SEQUENCING LY THUYET

GIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING TS BS Đỗ Thị Thanh Thủy GIẢI TRÌNH TỰ DNA Giải trình tự DNA thí nghiệm cho kết thứ tự xếp nucleotide đoạn DNA Vd: 5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTC CAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGG TCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCA GACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGA GGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACG CTTAATAGAACAANAAA3’ HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA Phương pháp hố học giải trình tự DNA Maxam & Guilbert (1977) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) Walter Gilbert Phương pháp enzyme giải trình tự Frederick Sanger (1977) Nobel hố học 1958 (cấu trúc protein: Insulin) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) 2.1 GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC Đánh dấu đầu đoạn DNA gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P) Xử lý đoạn DNA đánh dấu 32P hóa chất làm biến đổi đặc hiệu hai loại base nucleotide đoạn DNA 32P ATCG 32P ATCGCCAG 32P ATCGCCAGTTG 32P ATCGCCAGTTGTACCAG Sau xử lý piper Trình tự gen ban đầu 32P ATC 32P ATCGCCA 32P ATCGCCAGTT 32P ATCGCCAGTTGTACCA Tập hợp kết thu tất ống nghiệm, thu đoạn polynucleotid dài ngắn nucleotid, từ xác định trình tự DNA mạch khn Điện di mẫu DNA xử lý ống nghiệm hàng gel polyacrylamide biến tính Autoradiography 2.2 GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM Dựa nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, ống phản ứng có thêm ddNTP, nên men polymerase kéo nhầm ddNTP vào sợi bổ sung bị chặn lại kết có sợi bổ sung với độ dài khác dNTP ddNTP Mồi đánh dấu Bốn phản ứng polymer hoá xảy ống riêng biệt Tỉ lệ dNTP ddNTP = 100 : Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes Mỗi ddNTP có màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,… HIỆU QUẢ P/ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật hoàn chỉnh Chất lượng nồng độ DNA đích Mồi đặc hiệu với nồng độ thích hợp Sản phẩm PCR phải tinh Phải xác định hàm lượng mồi sản phẩm PCR tinh cho p/ứng chu kỳ giải trình tự Hệ thống giải trình tự Trugene Siemens Medical Solutions Diagnostics CEQ 8000 (Beckman Coulter) CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG ABI 3130 ABI 3130 XL Cappilaries 16 Cappilaries ABI 3730 PYROSEQUENCING Mostafa Ronaghi Pal Nyrén Royal Institute of Techology Stockholm 1990s Peaks in pyrogram reflect nucleotide sequence =pyrophosphate = pyrophosphate Giải trình tự phương pháp tổng hợp, không điện di ~500 MB on one plate, in just a few hours PYROSEQUENCING Step 1: DNA đích, Primer, ủ với enzym DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, chất APS (adenosine 5’phosphosulphat) luciferin Step 2: dNTP đưa vào phản ứng DNA polymerase xúc tác gắn dNTP vào sợi DNA primer bổ xung với DNA đích Mỗi dNTP gắn vào, phóng thích pyrophosphat (PPi) PYROSEQUENCING Step 3: ATP sulfurylase xúc tác chuyển PPi thành ATP với có mặt APS (adenosin 5’phosphosulphat) ATP tạo thành cung cấp lượng cho luciferin thành oxyluciferin nhờ enzym luciferase, ánh sáng nhìn thấy tỉ lệ với số ATP tiêu thụ Step 4: Apyrase, enzym phá dNTP ATP không sử dụng Step 5: dNTP khác đưa vào phản ứng Ứng dụng pyrosequencing: virus vi khuẩn Đặc biệt loại mới, nguy hiểm - Phát đột biến Kháng thuốc - Định danh vi khuẩn, nấm - Phân tích SNP-Single nucleotide polymorphisms (IL28B) CC: 80% đáp ứng ĐT - Genotype PYROSEQUENCING ỨNG DỤNG CỦA GIẢI TRÌNH TỰ DNA 6.1 Giải trình tự gen người HGP (10/1990): Viện quốc gia Y tế Hoa kỳ (3 tỉ USD) - 26/6/2000: Crag Venter Francis Collins 97% gen người giải mã - 4/2003 (kỷ niệm 50 năm mơ hình DNA WatsonCrick) Hoàn tất giải mã gen người - Bước vào kỷ nguyên Post-genomic Proteomic - Giá thành 2001: 1us / 1bp, 10 đến 15 năm nữa: 0,01 us/ 1bp Số gen giải mã - - Các gen khác v ề k í ch th c, s ố lượng gen mật độ gen 2013, đ ã c ó 3762 b ộ gen c ủ a vi khu ẩn giải trình tự, 181 b ộ gen vi khu ẩ n c ổ (archaea) v 183 b ộ gen vi sinh v ậ t nh ân chuẩn (eukaryote) 6.2 Định danh VSV: VK kỵ khí: giải trình tự đoạn đặc hiệu cho giống loài gen 16S rDNA 6.3 Định danh nấm: giải trình tự đoạn đặc hiệu cho giống loài gen 28S rDNA 6.4 Xác định genotype VR, VSV… HCV: genotype (1a, 1b), (2a, 2b, 2c)… HPV: high-risk (16, 18, 58), low-risk… 6.5 Phát đột biến, đột biến kháng thuốc  HBV kháng lamivudine: Lamivudin ức chế virus làm giảm tình trạng viêm Đột biến thường xảy vùng YMDD (tyrosine, methionine, aspartate, aspartate) protein polymerase virus - Giải trình tự đoạn 550 bps vùng gen preS phát đột biến kháng Lamivudin, Adefovir, Entecavir  Lao kháng thuốc Rifampicine: khuyếch đại gen rpoB M tuberculosis Sau xác định trình tự đoạn DNA quan tâm, so sánh với ngân hàng liệu gene NCBI (National Center Biotechnology Information) MỘT SỐ HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ MỚI Genome Analyzer Iix - Illumina Genome Sequencer FLX System million high-quality reads per run and read lengths of 400 bases ... PYROSEQUENCING Step 1: DNA đích, Primer, ủ với enzym DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, chất APS (adenosine 5’phosphosulphat) luciferin Step 2: dNTP đưa vào phản ứng DNA polymerase... TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM Dựa nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, ống phản ứng có thêm ddNTP, nên men polymerase kéo nhầm ddNTP vào sợi bổ sung bị chặn lại... primer GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN Dùng gel polyacrylamide biến tính, có độ phân giải cao, phân biệt đoạn DNA khác nucleotid Gel polyacrylamide thường chứa urea (tác nhân làm biến tính