Nghiên cứ phát hiện và định lượng một số đột biến gen ty thể phổ biến bằng real-time PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Phùng Bảo Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ PHỔ BIẾN BẰNG REAL-TIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Phùng Bảo Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ PHỔ BIẾN BẰNG REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS PHAN TUẤN NGHĨA Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hƣớng nghiên cứu tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin bày tỏ cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Hồng Loan, ngƣời giúp đỡ tƣ vấn cho tơi nhiều q trình học tập làm việc Tôi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh nhƣ q thầy, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học, thành viên nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái tổ hợp thuộc Phịng thí nghiệm trọng điể m Cơng nghê ̣ Enzym và Protein , Trƣờng Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tƣ̣ nhiên đã giúp đỡ ta ̣o điề u kiê ̣n cho tơi hồn thành chƣơng trình h ọc tập thực luận văn Luận văn đƣợc thực với tài trợ kinh phí đề tài KLEPT.16.03 thân tơi đƣợc hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tƣ cách học viên cao học đề tài Cuối cùng, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè, ngƣời đô ̣ng viên và tạo điề u kiê ̣n th ̣n lơ ̣i cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luâṇ văn Hà Nội, Ngày 20 tháng 11 năm 2017 Học viên cao học Phùng Bảo Khánh i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate BFQ Black fluorescence quencher Chất hấp phụ huỳnh quang Bp Base pair Cặp bazơ CPEO Chronic progressiveexternal ophthalmoplegia Bệnh liệt mắt ngồi tiến triển mạn tính ddH2O Deionized distilled H2O Nƣớc cất loại ion, khử trùng dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide KSS Kearns-Sayre syndrome LB Luria Bertani LHON Leber’s hereditary optic neuropathy Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber LNA Locked nucleic acid Nucleotide dạng khóa MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes Bệnh não giật cơ, tăng acid lactic máu giả tai biến mạch MERRF Myoclonic epilepsy with raggedred fibres Bệnh động kinh giật với sợi đỏ xé rách MGB Minor groove binder Mẫu dò gắn khe nhỏ MRI Magnetic resonance image Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos Hội chứng gây liệt, điều hòa viêm võng mạc OD Optical density Mật độ quang học Axit ethylene diamine tetraacetic Hội chứng Kearn-Sayre ii PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RFLP Restriction fragment length polymorphism Sự đa hình đoạn phân cắt giới hạn ROS Reactive oxygen species Dạng chứa oxy phản ứng TAE Tris -Acetate-EDTA Đệm Tris -acetate chứa EDTA TE Tris-EDTA Đệm Tris-HCl chứa EDTA TEMED N, N, N’, N’- TetramethylEthylenediamine Tm Melting temperature UNG Uracil-DNA glycosylase Nhiệt độ tách chuỗi iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Giới thiệu chung ty thể 1.1.1.Cấu trúc chức ty thể .3 1.1.2.Hệ gen ty thể 1.2 Đột biến gen ty thể bệnh hội chứng liên quan 11 1.2.1.Đột biến gen ty thể 11 1.2.2 Một số bệnh hội chứng đột biến gen ty thể 12 1.3 Các phƣơng pháp phát đột biến gen ty thể 21 1.3.1 PCR-RFLP 22 1.3.2.Giải trình tự gen .23 1.3.3.Real-time PCR 23 1.3.4.Các phƣơng pháp khác .24 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .27 2.1 Nguyên liệu 27 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm .27 2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác .27 2.1.3 Máy móc trang thiết bị .27 2.2 Phƣơng pháp 28 2.2.1 Biến nạp nuôi cấy tế bào E coli chứa plasmid mang đoạn gen có khơng có đột biến gen ty thể 28 2.2.2.Tách chiết định lƣợng DNA 28 2.2.3.Kỹ thuật đa hình phân cắt đoạn giới hạn kết hợp với PCR (PCR-RFLP) 30 iv 2.2.4.Điện di gel agarose gel polyacylamide 31 2.2.5.Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA) 32 2.2.6 Phƣơng pháp thống kê 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Tạo mẫu đối chứng cho real-time PCR phát định lƣợng đột biến gen ty thể phổ biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A 36 3.1.1 Định lƣợng kiểm tra độ tinh plasmid quang phổ kế điện di gel agarose 36 3.1.2 Kiểm tra có mặt đoạn gen chèn plasmid tái tổ hợp PCRRFLP 37 3.2 Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR 39 3.2.1 Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR 39 3.2.2 Xác định thành phần thích hợp master mix 43 3.2.3 Đánh giá độ đặc hiệu master mix .45 3.2.4 Đánh giá độ nhạy master mix 48 3.2.5 Xác định thời gian bảo quản master mix 49 3.2 Điều tra định lƣợng số đột biến gen ty thể phổ biến real-time PCR 51 3.2.1 Điều tra có mặt đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể 51 3.3.2 Phân tích đột biến A3243G thành viên gia đình bệnh nhân MELAS 53 KẾT LUẬN .58 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng bình thƣờng (trái) dạng biến đổi (phải) ty thể Hình 1.2 Cấu trúc ty thể Hình 1.3 Cấu trúc màng ty thể Hình 1.4 Ty thể trình trao đổi lƣợng tế bào Hình 1.5 Hệ gen ty thể Hình 1.6 Thuyết cổ chai di truyền 11 Hình 3.1 Kết điện di plasmid tinh 37 Hình 3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen ty thể điện di agarose 2% 38 Hình 3.3 Điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn kiểm tra đoạn gen đích 39 Hình 3.4 Biểu đồ tƣơng quan tuyến tính chu kì ngƣỡng số ban đầu đột biến 42 Hình 3.5 Biểu đồ tƣơng quan tuyến tính chu kì ngƣỡng số ban đầu đột biến sau đƣợc xác định điều kiện thích hợp 44 Hình 3.6 Đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR mẫu bệnh phẩm không mang đột biến 46 Hình 3.7 Đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR trƣờng hợp dƣơng tính với A3243G đoạn gen khác hệ gen ty thể 48 Hình 3.8 Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại phản ứng realtime PCR sử dụng khuôn 1% đột biến 49 Hình 3.9 Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR đột biến quan tâm sử dụng master mix bảo quản 25oC sau ngày 50 Hình 3.10 Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR đột biến quan tâm sử dụng master mix bảo quản 4oC sau 20 ngày 51 Hình 3.11 Đƣờng cong khuếch đại đột biến A3243G bệnh nhân BN3, BN4, BN, BN5, BN10, BN11, BN12 52 Hình 3.12 Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại biểu đồ thể tƣơng quan chu kì ngƣỡng số ban đầu thành viên gia đình bệnh nhân MELAS 55 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Triệu chứng lâm sàng quan bệnh ty thể 13 Bảng 2.1 Trình tự mồi chu trình nhiệt kích thƣớc sản phẩm PCR 31 Bảng 2.2 Trình tự mồi mẫu dò cho real-time PCR 35 Bảng 3.1 Kết định lƣợng plasmid tinh máy đo quang phổ 36 Bảng 3.2 Thành phần cắt enzyme giới hạn 38 Bảng 3.3 Hiệu suất PCR giá trị tƣơng quan tuyến tính đƣờng chuẩn đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A 42 Bảng 3.4 Hiệu suất real-time PCR giá trị tƣơng quan tuyến tính đƣờng chuẩn đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A sau đƣợc xác định điều kiện thích hợp 45 Bảng 3.5 Triệu chứng lâm sàng tỷ lệ đột biến A3243G bệnh nhân thành viên gia đình bệnh nhân 56 vii viii thể A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C 52 bệnh nhân nghi bệnh ty thể Kết thu đƣợc (Hình 3.11) cho thấy, mẫu bệnh nhân BN4 BN11 có tín hiệu nhân hai kênh tín hiệu đột biến (FAM) khơng đột biến (HEX) với cặp mồi mẫu dị đặc hiệu cho đột biến A3243G, bệnh nhân cịn lại thu đƣợc tín hiệu HEX mà khơng thu đƣợc tín hiệu FAM tất cặp mồi mẫu dò đặc hiệu cho loại đột biến lại Kết chứng tỏ bệnh nhân BN4 BN11 có mang đột biến A3243G dạng không đồng Xét tỷ lệ đột biến, với số lƣợng mẫu 52 bệnh nhân nghiên cứu, bệnh nhân mang đột biến A3243G dạng không đồng đƣợc phát hiện, chiếm tỷ lệ 3,8% Trong tỷ lệ đột biến 2,2% nghiên cứu trƣớc 631 bệnh nhân ngƣời Hungary có triệu chứng bệnh ty thể [17], Tỷ lệ 1,74% đột biến A3243G đƣợc phát nghiên cứu 230 bệnh nhân ngƣời Nhật bị giảm khả nghe [35] 5,7% đột biến A3243G đƣợc phát 106 bệnh nhân nghi bệnh ty thể ngƣời Việt Nam [53] Các kết tần suất đột biến A3243G nghiên cứu khác Điều khác dân tộc, đặc điểm di truyền, tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân, số lƣợng mẫu nghiên cứu, đối tƣợng, độ tuổi nghiên cứu Hình 3.11 Đƣờng cong khuếch đại đột biến A3243G bệnh nhân BN3, BN4, BN5, BN10, BN11, BN12 Mẫu dò huỳnh quang mang HEX, đặc hiệu cho mẫu khơng đột biến, Mẫu dị huỳnh quang mang FAM, đặc hiệu cho mẫu đột biến 52 3.3.2 Phân tích đột biến A3243G thành viên gia đình bệnh nhân MELAS Nhằm xác định tính chất di truyền đột biến A3243G bệnh nhân đƣợc phát hiện, tiến hành xác định có mặt nhƣ định lƣợng xác tỷ lệ đột biến thành viên gia đình bệnh nhân BN4 BN11 Kết phân tích đột biến A3243G với BN4 thành viên gia đình (Hình 3.12A) cho thấy đƣờng cong khuếch đại đặc hiệu cho đột biến xuất với mẫu bệnh nhân BN4 mẹ bệnh nhân mà không với bố bệnh nhân em gái bệnh nhân Giá trị hệ số tƣơng quan tuyến tính logarit số ban đầu chu kì ngƣỡng (R2) đƣờng chuẩn đột biến (màu vàng) đƣờng chuẩn không đột biến (màu xanh lam) nằm khoảng 0,995- 0,997 cho phép khẳng định kết định lƣợng tin cậy Tỷ lệ đột biến A3243G bệnh nhân BN4 mẹ BN04 tƣơng ứng 77,4% 9,7% Tƣơng tự nhƣ gia đình bệnh nhân BN4, kết phân tích đột biến A3243G gia đình bệnh nhân BN11 (Hình 3.12B) cho thấy bệnh nhân, mẹ, chị gái em trai bệnh nhân có mang đột biến A3243G, với tỷ lệ tƣơng ứng 56,5% 13,6%; 29,9% 13,8%, không phát thấy đột biến A3243G bố bệnh nhân Các kết phân tích chứng tỏ đột biến A3243G BN4 BN11 đƣợc di truyền từ mẹ tồn dạng không đồng Cả hai bệnh nhân BN4 BN11 có tỷ lệ đột biến lớn 50% có biểu lâm sàng đặc trƣng cho hội chứng MELAS nhƣ co giật, động kinh, phát tổn thƣơng não chụp cộng hƣởng từ Trong đó, ngƣời thân hai bệnh nhân với tỷ lệ đột biến dƣới 50% khỏe mạnh (Bảng 3.5) điều phù hợp với nghiên cứu trƣớc [45] Hiện tƣợng tỷ lệ đột biến mẹ ngƣời mẹ khác liên quan đến chế di truyền “nút cổ chai”, nghĩa lƣợng nhỏ mtDNA mẹ đƣợc di truyền phân phối ngẫu nhiên trứng dẫn tới trứng có tỷ lệ đột biến khác nhau, chí có trứng khơng mang đột biến Thực tế, nghiên cứu đột biến A3243G gia đình bệnh nhân Trung Quốc phát số 14 bà mẹ có bà mẹ mang đột biến và cả đề u mang đ ột biến, bà mẹ 53 mang đột biến, có mang đột biến không mang đột biến, bà mẹ khơng mang đột biến có mang đột biến không mang đột biến [27] Đột biến A3243G đột biến gen ty thể thƣờng gặp đặc trƣng cho hội chứng MELAS, thƣờng tồn dạng không đồng tế bào Việc điều tra sƣ̣ có mă ̣t và tỷ lê ̣ đô ̣t biế n A 3243G với các bê ̣nh nhân nghi bi ̣ bị bệnh ty thể có hàm lƣợng lactat máu cao cần thiết góp ph ần quan tro ̣ng vào vi ệc chẩn đoán chiń h xác nguyên nhân gây bê ̣nh , tƣ̀ đó giúp đƣa các phác đồ điều trị bệnh phù hơ ̣p, nhƣ có tƣ vấn di truyền cho các đố i tƣơ ̣ng mang gen bê ̣nh 54 A B Hình 3.12 Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại biểu đồ thể tƣơng quan chu kì ngƣỡng số ban đầu thành viên gia đình bệnh nhân MELAS A.Đƣờng cong khuếch đại biểu đồ thể tƣơng quan chu kì ngƣỡng số ban đầu thành viên gia đình bệnh nhân BN4 B Đƣờng cong khuếch đại biểu đồ thể tƣơng quan chu kì ngƣỡngvà số ban đầu thành viên gia đình bệnh nhân BN11 Mẫu dị huỳnh quang mang HEX, đặc hiệu cho mẫu không đột biến, Mẫu dò huỳnh quang mang FAM, đặc hiệu cho mẫu đột biến 55 Bảng 3.5 Triệu chứng lâm sàng tỷ lệ đột biến A3243G bệnh nhân thành viên gia đình bệnh nhân Các thành viên gia đình Giới tính Tuổi Tỷ lệ đột biến máu Nhập viện lần, nôn sốt, co giật, lơ mơ, trạng thái động kinh cục bộ, giảm khả nghe nhìn, khó thở, sụp mi, rậm lơng, men gan cao, toan máu, suy dinh dƣỡng, tổn thƣơng thùy thái dƣơng, thùy chẩm bên Bình trái, tăng tín hiệu thƣờng phim T2 FLAR, nông độ lactate máu 8,8mmol/L Bệnh nhân Nữ Bố Nam 35 Không phát Khỏe mạnh Mẹ Nữ 32 9,7 ±1,77% Khỏe mạnh Em gái Nữ Không phát Khỏe mạnh 77,6 ±0,6% Gia đình BN4 Gia đình BN11 Đặc điểm lâm sàng Bệnh nhân Nữ 14 56,5±1,82 % Động kinh, co giật tay phải chân phải kéo dài đến phút MRI sọ não, hình ảnh tổn thƣơng viêm não Chị gái Nữ 16 29,9±0,73 % Khỏe mạnh Em trai Nam 13,8±1,21 % Khỏe mạnh Mẹ Nữ 37 13,6±0,97% Khỏe mạnh Bố Nam 38 Không phát Khỏe mạnh 56 Bệnh sử gia đình Bình thƣờng 57 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, rút số kết luận sau đây: Đã xây dựng đƣợc cách thức phát định lƣợng đột biến gen ty thể phổ biến A3243G, G3380A (MELAS), A8344G (MERRF), T8993G, T8993C (Leigh), G11778A (LHON) điều kiện real-time PCR sử dụng mẫu dị dạng cầu khóa axit nucleic, việc tạo master mix có vai trị định Master mix đƣợc bảo quản ngày 25oC 4oC 20 ngày cho kết phát định lƣợng đột biến tin cậy Độ đặc hiệu master mix 100% độ nhạy ≥ 1% Với cách thức phát đột biến phát triển đƣợc, điều tra có mặt đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A 52 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể phát đƣợc trƣờng hợp mang đột biến A3243G chiếm 3,8%, đột biến đƣợc di truyền từ mẹ sang tồn dạng không đồng tế bào Tỷ lệ đột biến có tƣơng quan với biểu lâm sàng bệnh Các đột biến lại G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A khơng có mặt mẫu máu 52 bệnh nhân đƣợc lựa chọn nghiên cứu KIẾN NGHỊ  Tiếp tục tối ƣu hóa đánh giá thời gian bảo quản master mix cho realtime PCR -20oC  Ứng dụng cách thức phát định lƣợng đột biến gen ty thể chẩn đoán bệnh ty thể 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh Alston C L., Rocha M C., Lax N Z., Turnbull D M., Taylor R W (2017), “The genetics and pathology of mitochondrial disease”, J Pathol., 241, pp 236- 250 Anderson S., Bankier A T., Barrell B G., Bruijin M H., Coulson A R., Drouin J., Eperon I C., Nierlich D P., Rose B A., Sanger F., Schreier P H., Smith A J H., Staden R., Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature, 290, pp 457-465 Andreyev A Y., Kushnareva Y E., Starkov A A (2005), “Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species”, Biochem Biokhim., 70, pp 200-– 214 Ayed I B., Chamkha I., Mkaouar-Rebai E., Kammoun T., Mezghani N., Chabchoub I., Aloulou H., Hachicha M., Fakhfakh F (2011), “A Tunisian patient with Pearson syndrome harboring the 4.977 kb common deletion associated to two novel large-scale mitochondrial deletions”, Biochem Biophys Res Commun., 411, pp 381-386 Bai R K., Wong L C (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial DNA by real-timeamplification refractory mutation system quantitative PCR analysis: A single-step approach”, Clin Chem., 50(6) pp 996-1001 Baracca A., Sgarbi G., Mattiazzi M., Casalena G., Pagnotta E., Valentino M L., Moggio M., Lenaz G., Carelli V., Solaini G (2007), “Biochemical phenotypes associated with the mitochondrial ATP6 gene mutations at nt8993”, Biochim Biophys Acta, 1767(7), pp 913-919 Cao Y., Ma Y., Zhang Y., Li Y., Fang F., Wang S., Bu D., Xu Y., Pei P., Li L., Xiao Y., Wua H, Yang Y., Zou L., Qi Y (2010), “Detection of eight 59 frequently encountered point mutations in mitochondria in Chinese patients suggestive of mitochondrial encephalomyopathies”, Mitochondrion 10, pp 330-334 Chae J H., Hwang H., Lim B C., Cheong H I., Hwang Y S., Kim K J (2004), “Clinical features of A3243G mitochondrial tRNA mutation”, Brain Dev., 26(7), pp 459-62 Chen X J., Butow R A., (2005), “The organization and inheritance of the mitochondrial genome”, Nat Rev Genet 6, pp 815-–825 10 Chinnery P F (2002), “Inheritance of mitochondrial disorders”,Mitochondrion 2, pp 149-155 11 Chinnery P F., Brown D T., Andrews R M., Singh-Kler R., Riordan-Eva P., Lindley J., Applegarth D A., Turnbull D M., Howell N (2001), “The mitochondrial ND6 gene is a hot spot for mutations that cause Leber’s hereditary optic neuropathy”, Brain, 124, pp 209-218 12 Chinnery P F., Elliott H R., Hudson G., Samuels D C., Relton C L (2012), “Epigenetics, epidemiology and mitochondrial DNA diseases” Int J Epidemol., 41, pp 177–187 13 Chow J., Rahman J., Achermann J C., Dattani M T., Rahman S (2017), “Mitochondrial disease and endocrine dysfunction”, Nat Rev Endocrinol., 13(2), pp 92-104 14 Davison J E., Rahman S (2017), “Recognition, investigation and management of mitochondrial disease”, Arch Dis Child, 0, pp 1-9 15 Fawcett D.W (1981), “The Cell”, WB Saunders Company, NewYork, (2), pp 415-419 16 Frey T G., Mannella C A (2000), “The internal structure of mitochondria”, Trends Biochem Sci., 25(7), pp 319-324 17 Gal A., Komlosi K., Maasz A., Pentelenyi P., Valikovics A., Dioszeghy P., Remenyi V., Ovary C., Bereczki1 D., Melegh B., Molnár M J 60 (2010), “Analysis of mtDNA A3243G mutation frequency in Hungary”, Cent Eur J Med., 5(3), pp 322-328 18 Gorman G S., Schaefer A M., Ng Y., Gomez N., Blakely E L., Alston C L., Feeney C., Horvath R., Yu-Wai-Man P., Chinnery P F., Taylor R W., Turnbull D M., McFarland R (2015), “Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease”, Ann Neurol., 77(5), pp 753-759 19 Gropman A L (2001), “Diagnosis and treatment of childhood mitochondrial diseases”, Curr Neurol Neurosc Rep., 1(2), pp 185-94 20 Gropman A L (2004), “The neurological presentations of childhood and adult mitochondrial disease: established syndromes and phenotypic variations, Mitochondrion 4, pp 503-520 21 Hammans S R., Sweeney M G., Brockington M., Morgan-Hughes J A., Harding A E (1991) “Mitochondrial encephalopathies: molecular genetic diagnosis from blood samples”, Lancet, 1, 337(8753), pp 1311-1323, 22 Hirano M., Ricci E., Koenigsberger M R., Defendini R., Pavlakis S M.,DeVivo D C.,DiMauro S., Rowland L P (1992), “MELAS: an original case and clinical criteria for diagnosis, Neuromuscul Disor., 2, pp 125-135 23 Kirkman M A (2009) “Gene environment interactions in Leber hereditary optic neuropathy”, Brain, 132, pp 2317-2326 24 Leigh D (1951), “Subacute necrotizing encephalomyelopathy in an infant”, J Neurol Neurosurg Psych., 14(3), pp 216-221 25 Lim K S., Naviaux R K., Haas R H (2007), “Quantitative mitochondrial DNA mutation analysis by denaturing HPLC”, Clin Chem, pp 1046-1052 26 Lorenzoni P J., Scola R H., Kay C S., Silvado C E., Werneck L C.(2014), “When should MERRF (myoclonus epilepsy associated with ragged-red fibers) be the diagnosis”, Arq Neuropsiquiatr., 72(10), pp 803-811 61 27 Ma Y., Fang F., Cao Y., Yang Y., Zou L., Zhang Y., Wang S., Zhu S., Xu Y., Pei P., Qi Y (2010), “Clinical features of mitochondrial DNA m.3243A>G mutation in 47 Chinese families”, J Neurol Sci., 291(1-2), pp 17-21 28 Man P., Griffiths P., Brown D (2003), “The epidemiology of Leber hereditary optic neu-ropathy in the North East of England”, Am J Hum Genet., 72, pp 333-339 29 Man P Y W., Turnbull D M., Chinnery.P F (2002), “Leber hereditary optic neuropathy”, J Med Genet 2002, 39, pp 162-169 30 Mancuso M., Orsucci D., Angelini C., Bertini E., Carelli V., Comi G P., Donati M A., Federico A., Minetti C., Moggio M., et al (2015), “Redefining phenotypes associated with mitochondrial DNA single deletion”, J Neurol., 262(5), pp 1301-1309 31 Marotta R J., Chin J A., Quigley S., Katsabani S R., Kapsa E., Byrne S C (2004), “Diagnostic screening of mitochondrial DNA mutations in Australian adults 1990–2001”, Int Med J., 34, pp 10-19 32 Mishra P., Chan D C., (2014), “Mitochondrial dynamics and inheritance during cell division, development and disease”, Nat Rev Mol Cell Biol., 15(10), pp 634-646 33 Moslemia A R., Tuliniusb M., E Holmec, Oldforsa A (1998), “Threshold expression of the tRNALys A8344G mutation in single muscle fibres”, Neuromusc Disor., 8, pp 345-349 34 Murphy M P (2009), “How mitochondria produce reactive oxygen species”, Biochem J 417, pp 1–13 35 Nagata H., Kumahara K., Tomemori T., Arimoto Y., Isoyama K., Yoshida K., Konno A (2001), “Frequency and clinical features of patients with sensorineural hearing loss associated with the A3243G mutation of the mitochondrial DNA in otorhinolaryngic clinics”, J Hum Genet., 46(10), pp 595-9 62 36 Park H., Davidson E., King M P., (2003), “The pathogenic A3243G mutation in human mitochondrial tRNALeu(UUR) decreases the efficiency of aminoacylation” Biochemistry, 42 (4), pp 958-964 37 Pavlakis S G., Phillips P C.,Dimauro S.,Devivo D C.,Rowland L P (1984),“Mitochondrialmyopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: a distinctiveclinical syndrome, Ann Neurol, 16, pp 481488 38 Poulton J., Macaulay V., Marchington D R (1998), “Mitochondrial Genetics 98 is the bottleneck cracked’, Am J Hum Genet, 62, pp 752-757 39 Rossignol R., Faustin B., Rocher C., Malgat M., Mazat J P., Letellier T (2003), “Mitochondrial threshold effects”, Biochem J., 15, 370, pp 751-762 40 Ruhoy L S., Saneto R P (2014), “The genetics of Leigh syndrome and its implications for clinical practice and risk management”, Appl Clin Genet., 7, pp 221-234 41 Sallevelt S C., Die-Smulders C E., Hendrickx A T., Hellebrekers D M., Coo I F., Alston C L., Knowles C., Taylor R W., McFarland R., Smeets H J.(2017), “De novo mtDNA point mutations are common and have a low recurrence risk” J Med Genet., 54(2), pp 73-83 42 Shanskea S., Wong L J C (2004),“Molecular analysis for mitochondrial DNA disorders”, Mitochondrion 4, pp 403-415 43 Singh R., Ellard S., Hattersley A., Harries L W (2006), “Rapid and sensitive real-time polymerase chain reaction method for detection and quantification of 3243A>G mitochondrial point mutation”, J Mol Diagn., 8(2), pp 225-30 44 Sofronova J K., Ilinsky Y Y., Orishchenko K E., Chupakhin E G., Lunev E A., Mazunin I O (2016), “Detection of mutations in mitochondrial DNA by droplet digital PCR”, Biochemistry, 81(10), 10, pp 1031-1037 45 Sproule D M., Kaufmann P (2008), “Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and 63 therapeutic management of MELAS syndrome”, Ann NY Acad Sci.1142, pp 133-158 46 Spruijt L (2006), “Influence of mutation type on clinical expression of Leber here-ditary optic neuropathy”, Am J Ophthalmol., 141, pp 676-682 47 Strand H., Ingebretsen O C., Nilssen O (2008), “Real-time detection and quantification of mitochondrial mutations with oligonucleotide primers containing locked nucleic acid”, Clin Chim Acta, 390(1-2), pp 126-133 48 Szuhai K., Jody M., Ouweland V., Dirks R W., Lemtre M., Truffert J C., Janssen G.M., Tanke H J., Holme E., Maassen J A., RaapA K (2001), “ Simultaneous A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy number quantification in Myoclonus Epilepsy and Ragged-Red Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular Beacon based real-time fluorescence PCR” Nucleic Acids Res., 29(3), pp e13 49 Tajima H., Sueoka K., Moon S Y., Nakabayashi A., Sakurai Y., Murakoshi Y., Watanabe H., Iwata S., Hashiba T., Kato S Goto Y I., Yoshimura Y (2007), “The development of novel quantification assay for mitochondrial DNA heteroplasmy aimed at preimplantation genetic diagnosis of Leigh encephalopathy”, J Assist Reprod Genet., 24, pp 227-232 50 Taylor R W., Morris A A M., Hutchinson M., Turnbull D M (2002), “Leigh disease associated with a novel mitochondrial DNA ND5 mutation”, Eur J Hum Genet, 10, pp 141-144 51 Taylor R W., Turnbull D M (2005),“Mitochondrial DNA mutations in human disease”,Nature Genet.,6, pp 389-402 52 Truong T H, Nguyen T.V A., Nguyen T H L., Pham V A., Phan T N (2014s), “Sensitive quantitation of mitochoncirial mutation using new Taqman probes”, Cent Eur J Med., 9(6), pp 839-848 53 Truong T H., Nguyen T V A., Nguyen V L., Pham V A., Phan T N (2014), “Screening of common point-mutations and discovery of new T14727C change in mitochondrial 64 genome of Vietnamese encephalomyopathy patients”, Mitochondrial DNA ,27(1), pp 441-448 54 Tuppen H A., Blakely E L., Turnbull D M., Taylor R W (2010), “Mitochondrial DNA mutations and human disease”, 1797(2), pp 113-128 55 Wallace D (1988), “Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s heredi-tary optic neuropathy, Science, 242, pp 1427–1430 56 Wang J Y., Gu Y S., Wang J., Tong Y., Wang Y., Shao J B., Qi M (2008), “MGB probe assay for rapid detection of mtDNA11778 mutation in the Chinese LHON patients by real-time PCR”, J Zhejiang Univ Sci B, 9(8), pp 610-615 57 White H E., Durtonand V J., Seller A (2005), “Accurate detection and quantitation ofheteroplasmic mitochondrial point mutations by pyrosequencing”, Genet.Test, 9(3), pp 190-199 58 Wilson C J., Wood N W., Leonard J V., Surtees R., Rahman S (2000), “Mitochondrial DNA point mutation T9176C in Leigh syndrome”, J Child Neurol., 15(12), pp 830-833 59 Wong L J (2007), “Pathogenic mitochondrial DNA mutations in protein-coding genes”,Muscle Nerve, 36, pp 279-293 60 Wong, L J C., Senadheera D (1997), “Direct detection of multiple point mutations in mitochondrial DNA”, Clin Chem., 43(10), pp 1857-61 61 Yu Q., Zhang Y., Wang Z., Yang Y., Yuan Y., Niu S., Pei P., Wang S, Ma Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao J., Sun F., Zhang Y., Wu Y., Wang S., Xiong H., Wu X (2007), “Screening of common mitochondrial mutations in Chinese patients with mitochondrial encephalomyopathies’, Mitochondrion 7, pp 147-150 62 Zhou X., Zhang H., Zhao F., Ji Y., Tong Y., Zhang J., Zhang Y., Yang L., Qian Y., Lu F., Qu J., Guan M X (2010), “Very high penetrance and occurrence of Leber’s hereditary optic neuropathy in a large Han Chinese pedigree carrying the ND4 G11778A mutation”, Mol Genet Metab, 100, pp 379-384 65 Tài liệu tham khảo trang web 63 http://dnagdansk.com/media/ProductFiles/specifications_pcr_kits.pdf 66