Định lượng acid chlorogenic trong dược liệu ké đầu ngựa (fructus xanthii strumarii) thu hái tại việt nam bằng phương pháp HPLC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA (Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA (Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Khoá luận thực hồn thành Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu với hướng dẫn TS Nguyễn Thị Phương TS Nguyễn Thị Thanh Bình Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phương (Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) TS Nguyễn Thị Thanh Bình (Bộ mơn Hóa dược kiểm nghiệm, Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội) người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, ln bảo, góp ý, đưa ý kiến q báu động viên em hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dược liệu, PGS.TS Phương Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) anh chị, cán nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy Khoa Y – Dược, người thầy tận tâm dạy dỗ, trang bị cho em kiến thức quý giá năm tháng theo học trường Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên, ủng hộ giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Sau cùng, em xin kính chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc sống Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Hương Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÝ HIỆU Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà Hóa phân tích CGA Acid chlorogenic Axit clorogenic High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC HPLCDAD HPLC-UV MeOH MEX MEXL Chromatography High performance Liquid Chromatography-Diod array detector Sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò mảng diod High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography-Ultraviolet ghép nối đầu dò tử ngoại Methanol Methanol Methanol extracts of fruits Chiết xuất methanol of Xanthium strumarium Xanthium strumarium Methanol extracts of leaves Chiết xuất methanol Xanthium strumarium of Xanthium strumarium of Xanthium strumarium Chiết xuất methanol phần thân Xanthium strumarium RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối RP-HPLC- Reversed phase High performance Liquid Chromatography-Diod array detector Sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo ghép nối đầu dò mảng diod MEXS DAD Methanol extracts of stems TLTK Tài liệu tham khảo tt/tt Thể tích/Thể tích DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh Ké đầu ngựa Xanthium strumarium L Hình 1.2 Hợp chất axit caffeic (22) xanthiumnolic A (23) Hình 1.3 Các hợp chất coumarin phân lập từ Xanthium strumarium L Hình 1.4 Các hợp chất liganolid phân lập từ Xanthium strumarium L .8 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học acid chlorogenic .15 Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Ké đầu ngựa lưu trữ Viện Dược liệu 20 Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa 27 Hình 3.2 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc phương pháp 28 Hình 3.3 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ CGA diện tích pic 30 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc hợp chất sesquiterpenoid phân lập từ Xanthium strumarium L .4 Bảng 1.2 Cấu trúc dẫn xuất axit caffeoylquinic phân lập từ Xanthium strumarium L Bảng 1.3 Cấu trúc hợp chất steroid glycosid phân lập từ Xanthium strumarium L Bảng 1.4 Một số phương pháp xác định acid chlorogenic 17 Bảng 2.1 Danh sách mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu thập .20 Bảng 3.1 Các thông số đánh giá acid chlorogenic 27 Bảng 3.2 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống 29 Bảng 3.3 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic CGA 29 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ lặp lại .31 Bảng 3.5 Kết đánh giá độ phương pháp 32 Bảng 3.6 Hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái Việt Nam 32 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố .2 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Một số tác dụng dược lý Ké đầu ngựa 11 1.2 Tổng quan acid chlorogenic 15 1.2.1 Cơng thức hóa học 15 1.2.2 Tính chất vật lý 15 1.2.3 Tác dụng dược lý .15 1.2.4 Một số phương pháp xác định acid chlorogenic .16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu .20 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị .21 2.2.1 Chất chuẩn 21 2.2.2 Hóa chất .21 2.2.3 Thiết bị .21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch thử 21 2.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 22 2.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng acid cholorogenic Ké đầu ngựa 22 2.3.4 Áp dụng số mẫu dược liệu Ké đầu ngựa .25 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 26 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích quy trình xử lý mẫu 26 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 28 3.2.1 Tính chọn lọc phương pháp 28 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống .28 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn 29 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 30 3.2.5 Độ lặp lại 30 3.2.6 Độ 31 3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Ké đầu ngựa 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 34 4.1 Về thu thập mẫu dược liệu .34 4.2 Về xây dựng phương pháp định lượng 34 4.3 Về thẩm định phương pháp định lượng 35 4.4 Về kết áp dụng phương pháp HPLC định lượng acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa thu hái Việt Nam 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với tiến cách mạng khoa học – kỹ thuật, người dần có xu hướng “trở với thiên nhiên”, Y học cổ truyền ngày quan tâm, nghiên cứu phát triển Trong đó, việc tập trung tìm kiếm, phân lập hoạt chất chữa bệnh từ loài dược liệu tự nhiên mang lại giá trị to lớn có ý nghĩa vơ thiết thực cho cơng chăm sóc sức khỏe người Ké đầu ngựa có tên khoa học Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae, vị thuốc quý sử dụng rộng rãi Y học truyền thống Việt Nam Trung Quốc với nhiều công dụng tiêu độc, sát trùng, tán phong, trừ thấp Ké đầu ngựa thường dùng để chữa phong hàn đau đầu, tay chân đau co rút, phong tê thấp, đau khớp, bướu cổ, mày đay, lở ngứa, mụn nhọt [3] Bên cạnh đó, cịn loại dược liệu có nhiều tác dụng dược lý quan trọng ức chế khối u, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa chống đái tháo đường Trong Ké đầu ngựa có chứa nhóm chất mang hoạt tính sinh học, phải kể đến acid chlorogenic – hợp chất hóa học thuộc nhóm axit phenolic, có cơng dụng chống oxy hóa, chống đột biến gen, ngăn chặn phát triển tế bào ung thư, chống vi rút kháng khuẩn Acid chlorogenic hoạt chất yêu cầu định lượng nhiều loài dược liệu Kim ngân hoa theo Dược điển Trung Quốc 2015 [51]; chuyên luận Dược điển Mỹ 38 [54] Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam V chưa đề cập tới định lượng acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa, có cơng trình nghiên cứu định lượng acid chlorogenic dược liệu phương pháp HPLC Việt Nam [2] Từ thực tiễn trên, để góp phần xây dựng phương pháp kiểm nghiệm dược liệu xác, đơn giản ứng dụng rộng rãi, tiến hành đề tài “Định lượng acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) thu hái Việt Nam phương pháp HPLC” với mục tiêu: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic - dược liệu Ké đầu ngựa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Ứng dụng phương pháp HPLC xây dựng để định lượng acid chlorogenic số mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái vùng khác Việt Nam CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) 1.1.1 Vị trí phân loại Ké đầu ngựa có tên khoa học Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae, hay gọi Thương nhĩ (tên Trung Quốc), Phát ma (tên Thổ) Ở Trung Quốc, gọi ké Thương nhĩ tử (Fructus Xanthii strumarii) [4] Vị trí phân loại Xanthium strumarium L.: Giới: Thực vật (Plants) Ngành: Ngọc lan (Magnoliaphyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ: Cúc (Asterales) Họ: Cúc (Asteraceae) Chi: Xanthium L Loài: Xanthium strumarium L [65] 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố Cây thảo, sống hàng năm, cao khoảng 50 - 80 cm, phân cành Thân hình trụ, cứng, có khía, màu lục, đơi có điểm chấm màu nâu tím, có lơng cứng Lá mọc so le, dài - 10 cm, rộng - 12 cm, chia làm - thùy, mép khía khơng đều, có lơng ngắn cứng hai mặt, gân 3, cuống dài 10 cm, có lơng cứng [3] Cụm hoa mọc đầu cành hoặc kẽ lá, màu lục nhạt, gồm hai loại đầu, gốc, đầu nhỏ mang hoa lưỡng tính, đầu khác mang hoa Lá bắc xếp thành hai hàng, có lơng Hoa lưỡng tính hình ống, khơng có mào lơng, tràng có thùy, nhị 5, hoa khơng có tràng mào lơng Quả bế đơi, hình trứng, có hai sừng nhọn đầu phủ dày gai móc, dài 12 - 15 mm, rộng mm [3] Chi Xanthium L có lồi Ké đầu ngựa Việt Nam Cây có nguồn gốc châu Mỹ, sau lan khắp vùng cận nhiệt đới nhiệt đới châu Á, châu Phi châu Âu Ở Việt Nam, Ké đầu ngựa có hầu hết tỉnh miền núi, trung du đồng bằng, tỉnh phía Bắc, từ Nghệ An trở [3] Bảng 3.2 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) 10,22 3565529 10,33 3583510 10,27 3567425 10,27 3567644 10,21 3623564 10,24 3488457 Trung bình 10,26 3566022 RSD(%) 0,42 1,23 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD diện tích pic thời gian lưu nhỏ 2%, từ kết luận điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống HPLC sử dụng phù hợp đảm bảo độ ổn định phép phân tích định lượng CGA dược liệu Ké đầu ngựa 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị dãy gồm dung dịch CGA chuẩn có nồng độ tăng dần từ 20 µg/ml đến 160 µg/ml tiến hành phân tích HPLC với điều kiện trình bày mục 2.3.3.2 Kết khảo sát tương quan diện tích pic nồng độ CGA trình bày bảng 3.3 Phương trình đường chuẩn thu hình 3.3 Bảng 3.3 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic CGA Diện tích pic (mAU.s) 6,5 2060900 13 3565529 39 8000950 65 12409380 91 17000180 117 21760950 130 24090910 Phương trình đường chuẩn (trong khoảng từ 20 µg/ml đến 160 µg/ml) Hệ số tương quan Nồng độ (µg/ml) Nồng độ tính lại từ đường chuẩn (µg/ml) 6,325 14,789 39,738 64,536 90,360 117,139 130,246 Độ chệch (%) Y = 176579.X + 106 R2 = 0,9998 29 -2,69 13,76 1,89 -0,71 -0,70 0,12 0,19 30000000 y = 176579x + 1E+06 R² = 0.9998 S (mAU.s) 25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0 50 100 150 C (µg/ml) Hình 3.3 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ CGA diện tích pic Nhận xét: Đường chuẩn đánh giá thông qua hệ số tương quan R độ chệch nồng độ tìm lại từ đường chuẩn so với nồng độ thực Kết đánh giá đường chuẩn trình bày bảng 3.3 cho thấy độ chêch lệch (∆) nồng độ nằm giới hạn cho phép ( 0,1% (tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối), với độ lệch chuẩn tương đối RSD =1,96% < 3,7% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao 3.2.6 Độ Mẫu thêm chuẩn: Cân xác khoảng 0,5 gam bột dược liệu Ké đầu ngựa thêm lượng CGA chuẩn, trình thêm chuẩn tiến chuẩn bị mức: 1,085 mg (ứng với mức thêm chuẩn 50%) 2,17 mg (ứng với mức thêm chuẩn 100%), chuẩn bị cách pha cân thêm trực tiếp lượng chất chuẩn vào mẫu thử Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình trình bày Mẫu khơng thêm chuẩn: Cân xác khoảng 0,5 gam bột dược liệu tiến hành xử lý mẫu theo quy trình trình bày Định lượng CGA mẫu thêm chuẩn mẫu không thêm chuẩn HPLC, mức thêm chuẩn làm lặp lại lần lấy kết trung bình Kết trình bày bảng 3.5 31 Bảng 3.5 Kết đánh giá độ phương pháp Mức thêm chuẩn 50% 100% Mdược liệu (g) 0,5021 0,5046 0,4953 0,5032 0,5001 Nồng độ thêm chuẩn tìm lại (mg/ml) Độ thu hồi (%) 0,161 0,160 0,163 0,215 0,053 0,052 0,055 0,107 98,15 96,30 101,85 98,62 0,217 0,109 100,46 0,214 0,106 97,70 Nồng Nồng độ độ mẫu Nồng thêm thêm độ thực chuẩn (mg/ml) chuẩn (mg/ml) (mg/ml) 0,1085 0,054 0,1085 0,1085 0,5056 Trung bình (%) 98,76 98,93 Nhận xét: Độ thu hồi trung bình phương pháp định lượng CGA dược liệu Ké đầu ngựa HPLC mức thêm chuẩn 50% 98,76%, mức thêm chuẩn 100% 98,93%, đạt khoảng 95,0 – 105,0%, chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ cao 3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Ké đầu ngựa Áp dụng phương pháp định lượng xây dựng thẩm định, tiến xác định hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái số tỉnh Việt Nam Mỗi mẫu tiến hành lặp lại lần độc lập Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái Việt Nam STT 10 Ký hiệu mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 Nguồn gốc mẫu Ngày lấy mẫu Hàm lượng CGA (%) Hà Nội Sóc Trăng Cà Mau Hồ Chí Minh Hịa Bình U Minh Kiên Giang An Giang Thanh Hóa Hà Giang 17/11/2019 25/11/2019 16/12/2019 23/12/2020 05/01/2020 16/01/2020 27/01/2020 08/02/2020 11/02/2020 15/02/2020 0,360 0,144 0,230 0,249 0,375 0,217 0,057 0,174 0,077 0,079 32 Nhận xét: Kết thu cho thấy hàm lượng CGA dược liệu Ké đầu ngựa thu hái Việt Nam nằm khoảng từ 0,057 – 0,375% Trong đó, mẫu Ké đầu ngựa thu hái Hịa Bình cho hàm lượng CGA cao (0,375%), mẫu Ké đầu ngựa thu hái Kiên Giang cho hàm lượng CGA thấp (0,057%) 33 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về thu thập mẫu dược liệu Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) loại thảo dược có vị ngọt, tính ơn, có độc, quy vào kinh phế Tại Việt Nam, vị thuốc dùng để chữa bướu cổ, mụn nhọt, ung thư phát bối (đằng sau lưng), đau răng, đau họng, viêm mũi [4] Dược lý đại có nhiều nghiên cứu tác dụng chống khối u, chống viêm mũi dị ứng, chống viêm, giảm đau, kháng khuẩn Ké đầu ngựa đưa kết có triển vọng, góp phần chăm sóc sức khỏe người Theo tài liệu cơng bố, Ké đầu ngựa tìm thấy hầu hết tỉnh miền núi, trung du đồng bằng, tỉnh phía Bắc, từ Nghệ An trở [3] Trong trình thực đề tài, mẫu dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) thu hái 10 vùng, bao gồm: Hà Nội, Hịa Bình, Hà Giang, Thanh Hóa, Hồ Chí Minh, An Giang, Sóc Trăng, Kiên Giang, U Minh, Cà Mau Việc lấy mẫu phù hợp với đặc điểm phân bố Ké đầu ngựa, thu thập mẫu từ Bắc vào Nam, tập trung tỉnh phía Bắc Do điều kiện có hạn thời gian nên mẫu dược liệu Ké đầu ngựa địa phương khác chưa thu thập, nhiên, 10 mẫu nghiên cứu đề tài góp phần vào việc đánh giá hàm lượng CGA có dược liệu Ké đầu ngựa phân bố Việt Nam 4.2 Về xây dựng phương pháp định lượng Acid chlorogenic hợp chất mang hoạt tính sinh học nhà khoa học quan tâm tiến hành nghiên cứu tác dụng rộng rãi qua nhiều cơng trình Đây hoạt chất có tác dụng chống viêm, giảm đau, ức chế khối u, chống oxy hóa có tiềm ứng dụng phát triển thuốc Tại nước giới, việc định lượng CGA mẫu dược liệu, cao dược liệu đề cập đến chuyên luận Dược điển Trung Quốc 2015; Dược điển Mỹ 38, Dược điển châu Âu 8.0 Tại Việt Nam, có nhiều cơng trình định lượng CGA số loài dược liệu Kim ngân Hoa, Ngũ gia bì chân chim, cao Actiso Tuy nhiên, chưa có chuyên luận định lượng CGA dược liệu Ké đầu ngựa công bố Dược điển Việt Nam V Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng CGA dược liệu Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) cần thiết để nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu 34 Trong đề tài này, tiến hành xây dựng phương pháp định lượng CGA dược liệu Ké đầu ngựa điều kiện phịng thí nghiệm Phương pháp HPLC phương pháp sử dụng phổ biến phân tích, kiểm nghiệm thuốc, dược liệu với nhiều ưu điểm như: Vừa có khả định tính, định lượng, vừa tốn mẫu mà kết lại có độ xác chọn lọc cao Quy trình xử lý mẫu tương đối đơn giản, không cần trải qua nhiều giai đoạn phức tạp, không gây thất mẫu có thời gian xử lý mẫu ngắn, phù hợp với công tác đảm bảo chất lượng dược liệu, tránh tình trạng sai số kết nhiều Loại cột sắc ký sử dụng nghiên cứu cột Silica gel pha đảo C18 (250 mm x 4,6 mm, µm) Đây loại pha tĩnh sử dụng rộng rãi quy trình định lượng, điều kiện phân tích sắc dễ dàng áp dụng Hệ dung môi pha động hỗn hợp nước chứa 0,1% acid phosphoric : ACN xây dựng với tỷ lệ 20 : 80 tt/tt, đảm bảo khả tách CGA khỏi mẫu thu pic có tính đối xứng Điều kiện sắc ký áp dụng để định lượng CGA số mẫu dược liệu khác 4.3 Về thẩm định phương pháp định lượng Kết thẩm định theo hướng dẫn AOAC mẫu dược liệu Ké đầu ngựa cho thấy quy trình có tính đặc hiệu cao, đảm bảo độ ổn định phép phân tích, khoảng tuyến tính, đường chuẩn xây dựng cho thấy có tương quan chặt chẽ nồng độ CGA diện tích pic tương ứng với hệ số tương quan xấp xỉ Phương pháp có độ nhạy tốt với giới hạn định lượng 0,41 µg/ml, độ lặp lại độ cao 4.4 Về kết áp dụng phương pháp HPLC định lượng acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa thu hái Việt Nam Nghiên cứu tập trung vào phân tích đánh giá hàm lượng CGA mẫu dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) Tuy nhiên, Ké đầu ngựa Việt Nam trồng nhiều vùng khác nhau, thời điểm thu hái khác nên hàm lượng CGA có chênh lệch rõ rệt vùng, khó tiêu chuẩn hóa dược liệu Trong nghiên cứu này, tơi tiến hành định lượng CGA 10 mẫu dược liệu Ké đầu ngựa, thu hái 10 tỉnh thành khác Việt Nam theo phương pháp HPLC xây dựng thẩm định Kết cho thấy hàm lượng CGA mẫu nghiên cứu có khác nhiều, cụ thể: Mẫu Ké đầu ngựa thu hái Hịa Bình 35 cho hàm lượng CGA cao (0,375%); Mẫu Ké đầu ngựa thu hái Kiên Giang cho hàm lượng CGA thấp (0,057%) Hàm lượng CGA có mẫu nghiên cứu trung 0,196% Theo Dược điển Trung Quốc 2015, hàm lượng tiêu chuẩn CGA định lượng Fructus Xanthii không nhỏ 0,25% [51] Như vậy, thấy hàm lượng trung bình CGA dược liệu Ké đầu ngựa thu hái Việt Nam có giá trị thấp tiêu chuẩn sở Trung Quốc, cần tiến hành nghiên cứu tiêu chuẩn hóa thêm để thu kết xác 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT A Kết luận Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu đạt đề tài, rút kết luận mục tiêu đặt hoàn thành, cụ thể sau: Đã xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa phương pháp HPLC - Đã khảo sát điều kiện sắc ký với điều kiện sau: + Pha tĩnh: Cột Silica gel pha đảo (C18) (250 mm x 4,6 mm, µm) + Pha động: Nước chứa 0,1% acid phosphoric : ACN (tỷ lệ 20 : 80 tt/tt) + Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: µl + Nhiệt độ cột: 25oC + Detector UV quan sát tại: 327 nm Dung dịch thử: Cân xác 0,5 g bột dược liệu Ké đầu ngựa rây qua rây số cho vào bình nón, thêm xác 20 ml dung dịch acid formic 5% MeOH 50%, cân khối lượng Sau siêu âm 40 phút, để nguội, cân lại, bổ sung khối lượng giảm dung dịch acid formic 5% MeOH 50% Lắc đều, lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu dung dịch sắc ký Dung dịch chuẩn acid chlorogenic: Cân xác khoảng 5,0 mg CGA vào bình định mức ml Thêm ml dung dịch MeOH 50%, siêu âm cho tan hết Định mức đến vạch mức methanol 50%, thu dung dịch chuẩn có nồng độ xác khoảng mg/ml Tiến hành pha loãng thu dung dịch chuẩn CGA trung gian có nồng độ thích hợp - Thẩm định phương pháp định lượng theo tiêu chí AOAC đạt yêu cầu tiêu chí sau: + Tính chọn lọc phương pháp: Tính đặc hiệu cao + Tính thích hợp hệ thống: RSD < 2%, hệ thống HPLC phù hợp đảm bảo độ ổn định phép phân tích định lượng 37 + Khoảng tuyến tính đường chuẩn: Xây dựng đường chuẩn khoảng nồng độ từ 6,5 - 130 µg/ml 0,99 ≤ R2 = 0,9998 ≤ + Giới hạn phát 0,12 µg/ml giới hạn định lượng 0,41 µg/ml + Độ lặp lại: RSD (%) < 2%, độ lặp lại cao + Độ thu hồi: Độ thu hồi nằm khoảng 95,0 – 105,0%, độ cao Đã áp dụng phương pháp định lượng acid chlorogenic 10 mẫu Ké đầu ngựa thu hái vùng khác Việt Nam Kết cho thấy hàm lượng acid chlorogenic mẫu Ké đầu ngựa nằm khoảng 0,057 – 0,375% Trong đó, mẫu Ké đầu ngựa thu hái Hịa Bình cho hàm lượng acid chlorogenic cao (0,375%) B Đề xuất Áp dụng phương pháp xây dựng để tiến hành định lượng acid chlorogenic nhiều mẫu dược liệu Ké đầu ngựa vùng khác nhau, thu hái thời điểm khác nhằm tiêu chuẩn hóa dược liệu dược điển Việt Nam Tiếp tục khảo sát thử nghiệm điều kiện sắc ký khác để tối ưu hóa phương pháp định lượng acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Vũ Bình Dương "Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla) sắc ký lỏng hiệu cao", Tạp chí Dược học, 55(4), 46-50 Lê Thị Thu Hiền (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ Kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội Đỗ Bích Huy (2011), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, Tập Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Hà Ly, Trịnh Thị Nga, Phương Thiện Thương, Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Phương (2019), "Phát triển phương pháp phân tích định lượng đồng thời loganin acid chlorogenic Kim ngân cuộng HPLC-UV", Tạp chí Dược liệu, 24(2), 85-90 Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Thị Kiều Anh (2018), "Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic viên nang mềm Bổ gan sắc ký lỏng hiệu cao", Tạp chí Dược học, 58(4), 35-39 Tài liệu Tiếng Anh 10 11 12 13 14 Agata I, Goto S, Hatano T, Nishibe S, Okuda T (1993), "1, 3, 5-Tri-Ocaffeoylquinic acid from Xanthium strumarium", Phytochemistry, 33(2), 508-509 Chaowuttikul C, Palanuvej C, Ruangrungsi N (2020), "Quantification of chlorogenic acid, rosmarinic acid, and caffeic acid contents in selected Thai medicinal plants using RP-HPLC-DAD", Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 56 Cheng Z, Wang L, Chen B, Li F, Wang M (2011), "Chemical constituents from Fructus xanthii", Chin J Appl Environ Biol, 17, 350-352 Craig Jr JC, Mole ML, Billets S, El-Feraly F (1976), "Isolation and identification of the hypoglycemic agent, carboxyatractylate, from Xanthium strumarium", Phytochemistry Devkota A, Das RK (2015), "Antibacterial Activities of Xanthium Strumarium L.", Journal of Natural History Museum, 29, 70-77 Ferrer JP, Zampini IC, Cuello AS, Francisco M (2016), "Cytotoxic Compounds from Aerial Organs of Xanthium strumarium", Natural Product Communications, 11(3), 1934578X1601100313 Han T, Zhang H, Li HL, Zhang QY, Zheng HC, Qin LP (2008), "Composition of supercritical fluid extracts of some Xanthium species from China", Chemistry of Natural Compounds, 44(6), 814-816 Han T, Li HL, Hu Y, Zhang QY, Huang BK, Zheng HC (2006), "Phenolic acids in Fructus Xanthii and determination of contents of total phenolic acids 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 in different species and populations of Xanthium in China", Journal of Chinese Integrative Medicine, 4(2), 194-198 Hong Y, Han YQ, Xia LZ, Gui J (2013), "Simultaneous Determination of Nine Phenolic Acid Components in Xanthii Fructus", Chin Pharm J, 13, 1109-1112 Hossen MJ, Cho JY, Kim D (2016), "PDK1 in NF-κB signaling is a target of Xanthium strumarium methanolic extract-mediated anti-inflammatory activities", Journal of Ethnopharmacology, 190, 251-260 Hossen MJ, Kim MY, Cho JY (2016), "MAPK/AP-1-targeted antiinflammatory activities of Xanthium strumarium", The American Journal of Chinese Medicine, 44(06), 1111-1125 Hsu FL, Chen YC, Cheng JT (2000), "Caffeic acid as active principle from the fruit of Xanthium strumarium to lower plasma glucose in diabetic rats", Planta Medica, 66(03), 228-230 Huang MH, Wang BS, Chiu CS, Amagaya S (2011), "Antioxidant, antinociceptive, and anti-inflammatory activities of Xanthii Fructus extract", Journal of Ethnopharmacology, 135(2), 545-552 Hwang SH, Wang Z, Yoon HN, Lim SS (2016), "Xanthium strumarium as an inhibitor of α-glucosidase, protein tyrosine phosphatase 1β, protein glycation and ABTS+ for diabetic and its complication", Molecules, 21(9), 1241 Jiang H, Yang L, Liu C, Hou H, Wang Q (2013), "Four new glycosides from the fruit of Xanthium sibiricum Patr.", Molecules, 18(10), 12464-12473 Jiang H, Yang L, Liu C, Hou H, Wang Q (2013), "Four new glycosides from the fruit of Xanthium sibiricum Patr", Molecules, 18(10), 12464-12473 Jiang H, Yang L, Ma GX, Xing XD, Yan ML (2017), "New phenylpropanoid derivatives from the fruits of Xanthium sibiricum and their anti-inflammatory activity", Fitoterapia, 117, 11-15 Jiang H, Yang L, Xing XD, Yan ML, Guo XY (2018), "Study on lignans from Xanthii Fructus", China Journal of Chinese Materia Medica, 43(10), 2097-2103 Kamboj A, Atri P, Saluja AK (2014), "Phytochemical screening, in-vitro evaluation of antioxidant and free radical scavenging activity of leaves, stems and roots of Xanthium strumarium L.,(Compositae)", Journal of Pharmaceutical Research International, 1-22 Kan S, Chen G, Han C, Chen Z (2011), "Chemical constituents from the roots of Xanthium sibiricum", Natural Product Research, 25(13), 1243-1249 Kandhare AD, Kumar VS, Adil M, Rajmane AR, Ghosh P, Bodhankar SL (2012), "Investigation of gastro protective activity of Xanthium strumarium L by modulation of cellular and biochemical marker", Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 12(4), 287-299 Kaur M, Kamboj A, Rathour A, Saluja AK (2015), "Isolation and Characterization of Constituents from the Leaves of Xanthium strumarium and their Evaluation for Antioxidant and Antimicrobial Potential", Nat Prod Chem Res, 3(168), 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Kim DK, Shim CK, Bae DW, Kawk YS, Yang MS, Kim HK (2002), "Identification and biological characteristics of an antifungal compound extracted from Cocklebur (Xanthium Strumarium) against Phytophthora drechsleri", The Plant Pathology Journal, 18(5), 288-292 Kim IT, Park YM, Won JH, Jung HJ, Park HJ (2005), "Methanol extract of Xanthium strumarium L possesses anti-inflammatory and anti-nociceptive activities", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 28(1), 94-100 Kumar KS, Rajkapoor B (2010), "Evaluation of Anti-epileptic Activity of Xanthium strumarium L.", Pharmacologyonline, 2, 850-855 Li Q, Jia Y, Xu L, Wang X, Shen Z, Liu Y (2006), "Simultaneous Determination of Protocatechuic Acid, Syringin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Liriodendrin and Isofraxidin in Acanthopanax senticosus HARMS by HPLC-DAD", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29(3), 532-534 Liu R, Shi D, Zhang J, Li X, Han X, Yao X, Fang J (2018), "Xanthatin promotes apoptosis via inhibiting thioredoxin reductase and eliciting oxidative stress", Molecular Pharmaceutics, 15(8), 3285-3296 Mahmoud, Ahmed A (1998), "Xanthanolides and xanthane epoxide derivatives from Xanthium strumarium", Planta Medica, 64(08), 724-727 Malik MS, Sangwan NK, Dhindsa KS (1993), "Xanthanolides from Xanthium strumarium", Phytochemistry, 32(1), 206-207 McMillan C, Chavez PI, Mabry TJ (1975), "Sesquiterpene lactones of Xanthium strumarium in a Texas population and in experimental hybrids", Biochemical Systematics and Ecology, 3(3), 137-141 Naveed M, Hejazi V, Abbas M, Kamboh AA, Khan GJ (2018), "Chlorogenic acid (CGA): A pharmacological review and call for further research", Biomedicine & Pharmacotherapy, 97, 67-74 Ong KW, Hsu A, Tan BKH (2013), "Anti-diabetic and anti-lipidemic effects of chlorogenic acid are mediated by ampk activation", Biochemical Pharmacology, 85(9), 1341-1351 Pandey DP, Rather MA (2012), "Isolation and Identification of Phytochemicals from Xanthium strumarium", International Journal of Chem Tech Research, 4(1), 266-271 Panigrahi PN, Dey S, Sahoo M, Choudhary SS, Mahajan S (2016), "Alteration in Oxidative/nitrosative imbalance, histochemical expression of osteopontin and antiurolithiatic efficacy of Xanthium strumarium (L.) in ethylene glycol induced urolithiasis", Biomedicine & Pharmacotherapy, 84, 1524-1532 Parveen Z, Mazhar S, Siddique S, Manzoor A, Ali Z (2017), "Chemical composition and antifungal activity of essential oil from Xanthium strumarium L leaves", Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 79(2), 316-321 Peng W, Ming QL, Han P, Zhang QY, Jiang YP (2014), "Anti-allergic rhinitis effect of caffeoylxanthiazonoside isolated from fruits of Xanthium strumarium L in rodent animals", Phytomedicine, 21(6), 824-829 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Ramírez-Erosa I, Huang Y, Hickie RA, Sutherland RG, Barl B (2007), "Xanthatin and xanthinosin from the burs of Xanthium strumarium L as potential anticancer agents", Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 85(11), 1160-1172 Sato Y, Oketani H, Yamada T, Singyouchi KI, Ohtsubo T (1997), "A Xanthanolide with Potent Antibacterial Activity against Methicillin‐resistant Staphylococcus aureus", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 49(10), 1042-1044 Seaman, Frederick C (1982), "Sesquiterpene lactones as taxonomic characters in the Asteraceae", The Botanical Review, 48(2), 121-594 Shi YS, Liu YB, Ma SG, Li Y, Qu J (2015), "Bioactive sesquiterpenes and lignans from the fruits of Xanthium sibiricum", Journal of Natural Products, 78(7), 1526-1535 Tajik N, Tajik M, Mack I, Enck P (2017), "The potential effects of chlorogenic acid, the main phenolic components in coffee, on health: A comprehensive review of the literature", European Journal of Nutrition, 56(7), 2215-2244 Tao L, Fan F, Liu Y, Li W, Zhang L, Ruan J (2013), "Concerted suppression of STAT3 and GSK3β is involved in growth inhibition of non-small cell lung cancer by xanthatin", PLoS One, 8(11) Tao L, Sheng X, Zhang L, Li W, Wei Z (2016), "Xanthatin anti-tumor cytotoxicity is mediated via glycogen synthase kinase-3β and β-catenin", Biochemical Pharmacology, 115, 18-27 Tao L, Cao Y, Wei Z, Jia Q, Yu S (2017), "Xanthatin triggers Chk1mediated DNA damage response and destabilizes Cdc25C via lysosomal degradation in lung cancer cells", Toxicology and Applied Pharmacology, 337, 85-94 The State Pharmacopoeia Commission of P.R China (2015), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, China Medical Science Press270-271 Tousch D, Lajoix AD, Hosy E, Azay MJ, Ferrare K (2008), "Chicoric acid, a new compound able to enhance insulin release and glucose uptake", Biochemical and Biophysical Research Communications, 377(1), 131-135 Tsuchiya T, Suzuki O, Igarashi K (1996), "Protective effects of chlorogenic acid on paraquat-induced oxidative stress in rats", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 60(5), 765-768 United States Pharmacopeial Convention (2015), United States Pharmacopeia, United States Pharmacopeiale Vasas A, Hohmann J (2011), "Xanthane sesquiterpenoids: structure, synthesis and biological activity", Natural Product Reports, 28(4), 824-842 Watanabe T, Arai Y, Mitsui Y, Kusaura T, Okawa W, Kajihara Y, Saito I (2006), "The blood pressure-lowering effect and safety of chlorogenic acid from green coffee bean extract in essential hypertension", Clinical and Experimental Hypertension, 28(5), 439-449 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 Wang YH, Li TH, Wu BQ, Shi YF, Feng DY (2015), "Protective effects of caffeoylxanthiazonoside isolated from fruits of Xanthium strumarium on sepsis mice", Pharmaceutical Biology, 53(9), 1367-1371 Wen J, Kang L, Liu H, Xiao Y, Chen Y (2012), "A validated UV-HPLC method for determination of chlorogenic acid in Lepidogrammitis drymoglossoides (Baker) Ching, Polypodiaceae", Pharmacognosy Research, 4(3), 148 Winters TE, Geissman TA, Safir D (1969), "Sesquiterpene lactones of Xanthium species Xanthanol and isoxanthanol, and correlation of xanthinin with ivalbin", The Journal of Organic Chemistry, 34(1), 153-155 Woong AJ, No Z, Ryu SY, Zee OP, Kim SK (1995), "Isolation of Cytotoxic Compounds from the Leaves of Xantbium strumarium L", Natural Product Sciences, 1(1), 1-4 Yan GH, Jin GY, Li GS, Cui CA, Quan GH (2010), "The possible mechanism of inhibitory effect of Xanthium strumarium on mast cells activated by compound 48/80", Progress of Anatomical Sciences, 16, 164-66 Zhang LY, Cosma G, Gardner H, Vallyathan V, Castranova V (2003), "Effect of chlorogenic acid on hydroxyl radical", Molecular and Cellular Biochemistry, 247(1-2), 205-210 Zhao Y, Yang H, Zheng YB, Wong YO, Leung PC (2008), "The effects of Fructus Xanthii extract on cytokine release from human mast cell line (HMC-1) and peripheral blood mononuclear cells", Immunopharmacology and Immunotoxicology, 30(3), 543-552 https://gobotany.nativeplanttrust.org/species/xanthium/strumarium/ https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=XAST https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Chlorogenicacid#section=Spectral-Information ... ? ?Định lượng acid chlorogenic dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii strumarii) thu hái Việt Nam phương pháp HPLC? ?? với mục tiêu: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic - dược. .. HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA (Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN... dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Ké đầu ngựa Áp dụng phương pháp định lượng xây dựng thẩm định, tiến xác định hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Ké đầu ngựa