Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence", Virus Research 90, pp 269-274 52 Lee S Y., Soderhall K (2002), "Early events in crustacean innate immunity", Fish and Shellfish Immunology 12, pp 421-437 53 Laemmli (1970) "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4" Nature 227: 680 - 685 54 Leu J H., Tsai J M., Wang H C., Wang A H., Wang C H., Kou G H., Lo C F (2005), "The unique stacked rings in the nucleocapsid of the white spot syndrome virus virion are formed by the major structural protein VP664, the largest viral structural protein ever found", Journal of Virology 79, pp 140-149 55 Leu J H., Yang F., Zhang X., Xu X., Kou G H., Lo C F (2009), "Whispovirus", Current Topics in Microbiology and Immunology 328, pp 197227 56 Li L., Cutting M S (2008), "Bacillus subtilis spore vaccines: use of glutathione S-transferase", The Conference Clostridium perfringens, 1st – 4th December 2008, in Torquay, Devon, UK, pp.31 57 Li Q., Chen Y., Yang F (2004), "Identification of a collagen-like protein gene from white spot syndrome virus", Archives of Virology 149, pp 215-223 58 Li X., Liu Q H., Huang J (2010), "Effect of VP28 DNA vaccine on white spot syndrome virus in Litopenaeus vannamei", Aquaculture International 18, pp 1035–1044 59 Li Z., Lin Q., Chen J., Wu J L., Lim T K., Loh S S., Tang X., Hew C L (2007), "Shotgun identification of the structural proteome of shrimp white spot syndrome virus and iTRAQ differentiation of envelope and nucleocapsid subproteomes", Molecular and Cellular Proteomics 6, pp 1609-1620 122 60 Lightner D V (1999), "The penaeid shrimp viruses TSV, IHHNV, WSSV, and YHV: current status in the Americas, available diagnostic methods and management strategies", Journal of Applied Aquaculture 9, pp 27–52 61 Lin S T., Chang Y S., Wang H C., Tzeng H F., Chang Z F., Lin J Y., Wang C H., Lo C F., Kou G H (2002), "Ribonucleotide reductase of shrimp white spot syndrome virus (WSSV): expression and enzymatic activity in a baculovirus/insect cell system and WSSV-infected shrimp", Virology 304, pp 282-290 62 Liu W J., Chang Y S., Wang A H., Kou G H., Lo C F (2007), "White spot syndrome virus annexes a shrimp STAT to enhance expression of the immediate-early gene ie1", Journal of Virology 81, pp 1461-1471 63 Lo C F., Ho C H., Peng S E., Chen C H., Hsu H C., Chiu Y L., Chang C F., Liu K F., Su M S., Wang C H., Kou G H (1996), "White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods", Diseases of Aquatic Organisms 27, pp 215-225 64 Lo C F., Kou G H (1998), "Virus-associated white spot syndrome of shrimp in Taiwan: A review", Fish Pathology 33, pp 365-371 65 Lu Y., Tapay L M., Gose R B., Brock J A., Loh P C (1997), "Infectivity of Yellow Head Virus (YHV) and the Chinese baculo-like virus (CBV) in two species of penaeid shrimp Penaeus stylirostris (Stimpson) and Penaeus vannamei (Boone) In: Diseases in Asian Aquaculture III, Flegel TW and MacRae IH, (Eds)", Asian Fisheries Society, Manila, the Philippines, pp 297– 304 66 Luna-Acosta A., Thomas-Guyon H., Amari M., Rosenfeld E., Bustamante P., Fruitier-Arnaudin I (2011), "Differential tissue distribution and specificity of phenoloxidases from the Pacific oyster Crassostrea gigas", Comparative Biochemistry and Physiology Part B, Biochemistry and Molecular Biology 159, pp 220-226 123 67 Marks H., Goldbach R W., Vlak J M., Van Hulten M C (2004), "Genetic variation among isolates of White spot syndrome virus", Archives of Virology 149, pp 673-697 68 McCord J.M., Fridovich I (1969), "Superoxidase dismutase, an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein)", Journal of Biological Chemistry 244, pp 6049 –6055 69 Mejia-Ruiz C H., Vega-Pena S., Alvarez-Ruiz P., Escobedo-Bonilla C M (2011), "Double-stranded RNA against white spot syndrome virus (WSSV) vp28 or vp26 reduced susceptibility of Litopenaeus vannamei to WSSV, and survivors exhibited decreased susceptibility in subsequent re-infections", Journal of Invertebrate Pathology 107, pp 65-68 70 Mu Y., Lan J F., Zhang X W., Wang X W., Zhao X F., Wang J X (2012), "A vector that expresses VP28 of WSSV can protect red swamp crayfish from white spot disease", Developmental and Comparative Immunology 36, pp 442449 71 Nakano H., Koube H., Umezawa S., Momoyama K., Hiraoka M., Inouye K., Oseko S (1994), "Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Penaeus japonicus, in Japan in 1993: epizootiological survey and infection trials", Fish Pathology 29, pp 135–139 72 Namikoshi A., Wu J L., Yamashita T., Nishizawa T., Nishioka T., Arimoto M., Muroga K (2004), "Vaccination trials with Penaeus japonicus to induce resistance to white spot syndrome virus", Aquaculture 229, pp 25–35 73 Nguyen V A., Huynh H A., Hoang T V., Ninh N T., Pham A T., Nguyen H A., Phan T N., Cutting S M (2013), "Killed Bacillus subtilis spores expressing streptavidin: a novel carrier of drugs to target cancer cells", Journal of Drug Targeting 21, pp 528-541 74 Ning D., Leng X., Li Q., Xu W (2011), "Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome 124 virus in crayfish by oral administration", Journal of Applied Microbiology 111, pp 1327-1336 75 Ning J F., Zhu W., Xu J P., Zheng C Y., Meng X L (2009), "Oral delivery of DNA vaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by attenuated Salmonella typhimurium", Vaccine 27, pp 1127-1135 76 Perazzolo L M., Barracco M A (1997), "The prophenoloxidase activating system of the shrimp Penaeus paulensis and associated factors", Developmental and Comparative Immunology 21, pp 385-395 77 Rahman M N., Corteel M., Wille M., Aldaysanz V., Pensaert M B., Sorgeloos P., Nauwynck H J (2007), "The effect of raising water temperature to 33oC in Penaeus vannamei juveniles at different stages of infection with white spot syndrome virus (WSSV)", Aquaculture 272, pp 240–245 78 Rajeshkumar S., Venkatesan C., Sarathi M., Sarathbabu V., Thomas J., Anver Basha K., Sahul Hameed A S (2009), "Oral delivery of DNA construct using chitosan nanoparticles to protect the shrimp from white spot syndrome virus (WSSV)", Fish and Shellfish Immunology 26, pp 429-437 79 Rameshthangam P., Ramasamy P (2007), "Antiviral activity of bis(2methylheptyl)phthalate isolated from Pongamia pinnata leaves against White Spot Syndrome Virus of Penaeus monodon Fabricius", Virus Research 126, pp 38-44 80 Reske A., Pollara G., Krummenacher C., Chain B M., Katz D R (2007), "Understanding HSV-1 entry glycoproteins", Reviews in Medical Virology 17, pp 205-215 81 Robalino J., Browdy C L., Prior S., Metz A., Parnell P., Gross P., Warr G (2004), "Induction of antiviral immunity by double-stranded RNA in a marine invertebrate", Journal of Virology 78, pp 10442-10448 82 Robalino J., Payne C., Parnell P., Shepard E., Grimes A C., Metz A., Prior S., Witteveldt J., Vlak J M., Gross P S., Warr G., Browdy C L (2006), "Inactivation of White Spot Syndrome Virus (WSSV) by normal rabbit serum: 125 implications for the role of the envelope protein VP28 in WSSV infection of shrimp", Virus Research 118, pp 55-61 83 Rout N., Kumar S., Jaganmohan S., Murugan V (2007), "DNA vaccines encoding viral envelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp", Vaccine 25, pp 2778-2786 84 Sarathi M., Simon M C., Ahmed V P., Kumar S R., Hameed A S (2008), "Silencing VP28 gene of white spot syndrome virus of shrimp by bacterially expressed dsRNA", Marine Biotechnology (NY) 10, pp 198-206 85 Sathish S., Musthaq S., Hameed A S S., Narayanan R B (2004), "Production of recombinant structure protein from the Indian WSSV", Aquaculture 242, pp 69-80 86 Sharma S R., Shankar K M., Sathyanarayana M L., Sahoo A K., Patil R., Narayanaswamy H D., Rao S (2010), "Evaluation of immune response and resistance to diseases in tiger shrimp, Penaeus monodon fed with biofilm of Vibrio alginolyticus", Fish and Shellfish Immunology 29, pp 724-732 87 Sithigorngul P., Chauychuwong P., Sithigorngul W., Longyant S., Chaivisuthangkura P., Menasveta P (2000), "Development of a monoclonal antibody specific to yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon", Diseases of Aquatic Organisms 42, pp 27-34 88 Söderhäll K (1999), "Invertebrate immunity", Developmental and Comparative Immunology 23, pp 263–266 89 Sritunyalucksana K., Söderhäll K (2000), "The proPO and clotting system in crustaceans", Aquaculture 191, pp 53–69 90 Sritunyalucksana K., Wannapapho W., Lo C F., Flegel T W (2006), "PmRab7 is a VP28-binding protein involved in white spot syndrome virus infection in shrimp", Journal of Virology 80, pp 10734-10742 91 Syed M S., Kwang J (2011), "Oral vaccination of baculovirus-expressed VP28 displays enhanced protection against White Spot Syndrome Virus in Penaeus monodon", PloS One 6, p e26428 126 92 Syed M.S, Kwang J (2015), "Reprint of “Evolution of specific immunity in shrimp – A vaccination perspective against white spot syndrome virus”", Developmental & Comparative Immunology 48, pp.342–353 93 Syedmusthaq S., Yoganandhan K., Sudhakaran R., Hameed A S S (2006), "Neutralization of white spot syndrome virus of shrimp by antiserum raised against recombinant VP28", Aquaculture 253, pp 98–104 94 Takahashi Y., Fukuda K., Kondo M., Chongthaleong A., Nishi K., Nishimura M., Ogata K., Shinya I., Takise K., Fujishima Y., Matsumaura M (2003), "Detection and prevention of WSSV infection in cultured shrimp", Asian Aquaculture Magazine November/December 2003, pp 25–27 95 Takahashi Y., Itami T., Kondo M., Maeda M., Fujii R., Tomonaga S., Supamattaya K., Boonyaratpalin S (1994), "Electron microscopic evidence of bacilliform virus infection in Kuruma shrimp (Penaeus japonicus)", Fish Pathology 29, pp 121–125 96 Takahashi Y., Kondo M., Itami T., Honda T., Inagawa H., Nishizawa T., Soma G I., Yokomizo Y (2000), "Enhancement of disease resistance against penaeid acute viraemia and induction of virus-inactivating activity in haemolymph of kuruma shrimp, Penaeus japonicus, by oral administration of Pantoea agglomerans lipopolysaccharide (LPS)", Fish and Shellfish Immunology 10, pp 555-558 97 Tang X., Wu J., Sivaraman J., Hew C L (2007), "Crystal structures of major envelope proteins VP26 and VP28 from white spot syndrome virus shed light on their evolutionary relationship", Journal of Virology 81, pp 6709-6717 98 Tassanakajon A., Somboonwiwat K., Supungul P., Tang S (2013), "Discovery of immune molecules and their crucial functions in shrimp immunity", Fish and Shellfish Immunology 34, pp 954-967 99 Thomas A., Sudheer N S., Viswanathan K., Kiron V., Singh I S B., Narayanan R B (2014), "Immunogenicity and protective efficacy of a major White Spot Syndrome Virus (WSSV) envelope protein VP24 expressed in 127 Escherichia coli against WSSV", Journal of Invertebrate Pathology 123, pp 17–24 100 Tran T T H., Phuong T N., Vlak J (2008), "High variation of tandem repeat sequences in ORF94 among WSSV outbreak strains in the Mekong Delta, Vietnam", Handbook & Abstracts of the 7th Symposium on Diseases in Asian Aquaculture, Taipei, Taiwan, pp 222 - 222 101 Tsai J M., Wang H C., Leu J H., Hsiao H H., Wang A H., Kou G H., Lo C F (2004), "Genomic and proteomic analysis of thirty-nine structural proteins of shrimp white spot syndrome virus", Journal of Virology 78, pp 11360-11370 102 Tseng D Y., Ho P L., Huang S Y., Cheng S C., Shiu Y L., Chiu C S., Liu C H (2009), "Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20", Fish and Shellfish Immunology 26, pp 339-344 103 Van Hulten M C., Goldbach R W., Vlak J M (2000), "Three functionally diverged major structural proteins of white spot syndrome virus evolved by gene duplication", The Journal of General Virology 81, pp 2525-2529 104 Van Hulten M C., Tsai M F., Schipper C A., Lo C F., Kou G H., Vlak J M (2000), "Analysis of a genomic segment of white spot syndrome virus of shrimp containing ribonucleotide reductase genes and repeat regions", The Journal of General Virology 81, pp 307-316 105 Van Hulten M C., Tsawestenberg M., Goodall S D., Vlak J M (2000), "Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus of shrimp", Virology 266, pp 227-236 106 Van Hulten M C., Vlak J M (2001), "Identification and phylogeny of a protein kinase gene of white spot syndrome virus", Virus Genes 22, pp 201207 107 Van Hulten M C., Witteveldt J., Peters S., Kloosterboer N., Tarchini R., Fiers M., Sandbrink H., Lankhorst R K., Vlak J M (2001), "The white spot syndrome virus DNA genome sequence", Virology 286, pp 7-22 128 108 Van Hulten M C., Witteveldt J., Snippe M., Vlak J M (2001), "White spot syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp", Virology 285, pp 228-233 109 Vaseeharan B., Prem Anand T., Murugan T., Chen J C (2006), "Shrimp vaccination trials with the VP292 protein of white spot syndrome virus", Letters in Applied Microbiology 43, pp 137-142 110 Venegas C A., Nonaka L., Mushiake K., Nishizawa T., Murog K (2000), "Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV)", Diseases of Aquatic Organisms 42, pp 83-89 111 Wang C S., Tang K F J., Kou G H., Chen S N (1996), "Yellow head disease-like virus infection in the kuruma shrimp Penaeus japonicus cultured in Taiwan", Fish Pathology 31, pp 177-182 112 Wang Q., White B L., Redman R M., Lightner D V (1999), "Per os challenge of Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles with six geographic isolates of white spot syndrome virus", Aquaculture 170, pp 179–194 113 Wang Y., Zhang X., Yuan L., Xu T., Rao Y., Li J., Dai H (2008), "Generation of recombinant monoclonal antibodies to study structure-function of envelope protein VP28 of white spot syndrome virus from shrimp", Biochemical and Biophysical Research Communications 372, pp 902-906 114 Witteveldt J., Vlak J M., Van Hulten M C (2004), "Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine", Fish and Shellfish Immunology 16, pp 571-579 115 Wongprasert K., Khanobdee K., Glunukarn S S., Meeratana P., Withyachumnarnkul B (2003), "Time-course and levels of apoptosis in various tissues of black tiger shrimp Penaeus monodon infected with white-spot syndrome virus", Diseases of Aquatic Organisms 55, pp 3-10 116 Wongteerasupaya C., Vickers J E., Sriurairatana S., Nash G L., Alarajamorn A., Boonsaeng V (1995), "A non-occluded, systemic baculovirus that occurs in 129 cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon", Diseases of Aquatic Organisms 21, pp 69–77 117 Wongteerasupaya C., Wongwisansri S., Boonsaeng V., Panyim S., Pratanpipat P., Nash G L (1996), "DNA fragment of Penaeus monodon baculovi-rus PmNOBII gives positive in situ hybridization with white spot viral infections in six Penaeid shrimp species", Aquaculture 143, pp 23–32 118 Wu C., Yang F (2006), "Localization studies of two white spot syndrome virus structural proteins VP51 and VP76", Virology Journal 3, pp 76-83 119 Wu J L., Nishioka T., Mori K., Nishizawa T., Muroga K (2002), "A timecourse study on the resistance of Penaeus japonicus induced by artificial infection with white spot syndrome virus", Fish and Shellfish Immunology 13, pp 391-403 120 Xie X., Xu L., Yang F (2006), "Proteomic analysis of the major envelope and nucleocapsid proteins of white spot syndrome virus", Journal of Virology 80, pp 10615-10623 121 Xie X., Yang F (2005), "Interaction of white spot syndrome virus VP26 protein with actin", Virology 336, pp 93-99 122 Xu H., Yan F., Deng X., Wang J., Zou T., Ma X., Zhang X., Qi Y (2009), "The interaction of white spot syndrome virus envelope protein VP28 with shrimp Hsc70 is specific and ATP-dependent", Fish and Shellfish Immunology 26, pp 414-421 123 Yang F., He J., Lin X., Li Q., Pan D., Zhang X., Xu X (2001), "Complete genome sequence of the shrimp White spot syndrome baciliform virus", Journal of Virology 75, pp 11811-11820 124 Yi G., Wang Z., Qi Y., Yao L., Qian J., Hu L (2004), "Vp28 of shrimp white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells", Journal of Biochemistry and Molecular Biology 37, pp 726-734 130 125 Zhang X., Huang C., Tang X., Zhuang Y., Hew C L (2004), "Identification of structural proteins from shrimp white spot syndrome virus (WSSV) by 2DEMS", Proteins 55, pp 229-235 126 Zhang X., Huang C., Xu X., Hew C L (2002), "Transcription and identification of an envelope protein gene (p22) from shrimp white spot syndrome virus", The Journal of General Virology 83, pp 471-477 127 Zhang X., Xu X., Hew C L (2001), "The structure and function of a gene encoding a basic peptide from prawn white spot syndrome virus", Virus Research 79, pp 137-144 128 Zhu Y., Ding Q., Yang F (2007), "Characterization of a homologous-regionbinding protein from white spot syndrome virus by phage display", Virus Research 125, pp 145-152 129 Wei K Q., Xu Z R (2005), "Effect of white spot syndrome virus envelope protein Vp28 expressed in silkworm (Bombyx mori) pupae on disease resistence in Procambarus clarkii", Shi Yan Sheng Wu Xue Bao 38, pp 190-198 130 OIE (2003) "Manual of diagnostic tests for aquatic animals" 4th edtition World Organization for Animal Health, Paris 358pp 131 Wang C H., Lo C F., Leu J H., Chou C M., Yeh P Y., Chou H Y (1995), "Purification and genomic analysis of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) of Penaeus monodon", Diseases of Aquatic Organisms 23, pp.239–242 131