Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị ITS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DUỢC  BÙI THỊ YẾN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THUỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DUỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DUỢC - -Nguời thực hiện: Bùi Thị Yến NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THUỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DUỢC HỌC) Khóa Nguời huớng dẫn : QH2015.Y : PGS TS Đinh Đoàn Long ThS Phạm Thị Hồng Nhung Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ON Để hồn thành khóa luận này, dã may mắn nhận duợc nhiều giúp dỡ quý báu vật chất, tinh thần thầy cô, bạn bè Lời dầu tiên, xin bày tỏ kính trọng lịng biết on sâu sắc tới PGS TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Duợc – Đại học Quốc gia Hà Nội, nguời dã trực tiếp huớng dẫn tơi, dạy tận tình suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm on cô Đỗ Thị Lệ Hằng, bạn Đỗ Hạnh Nguyên dã giúp dỡ, hỗ trợ tơi thực hành thí nghiệm Các thầy cơ, bạn không trang bị cho kinh nghiệm kỹ nang chun mơn mà cịn truyền cho tơi tình u, lịng nhiệt huyết với nghiên cứu ln sẵn sàng giúp dỡ tơi gặp khó khan Tôi xin chân thành cảm on thầy cô giáo Bộ mơn Y Duợc học co sở dã hết lịng quan tâm, giúp dỡ tạo diều kiện tốt cho tơi thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi cung xin cảm on cán Viện duợc liệu - Bộ Y tế dã khơng quản ngại khó khan thu thập cung cấp mẫu vật giúp dỡ thực dề tài cách thuận lợi Tôi xin gửi lời cảm on tới Ban chủ nhiệm Khoa, toàn thể thầy cô giáo Khoa Y Duợc - Đại học Quốc gia Hà Nội dã cho kiến thức quý báu trình học tập nhà truờng Chúng tơi trân trọng cảm on tài trợ kinh phí Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam cho dề tài mã số NVQG-2018/02 PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì dể thực nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin duợc bày tỏ lịng biết on yêu thuong dến gia dình, nguời thân bạn bè, nguời dã bên cổ vu, dộng viên tạo diều kiện giúp dỡ thời gian học tập thực dề tài khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng 05 nam 2020 Tác giả Bùi Thị Yến DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp Cặp bazo (base pair) DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide 5’ Triphosphate Genbank Ngân hàng liệu gen quốc tế H.helix Hedera helix L (Thuờng xuân) H.nepalensis Hedera nepalensis K.Koch (Dây thuờng xuân) HPLC Sắc ký lỏng hiệu nang cao (High Performance Liquid Chromatography) ITS Vùng dệm duợc mã (Internal transcribed spacer) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) ML Maximum Likelihood NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) NJ Neighbor - Joining OD Mật dộ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribo Nucleic Acid UPGMA Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật duợc nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Nồng dộ OD260/280 DNA tổng số của mẫu nghiên cứu 27 Bảng 3.3 Các haplotype nghiên cứu 24 Bảng 3.2.Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân dòng doạn gen ITS 30 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền (phía duới bên trái) số luợng nucleotide sai khác (phía bên phải) 11 nhóm mẫu nghiên cứu H.nepalen sis (AJ131238.1), H.helix (AM503887.2), H sinensis (GU054623.1) Kalopanax septemlobus (MH711151.1) 31 Bảng 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh trình tự BioEdit 32 Bảng 3.6 Các trình tự tham chiếu Genbank 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 So dồ cấu trúc tổng quát vùng rDNA thực vật Hình 1.2 Dạng phát sinh loài biết rõ nguồn gốc 11 Hình 1.3 Cây Dây thuờng xuân H nepalensis 13 Hình 1.4 Phân bố dịa lý H nepalensis miền Bắc nuớc ta 14 Hình 2.1 So dồ thiết kế nghiên cứu 21 Hình 2.2 Hiển thị kết giải trình tự qua phần mềm BioEdit 23 Hình 3.1 Ảnh diện di DNA tổng số số mẫu gel agarose 1,2 % 24 Hình 3.2 Tối uu nhiệt dộ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.3 Tối uu nồng dộ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.4 Tối uu nồng dộ mồi phản ứng nhân dòng gen ITS 27 Hình 3.5 Kết PCR nhân dịng gen ITS số mẫu 28 Hình 3.6 Kết hiển thị giải trình tự mẫu H1 qua phần mềm BioEdit 28 Hình 3.7 Kết so sánh BLAST mẫu H4 H nepalensis (AJ131238) 46 29 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phuong pháp UPGMA dựa thị phân tử ITS 35 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phuong pháp NJ dựa thị phân tử ITS 36 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phuong pháp ML dựa thị phân tử ITS 36 Hình 4.1 Phân bố dịa lý haplotype Dây thuờng xuân tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Son i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHUONG TỔNG QUAN 1.1 Đa dạng phân loại sinh học 1.1.1 Khái niệm da dạng sinh học 1.1.2 Đa dạng di truyền 1.1.3 Thực trạng da dạng sinh học Việt Nam 1.1.4 Các phuong pháp phân loại học 1.2 Công cụ phân tích da dạng di truyền tiến hóa 1.2.1 Tổng quan thị DNA 1.2.2 Các kỹ thuật chị DNA 1.2.3 Vùng dệm duợc mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) 1.2.4 Các phuong pháp xây dựng phát sinh chủng loại 10 1.3 Tổng quan Dây thuờng xuân (Hedera nepalensis K Koch) 13 1.3.1 Phân loại học loài Hedera nepalensis K Koch 13 1.3.2 Đặc diểm hình thái phân bố dịa lý 14 1.3.3 Giá trị y học 14 CHUONG VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 20 2.1.3 Thiết bị 20 2.2 Phuong pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 21 2.2.2 Nhân dịng doạn gen dích kỹ thuật PCR 22 2.2.3 Giải trình tự 22 2.3.4 Xử lý số liệu phân tích kết 23 CHUONG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 ii 3.1 Tách chiết DNA tổng số 24 3.2 Kết nhân dòng doạn gen ITS phản ứng PCR 25 3.2.1 Kết phản ứng tối uu 25 3.2.2 Kết nhân dòng gen ITS từ mẫu thực vật 28 3.3 Giải trình tự 28 3.4 Độ tuong dồng trình tự gen ITS duợc khuếch dại 29 3.5 Cây phát sinh chủng loại dựa vùng gen ITS 30 3.5.1 Lựa chọn mơ hình 30 3.5.2 Khoảng cách di truyền 30 3.5.3 Xây dựng chủng loại 35 CHUONG BÀN LUẬN 37 4.1 Tách chiết DNA tổng số 37 4.2 Tối uu quy trình nhân dịng gen ITS phản ứng PCR giải trình tự 38 4.3 Khoảng cách di truyền 40 4.5 So sánh phuong pháp xây dựng phát sinh chủng loại 41 4.5.1 Phuong pháp UPGMA 41 4.5.2 Phuong pháp Neighbor- Joining 42 4.5.3 Phuong pháp Maximum LikeLihood 42 4.6 Dự doán bảo tồn chọn tạo giống 43 4.7 So sánh với phân tích hình thái học 44 4.8 Phân tích dịa lý mẫu nghiên cứu 45 CHUONG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 GU054623.1 Hedera sinensis C MH711151.1 Kalopanax septemlob T T A.C .T .A T .A.G 570 580 590 | | | | | | | N1 C T C G T G A C C C T G T T G T G C C G T T C T C AA C G C G C A C T C C G A N2 N3 .G N4 N5 N6 N7 N8 .G .T N9 G N10 N11 AJ131238.1 Hedera nepalensis AM503887.2 Hedera helix G GU054623.1 Hedera sinensis MH711151.1 Kalopanax septemlob C C .G ... QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DUỢC - -Nguời thực hiện: Bùi Thị Yến NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THUỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K. KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHĨA LUẬN TỐT... phải thị tốt dể dánh giá mức dộ da dạng di truyền nguồn gen Dây thuờng xn Việt Nam hay khơng? Để di tìm lời giải cho câu hỏi lựa chọn dề tài: ? ?Nghiên cứu da dạng di truyền nguồn gen Dây thuờng xuân. .. xuân (Hedera nepalensis K Koch) Việt Nam dựa thị ITS? ?? với hai mục tiêu: Xây dựng quy trình tối uu nhân dịng vùng gen ITS Dây thuờng xuân Định danh khoa học mẫu Dây thuờng xuân thu thập Việt Nam