Nghiên cứu nấm Phytophthora Palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao và một số vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ TÂM NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO VÀ MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ TÂM NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO VÀ MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM NGỌC DUNG TS PHẠM THẾ HẢI Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong ś t quá trình học tập và thực hiện đề tài, em đã nhâ ̣n đươ ̣c sự giúp đỡ và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắ c nhấ t đế n tâ ̣p thể hướng dẫn khoa ho ̣c : TS Phạm Ngọc Dung và TS Phạm Thế Hả i, những người thầ y tâm huyế t , đã tâ ̣n tình hướng dẫn , chỉ bảo và giúp đỡ em quá trình thực hiê ̣n đề tài và hoàn thành luâ ̣n văn này Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắ c đế n Ban lañ h đa ̣o , Phòng tổ chức hành chính , Bô ̣ môn An toàn và Đa da ̣ng sinh ho ̣c , Viê ̣n Môi trường Nông nghiê ̣p đã đồ ng ý và tạo điều kiện cho em về thời gian học tập và thực hiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bô ̣ thuô ̣c nhóm Bê ̣nh ̣i ăn quả và công nghệ sinh ho ̣c, Bô ̣ môn Bê ̣nh Cây , Viê ̣n Bảo Vê ̣ Thực Vâ ̣t đã ta ̣o điề u kiê ̣n giúp đỡ quá trin ̀ h thực hiê ̣n các thí nghiê ̣m đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới quý thầ y cô ta ̣i Khoa Sinh ho ̣c , đă ̣c biê ̣t là các thầ y cô ở Bô ̣ môn Vi sinh vâ ̣t ho ̣c, trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã nhiê ̣t tin ̀ h giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích , phương pháp luâ ̣n và nghiên cứu khoa ho ̣c, làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắc nhấ t đến gia đình , người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã đô ̣ng viên , giúp đỡ và dành những tình cảm thân thương - đó là ng̀ n ̣ng lực ma ̣nh mẽ để có thể hoàn thành bản luâ ̣n văn này Hà Nội, ngày tháng năm 2014 HỌC VIÊN Phạm Thị Tâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao Thế giới và Viêṭ Nam 1.1.1 Tình hình thiệt hại nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao gây nên 1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Phytophthora palmivora 1.1.3 Qui luật phát sinh và phát triển của bệnh 1.1.4 Một số nghiên cứu về phân lập nấm Phytophthora 1.1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định các loài nấm Phytophthora gây hại trồng 1.2 Tình hình nghiên cứu biện pháp phịng trừ sinh học bệnh thối đen quả ca cao Thế giới và Viêṭ Nam 11 1.2.1 Nấm Trichoderma sp đối kháng nấm P palmivora 12 1.2.2 Nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 18 Chƣơng 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nội dung nghiên cứu 21 2.2 Vật liệu nghiên cứu 21 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 21 2.2.2 Các trang thiết bị và dụng cụ 22 2.2.3 Nguồn vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 22 2.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phương pháp phân lập, xác định nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 23 2.4.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo để xác định độc tính gây bệnh của nấm Phytophthora palmivora quả ca cao 25 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái , sinh học, sinh thái của nấ m P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 25 2.4.4 Phân lập và tuyển chọn số vi sinh vật đối kháng nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao điều kiện phòng thí nghiệm 26 2.4.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và sinh hóa của số nấm Trichoderma sp có khả đối kháng cao với nấm P palmivora 28 2.4.6 Nghiên cứu số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng với nấm P palmivora 30 2.4.7 Định loài nấm kỹ thuật sinh học phân tử 33 2.4.8 Xác định loài vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 35 2.4.9 Chỉ tiêu theo dõi chung 36 2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu 36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Xác định tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao 37 3.1.1 Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao 37 3.1.2 Lây bệnh nhân tạo để xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao 42 3.1.3 Xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao kỹ thuật sinh học phân tử 44 3.2 Đặc điểm hình thái nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 48 3.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 52 3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của sợi nấm 52 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của sợi nấm 54 3.3.3 Ảnh hưởng của độ pH tới sự phát triển của sợi nấm P palmivora …… ….60 3.3.4 Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến nấm P palmivora 57 3.4 Xác định số vi sinh vật có khả đối kháng với nấm P palmivora 59 3.4.1 Phân lập các vi sinh vật đối kháng các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông 59 3.4.2 Xác định khả đối kháng của các vi sinh vật có ích với nấm gây bệnh 62 3.4.3 Nghiên cứu số đặc tính sinh học của các chủng nấm Trichoderma phân lập 67 3.4.4 Định danh nấm Trichoderma kỹ thuật sinh học phân tử 73 3.4.5 Nghiên cứu số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng với nấm P palmivora 74 3.4.6 Xác định đặc điểm phân loại của các vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora kỹ thuật sinh học phân tử 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT Viết tắt Cụm từ a, b, c, d : Phân lớp sự sai khác giữa các công thức AFLP : Kỹ thuật phân tích đa hình đoạn dài kh́ch đại CA : Mơi trường cà rốt, agar CMA : Môi trường cà rốt, bột ngô, agar cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Độ biến động của thí nghiệm (%) DNA : Axit deoxyribonucleic ĐC : Đối chứng ĐK : Đường kính HQ : Hiệu quả IRRISTAT : Phần mềm thống kê nông nghiệp KH : Ký hiệu PCA : Môi trường khoai tây, cà rốt, agar PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp PDA : Môi trường khoai tây, dextrose, agar RFLP : Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn giới hạn sp : Một loài spp : Nhiều loài VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả bẫy nấm Bảng 3.2 Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao 37 Ảnh hưởng của thuốc Benlat 80WP đến khả phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh thối đen quả ca cao 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thuốc Tachigaren 30L đến khả phân lập nấm Phytophthora sp gây thối đen quả ca cao 40 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh RH đến khả phân lập nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao 41 Bảng 3.5 Kết quả lây nhiễm nhân tạo các chủng nấm Phytophthora sp Bảng 3.6 gây bệnh thối đen quả ca cao 43 Kết quả giải trình tự các mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao 44 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Định danh các loài nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao dựa tìm kiếm sở dữ liệu 46 Đặc điểm hình thái các loài nấm Phytophthora palmivora phân lập từ ca cao 51 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao 54 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 56 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 57 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của độ chiếu sáng đến sự phát triển của nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao 59 Bảng 3.13 Số chủng Trichoderma spp phân lập từ tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông 60 Bảng 3.14 Số chủng vi khuẩn phân lập từ tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông có khả đối kháng nấm P palmivora 61 Bảng 3.15 Khả ký sinh của các chủng nấm Trichoderma sp nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 63 Bảng 3.16 Khả ức chế nấm P palmivora chất kháng sinh bay của các chủng nấm Trichoderma spp 65 Bảng 3.17 Hiệu quả ức chế của số chủng vi khuẩn phân lập với nấm P palmivora gây thối đen quả ca cao 66 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 69 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 71 Bảng 3.20 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 72 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 73 Bảng 3.22 Định tính hoạt độ enzyme của các chủng nấm Trichoderma sp có triển vọng đối kháng cao với nấm P palmivora 73 Bảng 3.23 Giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi Ngân hàng Gen (GenBank) 75 Bảng 3.24 Khả lên men yếm khí của số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 76 Bảng 3.25 Khả khử nitrat của số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 77 Bảng 3.26 Khả đồng hóa nguồn Các bon từ đường Glucose, Sacarose, tinh bột tan và rượu Mannitol của các chủng vi khuẩn có triển vọng 78 Bảng 3.27 Khả chịu mặn của các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 79 Bảng 3.28 Định tính hoạt độ enzyme của số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 80 Bảng 3.29 Kết quả xác định loài vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora sinh học phân tử 81 DANH MỤC HÌ NH Trang Hình 1.1 Sơ đờ chu trình số ng của nấ m Phytophthora Hình 1.2 Hình thái học của Phytophthora palmivora Hình 3.1 Cây phả hệ không rễ dựa chuỗi ITS cho thấy mối quan hệ của 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao Việt Nam với các loài Phytophthora 47 Hình 3.2 Đặc điểm của bào tử nang 48 Hình 3.3 Bào tử nang hình thành cành bào tử mọc dạng sym 49 Hình 3.4 Bào tử hậu hình thành đỉnh sợi và giữa sợi 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng của mơi trường ni cấy đến sự phát triển của nấm P palmivora 53 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P palmivora 56 Hình 3.7 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P palmivora 58 Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ chiếu sáng đến sự phát triển của nấm P palmivora 58 Hình 3.9 Đồ thị thể hiện tỷ lệ phân lập các chủng nấm Trichoderma spp thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nơng 61 Hình 3.10 Đồ thị thể tiện tỷ lệ phân lập các chủng vi khuẩn có triển vọng đối kháng nấm P palmivora 62 Hình 3.11 Hiệu quả ức chế của các chủng nấm Trichoderma spp nấm P palmivora 63 Hình 3.12 Khả ký sinh của các chủng nấm Trichoderma sp đối kháng với nấm P palmivora 64 Hình 3.13 Hiệu quả ức chế nấm P palmivora chất kháng sinh bay của các chủng nấm Trichoderma spp 65 Hình 3.14 Khả ức chế nấm P palmivora chất kháng sinh bay của các chủng nấm Trichoderma spp 66 Hình 3.15 Hiệu quả ức chế của số chủng vi khuẩn phân lập với nấm P palmivora 67 Hình 3.16 Khả đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm P palmivora 67 F30711 Hình 3.20 Định tính hoạt độ enzyme cellulase chủng nấm F30711 Kết quả cho thấy cả chủng nấm Trichoderma spp đều cho vòng phân giải định tính các enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase môi trường Chủng F30711 có vòng phân giải cao sau ngày: (Cellulase; Chitinase và βGlucanase : 6,4; 3,2 và 3,8cm), tương ứng chủng này có hoạt độ enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao Các chủng khác cho đường kính vòng phân giải thấp hơn, đạt từ 1,3- 5,3 cm Theo các nghiên cứu trước cho thấy: các loài nấm mốc Trichoderma cho hàm lượng chitinase cao Chitinase giữ vai trò chính hoạt động ký sinh của các loài nấm này với các loài nấm gây bệnh cho trồng Nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh tiết hệ enzyme phân hủy chitin của vách tế bào nấm gây bệnh bao gồm enzyme: enzyme -1,4-N-acetylglucosaminidase và enzyme endochitinase Các chủng nấm mốc Trichoderma có khả sản sinh -glucanase cao -glucanase của Trichoderma giữ vai trò chính hoạt động ký sinh để đối kháng nấm gây bệnh trồng -1,3-glucanase Trichoderma kìm hãm quá trình sinh tổng hợp -1,3-glucan vách tế bào, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh 3.4.4 Định danh nấm Trichoderma kỹ thuật sinh học phân tử Từ những chủng nấm Trichoderma đối kháng nấm P palmivora tuyển chọn trên, thông qua khả đối kháng và số đặc tính sinh học tốt, chúng 73 chọn chủng nấm (F30711) để xác định loài kỹ thuật sinh học phân tử (tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam), kết quả xác định trình bày bảng 3.23 Bảng 3.23 Giải trình tự tìm kiếm các chuỗi gần gũi Ngân hàng Gen (Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 2014) STT Mẫu Mã trình tự F30711 15A1ZAA043 Đoạn đọc đƣợc (nucleotide) 564 Loài xác định Phần Mức trăm đồng đoạn so sánh trình tự (%) (%) Trichoderma asperellum 100 100 Như vậy, chủng nấm (F30711) xác định là loài Trichoderma asperellum 3.4.5 Nghiên cứu số đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn đối kháng với nấm P palmivora Từ 100 mẫu đất thu thập tại Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông, chúng phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn (được ký hiệu là B2.2; B14.1; B11.2) có khả đối kháng cao với nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao (bảng 3.15) Từ chủng này, chúng tiếp tục nghiên cứu số đặc tính sinh lý, sinh hóa bản của chúng khả lên men yếm khí, khả khử nitrat, khả đồng hóa nguồn các bon từ các loại đường khác nhau, khả chịu mặn và khả tiết enzyme nhằm mục đích tuyển chọn chủng vi khuẩn có các đặc tính tốt để làm nguồn vi sinh vật cho sản xuất chế phẩm sau này 3.4.5.1 Khả lên men yếm khí các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora Để xác định khả lên men yếm khí của số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora có triển vọng trên, chúng sử dụng môi trường dinh dưỡng chọn lọc, cấy điều kiện yếm khí và hiếu khí Vi khuẩn có khả đồng hóa chất dinh dưỡng theo các đường khác nhau, sản phẩm cuối cùng tạo môi trường có tính axit (màu vàng da cam) và môi trường có tính bazơ (màu xanh đậm), đối chứng màu xanh, sự biến đổi màu của chất chỉ thị Bromthymol blue, kết quả thu bảng 3.24 74 Bảng 3.24 Khả lên men yếm khí số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora (Viện Bảo vệ thực vật, 2014) Ký hiệu chủng B11.2 B14.1 B 2.2 Đối chứng Ghi chú: Tính yếm khí pH A xít A xít yếu A xít Trung tính Phản ứng + + + - Màu Da cam Vàng nhạt Da cam Xanh (+) Phản ứng dương tính (màu da cam, vàng nhạt, xanh đậm) (-) Phản ứng âm tính (màu xanh) Hình 3.21 Khả lên men ́m khí chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora Trong điều kiện yếm khí (có phủ lớp parafin phía mặt môi trường), các vi khuẩn đều có khả phát triển làm đổi màu môi trường chuyển từ màu xanh sang màu da cam, màu vàng nhạt Như vậy, các vi khuẩn thuộc vào nhóm kỵ khí không bắt buộc Nhóm kỵ khí không bắt buộc này có khả sinh trưởng phát triển điều kiện có không khí và không có không khí, là đặc điểm thuận lợi cho việc tạo dạng chế phẩm phòng trừ nấm P palmivora và khả tồn tại của chế phẩm đồng ruộng 3.4.5.2 Khả khử Nitrat một số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora Nitrat có nhiều thiên nhiên (nước mưa), có số vi sinh vật có khả sử dụng nitrat làm nguồn nitơ và khử chúng thành NH3 Khả khử Nitrat là những sở để đánh giá và phân loại vi sinh vật 75 Chúng tiến hành xác định khả khử nitrat của số chủng vi khuẩn có triển vọng trên, kết quả thu bảng 3.25 Bảng 3.25 Khả khử nitrat số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora (Viện Bảo vệ thực vật, 2014) Ký hiệu chủng B 2.2 B 11.2 B 14.1 Đối chứng Ghi chú: Khử Nitrat + + + - Màu phản ứng Đỏ nâu Vàng Đỏ Không màu (+) Phản ứng dương tính (Nâu, Đỏ, Hồng, Vàng) (-) Phản ứng âm tính (khơng chủn màu) Hình 3.22 Khả khử nitrat chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora Kết quả cho thấy dịch nuôi cấy chuyển từ không màu sang màu (đỏ, đỏ nâu, vàng) là vi khuẩn có khả khử Nitrat Trong số tất cả các chủng vi khuẩn phân tích đều có khả khử Nitrat: Vi khuẩn (B2.2) chuyển sang màu Đỏ nâu; vi khuẩn (B14.1) chuyển sang màu đỏ; vi khuẩn (B11.2) chuyển sang màu vàng 3.4.5.3 Khả đồng hóa nguồn Các bon từ đường Glucose, Sacarose, Tinh bột tan (Starch) và rượu Mannitol một số chủng vi khuẩn có triển vọng Đánh giá khả đồng hóa nguồn các bon từ đường glucose, sacarose, tinh bột tan và rượu mannitol của số chủng vi khuẩn đối kháng có triển vọng 76 Chúng sử dụng môi trường đặc hiệu để nuôi cấy, có bổ sung loại đường, tinh bột tan và rượu mannitol môi trường Sử dụng chất chỉ thị Bromthymol blue để xác định các chủng vi khuẩn có khả đồng hóa các nguồn Các bon, kết quả ghi nhận bảng 3.26 Bảng 3.26 Khả đồng hóa nguồn Các bon từ đƣờng Glucose, Sacarose, tinh bột tan rƣợu Mannitol các chủng vi khuẩn có triển vọng (Viện Bảo vệ thực vật, 2014) Ký hiệu chủng Đƣờng Glucose Đƣờng Sacarose Tinh bột tan (Starch) Rƣợu Mannitol B 2.2 + + + + B 11.2 + + + - B 14.1 + + + + - - - Đối chứng Hình 3.23 Khả đồng hóa nguồn các bon chủng vi khuẩn B14.1 Các chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường khoáng bản có bổ sung các nguồn các bon khác nhau, khả sử dụng nguồn các bon nhận biết thông qua chất chỉ thị Bromthymol blue, môi trường từ màu xanh nhạt chuyển sang màu vàng da cam chứng tỏ vi khuẩn có khả đồng hóa nguồn các bon đó Trong thí nghiệm thử khả đồng hóa nguồn các bon từ đường Glucose, Sacarose, Tinh bột tan và rượu Mannitol, kết quả cho thấy: cả chủng vi khuẩn đều có khả đồng hóa mạnh nguồn các bon từ cả loại đường Glucose và 77 Sacarose và đồng hóa nguồn các bon từ tinh bột tan Trong số đó có chủng (B2.2 và B14.1) có khả đồng hóa nguồn các bon từ rượu Mannitol, chủng (B11.2) không có khả đồng hóa nguồn các bon từ rượu mannitol Trong số chủng vi khuẩn đối kháng, có chủng (B2.2 và B14.1) có khả đồng hóa cả loại các bon: đường Glucose, Sacarose, tinh bột tan và rượu Mannitol 3.4.5.4 Tính chịu muối (NaCl) các chủng vi khuẩn đối kháng có triển vọng Đánh giá khả chịu mặn của các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora Chúng sử dụng môi trường đặc hiệu để nuôi cấy, có sử dụng NaCl nồng độ 1% và 4% môi trường Đếm số khuẩn lạc mọc môi trường, kết quả trình bày bảng 3.27 Bảng 3.27 Khả chịu mặn các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora (Viện Bảo vệ thực vật, 2014) Ký hiệu chủng B2.2 B11.2 B14.1 CV% Số khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy NaCl (1%) NaCl (4%) a 311,1 249,0b 349,5b 184,8a 408,3c 5,3 250,7b 22,2 Ghi chú: - Các chữ cái khác một cột sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Trong số chủng vi khuẩn đối kháng đều có khả chịu mặn với nồng độ NaCl 1% Ở nồng độ NaCl 4%, chủng vi khuẩn (B14.1) và (B2.2) có khả phát triển tốt, tốt là vi khuẩn (B14.1), vi khuẩn (B11.2) phát triển Đặc tính chịu mặn này có ý nghĩa các chủng này sử dụng để kháng P palmivora những nơi đất mặn, vi sinh vật có ích có thể phát triển 3.4.5.5 Định tính hoạt đợ enzym chitinase, β-glucanase và cellulase các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora Sau đánh giá tính đối kháng nấm P palmivora của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên, chúng tiếp tục lựa chọn những chủng có hoạt độ enzyme cao có khả phân giải các vi sinh vật gây bệnh Nuôi cấy các chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu, đo đường kính vòng phân giải để đánh giá hoạt tính các enzyme: Cellulase, Chitinase, β-Glucanase, kết quả ghi nhận bảng 3.28 78 Bảng 3.28 Định tính hoạt độ enzyme số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora (Viện Bảo vệ thực vật, 2014) Ký hiệu chủng Đƣờng kính vịng phân giải (cm) Sau ngày Sau ngày Cellulase Chitinase β-Glucanase Cellulase Chitinase β-Glucanase B2.2 2,8 2,8 2,8 3,0b 3,9d 3,0d B11.2 2,4 2,0 1,8 2,6b 2,3b 2,4c B14.1 2,4 2,6 1,4 2,9b 3,0c 1,8b Đối chứng 0,0 0,0 0,0 0,0a 0,0a 0,0a 6,0 7,0 5,0 CV% Ghi chú: - Các chữ cái khác mợt cợt sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn B2.2 có hoạt tính cả loại enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao (3,0; 3,9 và 3,0 cm sau ngày), chủng B14.1 có hoạt tính khá cả loại enzyme Riêng chủng vi khuẩn B11.2 hoạt tính của enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase đều thấp, đường kính vòng phân giải chỉ đạt (2,6; 2,3, 2,4 cm sau ngày) Hình 3.24 Định tính hoạt độ enzyme cellulase các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora sau ngày 3.4.6 Xác định đặc điểm phân loại vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora kỹ thuật sinh học phân tử Từ những chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora tuyển chọn trên, thông qua khả đối kháng và số đặc tính sinh hóa tốt nghiên cứu, chúng tơi tiến hành phân tích trình tự rDNA của chủng vi khuẩn B14.1, B2.2 và 79 B11.2 (tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam) để xác định loài Kết quả xác định trình bày bảng 3.29 Bảng 3.29 Kết quả xác định loài vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora kỹ thuật sinh học phân tử (Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, 2014) Kích thƣớc Phần Mã KH Phản ứng sản phẩm trăm GenBank chủng sequencing sau lắp đồng gần gũi ráp (bp) trình tự Lồi B2.2 13B5ZAA004, 13B5ZAA005 1436 99,86 EU194897 Bacillus methylotrophicus B14.1 13B5ZAA012, 13B5ZAA013 1321 99,62 FN597644 B11.2 13B5ZAA018, 13B5ZAA019 1430 100 Bacillus amyloliquefaciens subsp Amyloliquefaciens EA016877 Bacillus cereus - Trong số vi khuẩn xác định có loài vi khuẩn có ích là: (B2.2) Bacillus methylotrophicus và (B14.1) Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens có triển vọng để tiếp tục cho các nghiên cứu sản xuất chế phẩm tiếp theo - Vi khuẩn (B11.2) Bacillus cereus là vi khuẩn không có ích, gây ngộ độc cho người thơng qua nguồn thức ăn Vì vậy vi khuẩn (B11.2) không sử dụng cho nghiên cứu sản xuất chế phẩm 80 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kế t luâ ̣n - Đã phân lập và xác định đặc điểm sinh học của 20 chủng nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao Việt Nam - Nấm P palmivora sinh trưởng tốt môi trường PCA và CMA, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển 25 - 300C, với pH môi trường từ – 7, sau ngày đường kính tản nấm đạt kích thước tối đa (9,0 cm) - Đã tuyển chọn chủng nấm Trichoderma (F10711, F20711, F30711, F40711) từ đất trồng ca cao tại Tây Nguyên có triển vọng đối kháng với nấm P palmivora Các chủng nấm này phát triển thích hợp môi trường PDA, nhiệt độ từ 25 - 300C, pH từ - 6, các điều kiện này đường kính sợi nấm đạt kích thước lớn (7,8 cm), lượng bào tử cao (4,93 x 109 bào tử/ ml) Chủng nấm F30711 có khả ức chế nấm P palmivora đạt hiệu quả cao (92,0%), tiếp đến là chủng F10711 (90,9%) Chủng nấm F30711 thể hiện hoạt tính các enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao (6,4; 3,2 và 3,8cm sau ngày) Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, xác định chủng nấm F30711 thuộc loài Trichoderma asperellum - Đã xác định và tuyển chọn chủng vi khuẩn (B2.2; B11.2; B14.1) có triển vọng đối kháng với nấm P palmivora Khả ức chế của chủng vi khuẩn này môi trường đều đạt hiệu quả cao sau 10 ngày nuôi cấy (86,0 - 89,7%) Ứng dụng kỹ thuật vi sinh vật và sinh học phân tử xác định chủng vi khuẩn B2.2 - Bacillus methylotrophicus và B14.1 - Bacillus amyloliquefaciens subsp Amyloliquefaciens có ích Cả chủng vi khuẩn này đều có khả khử nitrat, đồng hóa cả loại các bon: đường Glucose, Sacarose, tinh bột tan và rượu Mannitol Chủng vi khuẩn (B14.1) có khả phát triển tốt nồng độ NaCl cao 4% Chủng vi khuẩn B2.2 thể hiên hoạt tính loại enzyme Cellulase, Chitinase, βGlucanase cao (3,1; 3,3 và 3,4 cm sau ngày) Kiế n nghi ̣ - Tiếp tục nghiên cứu các vi sinh vật có ích có khả đối kháng với nấm bệnh để sử dụng cho sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh ngoài đồng ruộng có hiệu quả, góp phần hạn chế sự sinh trưởng phát triển của nấm gây bệnh, làm tăng suất trồng và an toàn cho môi trường 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (1999), Đầu tư dự án phát triển giống ca cao (giai đoạn 1999 - 2000), Số 5685 QĐ/BNN - XDCB, ngày 30/12/1999 Nguyễn Minh Châu (2009), ―Sử dụng nấm Trichoderma để phòng trừ sâu bệnh cho vườn ăn quả‖, Báo cáo Viện ăn Miền Nam năm 2009, tr.2 Hồng Châu (2009), Ứng dụng chế phẩm Trichoderma, Kết quả nghiên cứu khoa học năm 2009 Đại học Cần Thơ, tr - Phạm Ngọc Dung, Ngô Vĩnh Viễn, Nguyễn Văn Tuất, Nguyễn Thị Ly, Trần Ngọc Khánh, Hồ Gấm, Nguyễn Quang Tuấn (2008), ―Một số kết quả phòng trừ bệnh chết nhanh gây hại hồ tiêu tại Đăk Nơng‖, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 3, tr 17-23 Phạm Ngọc Dung, Hà Viết Cường, Nguyễn Văn Tuất (2009), ―Phân tích chuỗi Internal Transcribed Spacer (ITS) của nấm Phytophthora tropical gây bệnh chết nhanh hồ tiêu tại Việt Nam‖, Tạp chí Nơng nghiệp và phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 4, tr 17–21 Phạm Ngọc Dung, Hà Viết Cường, Lê Đình Thao, Hà Giang, Trần Thị Như Hoa, Nguyễn Hồng Tuyên, Nguyễn Thúy Hạnh (2012), ―Nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum phòng trừ nấm Phytophthora spp gây bệnh cao su‖, Tạp chí bảo vệ thực vật, Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nông thôn, số 12, tr 10-12 Trần Kim Loang, Vũ Văn Tố, Hà Thị Mão (2001), Điều tra xác định thành phần sâu bệnh hại ca cao tỉnh Đăk Lăk, Kết quả nghiên cứu khoa học năm 2000 – 2001, Buôn Ma Thuột, tr 144 - 155 Trần Kim Loang, Đào Thị Lan Hoa, Lê Đăng Khoa, Hà Thị Mão, Lê Đình Đơn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh (2006), ―Nghiên cứu bệnh nấm Phytophthora số công nghiệp và ăn quả‖, Báo cáo trọng điểm cấp Bộ 2001 - 2005, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 82 Trần Kim Loang, Lê Đình Đơn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, Nguyễn Thị Tiến Sĩ, Trần Thị Xê (2008), ―Phòng trừ bệnh nấm Phytophthora hồ tiêu chế phẩm sinh học Trichoderma (Tricho-VTN) tại Tây Nguyên‖, Kết nghiên cứu khoa học năm 2008, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tr 307-315 10 Phạm Hồng Đức Phước (2003), Kỹ thuật trồng ca cao Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, tr 50-58 11 Trần Thị Thuần, Nguyễn Thị Ly, Phạm Ngọc Dung (2004), ―Nghiên cứu và sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nhóm nấm tồn tại đất gây hại trồng‖, Tạp chí bảo vệ thực vật, số 4, tr 15-17 12 Nguyễn Cơng Tḥt (1996), Phịng trừ tổng hợp sâu bệnh hại trồng, nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr 102 13 Nguyễn Văn Tuất và Lê Văn Thuyết (2001), Sản xuất chế biến và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học, Nxb Nông nghiệp, tr.56 14 Nguyễn Văn Uyển (1999), Hướng dẫn kỹ thuật trồng ca cao, Nxb Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, tr.110 15 Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tài Sum (1996), Cây ca cao giới và triển vọng Việt Nam, Nxb Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, tr.183 16 Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Thị Tú, Bùi Văn Công (2012), ―Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma viride phòng trừ số bệnh nấm hại vùng rễ khoai tây, lạc, đậu tương‖, Tạp chí Khoa học và phát triển, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tập 10, số 1, tr 95-102 17 Ngô Vĩnh Viễn, Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Thị Ly, Lê Thu Hiền (2007), ―Phương pháp phân lập nấm Phytophthora từ đất, rễ và phận bị bệnh‖, Tuyển tập kết Khoa học và Công nghệ nông nghiệp 2006 - 2007, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tr.236-240 83 TIẾNG ANH 18 Aravind, R., Kumar, A., Eapen, S.J., Ramana, K.V (2009), Endophytic bacterial flora in root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype: isolation, identification and evaluation against Phytophthora capsici, Indian Institute of Spices Research, Calicut, Kerala, India, http://www.ncbi.nlm.gov/pubmed, pp 3-5 19 Aryantha, I.P., Cross, R ADN Guest, D.I (2000), ―Suppression of Phytophthora cinnamomi in potting mixes amended with uncomposted and composted animal manures‖, Phytopathology, 90, pp 775–782 20 Baker, K F., and Cook, R J (1974), Biological Control of Plant Pathogens W H Freeman & Company, San Francisco, pp 200-205 21 Bekele F., End M J and Eskes A B.(2003), Proceeding of the international workshop on cocoa Breeding for improved production systems, pp 192-198 22 Blair J.E., Coffey, M.D., Park, S-Y., Geiser, D.M and Kang, S (2008), ―A multilocus phylogeny for Phytophthora utilizing markers derived from complete pathogen genomes‖, Fungal Genetics and Biology, 45, pp 266-277 23 Broadley, R.H (1992), Protect your avocados and cocoa, Brisbane, Australia, Queensland Department of Primary Industries 24 Burgess, L.W., Knight, T.E., Tesoriero, L and Phan Thuy Hien (2008), Diagnostic manual for plant diseases in Viet Nam, Australian Centre for International Agricultural Research, pp 198-210 25 Chambers, S.M., and Scott, E.S (1995), ―Invitro antagonism of Phytophthora cinnamomi and Phytophthora citricola by isolates of Trichoderma spp And Gliocladium virens‖, Journal of Phytopathology, 143, pp 471 - 477 26 Cohen,Y and Coffey, M.D.(1986), ―Systemic fungicides and the control of Oomycetes‖, Annual Review of Phytopathology, 24, pp 311 - 338 27 Cook, R J., and Baker, K F (1983), ―The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens‖, American Phytopathological Society, St Paul, MN, pp 445-460 28 Cooke D E L and Duncan J M (1977), ―Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on the ITS1 and ITS2 sequences of ribosomal DNA‖, Mycological Research, 101, pp 667-677 84 29 Diby, P., Saju, K.A., Jisha, P.J., Sarma, Y.R., Kumar, A and Anandajai, M (2003), ―Mycolytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens and Trichoderma spp against Phytophthora capsici, the foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum Linn.)‖, Soil Biology and Biochemistry, pp 196-212 30 Drenth, A and Guest, D.I (2004), Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra, pp 135-142 31 Drenth, A and Sendall, B (2004), ―Isolation of Phytophthora from infected Plant tisue and soil, and Principles of Species Identification‖, Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra, pp 94–102 32 Duncan, J., and Cooke, D (2002), Identifying, diagnosing and detecting Phytophthora by molecular methods, Mycologist, Vol.16, Part 2, pp 59-66 33 El-Tarabily, K.A., Sykes, M.L, Kurtboke, I.D., Hardy, G.E.S., Barbosa, A.M and Dekker, R.F.H (1996), ―Synergystic effects of a cellulose–producing micromonospora and an antibiotic-producing Streptomyces violascens on the suppression of Phytophthora cinnamomi root rot of Banksia grandis‖, Canadian Journal of Botany, 74, pp 618–624 34 Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996), ―Phytophthora diseases worldwide‖, St Paul, Minnessota, USA, American Phytopathological Society Press, p 562 35 Freeman, G.H (1994), Present nursery and establishment methods for cocoa in Western Nigeria, Ann Rep W Afr Cocoa Res Inst (Nigeria), pp 13-14 36 Fulton, R.H (1989), ―The cocoa disease trilogy: black pod, Monilia pod rot and witch broom‖, Plant disease, 73, pp 601–603 37 Galindo, J.J (1992), ―Prospects for biological control of cacao‖, In: Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and Australasia, Rome, FAO Plant Production and Protection, p 112 38 George, S.W and Milholland, R.D (1986), ―Growth of Phytophthora fragariae on various clarified natural media and selected antibiotic‖, Plant disease, 70, pp 1100–1104 85 39 Ivors, K.L., Hayden, K.J., Bonants, P.J.M., Rizzo, D.M., Garbelotto, M (2004), ―AFLP and phylogenetic analyses of North American and European populations of Phytophthora ramorum‖, Mycological Research, 108, pp 78–392 40 Jackson, G.V.H and Newhook, F.J (1978), ―Sources of Phytophthora palmivora inoculum in Solomon Island cocoa plantations‖, Trans.Br.Mycol.Soc, 71, pp 239 - 249 41 Heller, W.E and Theilerhedtrich, R (1994), ―Antagonism of Chaetomium globosum, Gliocladium virens and Trichoderma viride to four soil-borne Phytophthora species‖, Journal of Phytopathology 141, p 390–394 42 Jollès và Muzzarelli (1999), Chitin and chitinases, Basel, Boston, Berlin, Birkhauser Switzerland, pp.38 - 68 43 Keane, P.J (1992), Disease of pest and cocoa: an overview In: Keane, P.J and Putter, C.A., ed., Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and Australasia, Rome, Italya, Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO Plant Production and Protection Paper No.112 44 Konam, J.K and Guest, D.I (2004), ―Role of Flying beetles (Coleoptera: Scolytidae and Nitidulae) Phytophthora pod rot of cocoa in Papua New Guinea‖, Australia Plant Pathology, in press, 40, pp 30-34 45 Kong, P., Hong, C.X., Tooley, P.W., Ivors, K., Garbelotto, M and Richardson, P.A (2004), ―Rapid identification of Phytophthora ramorum using PCRSSCP analysis of ribosomal and ITS-1‖, The Society for Applied Microbiology, USA, 38, pp 433-439 46 Larkin, R.P., Ristaino, J.B and Campbell, C.L (1995), ―Detection and quantification of Phytophthora capsici in soil‖, Phytopathology, 85, pp 1057–1063 47 Lee, B.S and Lum, K.Y (2004), Phytophthora Diseases in Malaysia, Malaysian Agricultural Research and Development Institute, GPO Box 12301, 50774 Kuala Lumpur, Malaysia 48 Masago, H., Yoshikawa, M., Fukada, M., and Nakanishi, N (1977), ―Selective inhibition of Pythium spp On a medium for direct isolation of Phytophthora spp from soil and plants‖, Phytopathology, 67, pp 425–428 86 49 McMahon, P ADN Purwantara, A (2004), Phytophthora on Cocoa In: “Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia”, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra, pp 104–113 50 Medeiros, A.G (1976), Sporulation of Phytophthora palmivora (Butl.) Butl In relation to epidemiology and chemical control of black pod disease, PhD thesis, University of California, Riverside, California, USA Cited in Pereira (1992) 51 Papavizas, G.C and Bower, J.H (1981), ―Comparative fungitoxicity of captafol and metalaxyl to Phytophthora capsici‖, Phytopathology, 71, pp 123 - 128 52 Purwantara, A (1987), Penyebab penyakit Phytophthora pada tanaman kakao di Jawa In: Proceedings of the Indonesia Plant Pathology Society Conference 1987, Surabaya, pp 283 - 290 53 Purwantara, A (2003), Eoidemiology and control of Phytophthora diseases of cocoa in Java, Indonesia, Paper presented at International Congress of Plant Pathology, at Christchurch, New Zealand, pp 280-281 54 Tan, K.S.R (2000), Effect of fertilizer on the susceptibility of durian and papaya towards Phytophthora palmivora, BSc (Honours) thesis, School of Botany, The University of Melbour, Australia, pp 25-27 55 Tran, H., Ficke, A., Asiimwe, T., Hofte, M and Raaijmakers, J.M (2007), ―Role of cyclic lopopeptide massetolide A in biological control of Phytophthora infestans and in colonization of tomato plants by Pseudomonas fluoresens‖, New Phytopathology, 175, pp 731-742 56 You, M.P., Sivasithampara, K and Kurboke, D.J (1996), ―Actinomycetes in organic mulch used in avocado plantation and their ability to suppress Phytophthora cinnamomi‖, Journal of Spice and medicinal Crops, 3, pp 51– 53 57 Weller, D.M (2007), ―Pseudomonas biocontrol agents of soilborne pathogens: looking back over 30 years‖, Phytopathology, 97, pp 250-256 58 Wen-Chuan Chung, Rey-Shung Wu, Chia-Ping Hsu, Hung-Chang Huang and Jenn-Wen Huang (2011), ―Application of antagonistic rhizobacteria for control of Fusarium seedling blight and basal rot of lily‖, Australasian Plant Pathology, Vol 40, 3, pp 269-276 87