Tất cả các vacxin thú y phải được sản xuất trong điều kiện kiểm tra, giám sát cẩn thận. Những yêu cầu và nguyên lý mô tả ở đây phù hợp với những tiêu chuẩn đã phát hành để tạo ra một vacxin có chất lượng cao mà chất lượng vacxin thú y lại dựa vào những nguyên liệu ban đầu của quá trình sản xuất, nhà xưởng, thiết bị và cá nhân con người có liên quan
NGUYÊN LÝ SẢN XUẤT VACXIN THÚ Y • Để đảm bảo sức khỏe tốt cho vật nuôi thực thành cơng chương trình sức khỏe động vật, cần nguồn vacxin tinh khiết, an tồn, hiệu lực có hiệu • Tất vacxin thú y phải sản xuất điều kiện kiểm tra, giám sát cẩn thận Những yêu cầu nguyên lý mô tả phù hợp với tiêu chuẩn phát hành để tạo vacxin có chất lượng cao mà chất lượng vacxin thú y lại dựa vào nguyên liệu ban đầu trình sản xuất, nhà xưởng, thiết bị cá nhân người có liên quan I NHÂN SỰ • Tất cá nhân làm việc sở sản xuất vacxin phải đào tạo nắm kiến thức cho q trình sản xuất, sau phải tiếp tục dự học khóa học nâng cao phù hợp với yêu cầu kỹ thuật (ví dụ GMP) 1.1 Cơ cấu tổ chức Ban giám đốc: Cơ sở sản xuất vacxin lãnh đạo ban giám đốc sở Mỗi người lãnh đạo có trách nhiệm giám sát khâu sản xuất chế phẩm phải đào tạo có kinh nghiệm để thực chức giao • Ban giám đốc gồm có: + Giám đốc sản xuất: Phải đào tạo đầy đủ có khả thực tiễn tốt lĩnh vực sản xuất, phải có đầy đủ quyền hạn trách nhiệm quản lý sản xuất chế phẩm, kiểm tra nguyên liệu ban đầu chế phẩm cuối + Giám đốc kiểm tra chất lượng: Có đầy đủ quyền hạn trách nhiệm nhiệm vụ kiểm tra chất lượng + Các giám sát viên: Giám sát viên giúp giám đốc sản xuất giám đốc kiểm tra chất lượng thực giám sát trực tiếp trình sản xuất, người phải qua đào tạo, có kinh nghiệm ln theo học khóa nâng cao GMP định kỳ Các kỹ thuật viên: • Phải đọc hiểu quy trình kỹ thuật phải đào tạo đầy đủ về: • Quy trình sản xuất giống gốc (master seed), giống sản xuất (working seed) • Thực nguyên lý sản xuất • Số lượng nhân viên: Phải đầy đủ để thực quy trình sản xuất, tạo sản phẩm vacxin có chất lượng • Tất người sở sản xuất vacxin phải khỏe mạnh, có ý thức giữ gìn vệ sinh môi trường vệ sinh cá nhân cao • Phải có trang bị bảo hộ lao động an toàn, phù hợp để bảo vệ người bảo vệ chế phẩm khơng bị nhiễm • II CƠ SỞ VẬT CHẤT Các sở sản xuất sử dụng để sản xuất vacxin phải thiết kế để đảm bảo độ tinh khiết sản phẩm suốt q trình sản xuất an tồn cho sức khỏe người Cấu trúc cần đạt: Có thể dễ dàng rửa Có đầy đủ phịng chuẩn bị riêng biệt Đảm bảo thơng gió tốt Có đầy đủ nước nóng lạnh Có phịng thay quần áo điều kiện tiện nghi khác để người làm việc không cần qua khu vực không cần thiết cho hoạt động sản xuất Cơ sở vật chất phải đảm bảo đầy đủ cho trình sản xuất như: Khu vực bảo quản giống Khu vực chuẩn bị dụng cụ trang thiết bị Khu vực chuẩn bị chất bổ trợ Khu vực hình thành sản phẩm, chai, đông khô, làm nút, dán nhãn, bảo quản sản phẩm cuối Khu vực kiểm nghiệm • Mỗi hoạt động yêu cầu diện tích riêng biệt Tất phịng hệ thống thơng khí phải thiết kế để tránh tạp nhiễm từ sản phẩm khác, từ người trang thiết bị • Các VSV có độc lực nguy hiểm phải chuẩn bị bảo quản phịng tách biệt; VSV dùng cơng cường độc cần phải bảo quản hoàn toàn biệt lập với chủng vacxin • Tất trang thiết bị tiếp xúc với sản phẩm phải tiệt trùng theo quy trình quy chuẩn • Cơ sở vật chất phải thiết kế hạn chế tới mức tối đa nhiễm mơi trường • Tất chất sử dụng trình sản xuất phải làm cho an toàn trước sở sản xuất • Nếu cấy chuyển vi sinh vật có lây nhiễm cao, khơng khí nhiễm cần phải sử lý để tránh làm lây lan mầm bệnh Con người phải đặc biệt tuân theo quy trình an toàn tắm, gội, tránh tiếp xúc với động vật mẫn cảm sau khỏi sở sản xuất • Chú ý chất liệu thiết kế sở sản xuất thay đổi phải tuân thủ, đảm bảo mức tiêu chuẩn loại vacxin sản xuất • Ví dụ: u cầu sở vật chất để sản xuất vacxin qua phôi gà dùng cho uống, nhỏ mũi không giống sản xuất vacxin nuôi cấy tế bào dùng để tiêm II SẢN XUẤT VACXIN Những yếu tố cho việc sản xuất vacxin đạt hiệu là: a) Có quy trình thao tác chung viết văn b) Có hướng dẫn sản xuất rõ ràng cho loại vacxin sản xuất c) Sự tôn trọng triệt để hướng dẫn trình sản xuất Các bước sản xuất vacxin bao gồm: 3.1 Lập kế hoạch Mỗi loại vacxin sản xuất sở phải có kế hoạch sản xuất chi tiết mơ tả bước quy trình, số lượng sản phẩm cần sản xuất, thời gian tiến hành Nói chung kế hoạch lập tài liệu quy trình sản xuất chuẩn chi tiết hóa 3.2 Tài liệu quy trình sản xuất • Cần có quy trình kỹ thuật chi tiết tài liệu sản xuất cho loại vacxin Tài liệu phải nêu rõ nguyên lý sản xuất, công đoạn sản xuất phương pháp kiểm tra sản phẩm sau cơng đoạn • Tài liệu nên nêu rõ trình giữ sản xuất giống gốc như: nguồn gốc giống gốc, trình phân lập, phương pháp tạo giống, cách xác định độc lực giống, số sinh học giống gốc (LD50, EID50, TCID50 ), quy trình giữ giống, mơi trường hay hệ thống tế bào sử dụng để nuôi cấy sản xuất giống gốc - Quy trình nhân giống sản xuất (working seed); - Trình tự sản xuất; - - Kiểm nghiệm sản phẩm; I Tách tế bào thận khỉ phương pháp truyền dịch – Khỉ dùng cho sản xuất giống khỉ Maccaca muldatta; – Cân nặng – kg tuổi – 2,5; – Khơng có tác nhân ngoại lai SV40 SIV STLV; – Khơng có kháng thể polio; – Cách ly kiểm dịch tuần Mổ lấy thận (vô trùng): Gây mê sâu ketamin liều 10 – 20mg/kg P, cắt động mạch cổ, tắm xà phòng cloramin, lột da bụng, mổ bộc lộ thận, bóc tách thận, đảm bảo khơng gây tổn thương nhu mơ thận • Bảo quản thận bình có 100ml mơi trường LHE Hanks ủ ấm 370C Tripsin hóa: Lấy thận đặt vào đĩa petri, luồn kim vào động mạch thận, truyền dung dịch versen 150ml – 200ml vào động mạch thận với tốc độ 15 – 20ml/phút đẩy máu đọng nhu mô, truyền 150 – 200ml dung dịch tripsin với tốc độ thấy dịch chảy ngồi nhớt; nhu mơ thận xuất vết nứt Cho thận vào bình chứa 80 – 100ml môi trường LHE, lắc nhẹ đến môi trường hóa đục (tế bào tách ra) – hỗn dịch tế bào thu giữ lại bình có 100 – 150ml huyết bê giữ lạnh Tiếp tục tripsin hóa nhu mơ thận tan hết Hỗn dịch tế bào cho thêm LHE vừa đủ 1000 – 1500ml cho nồng độ huyết bê đạt 10% bảo quản lạnh – 80C nuôi cấy Kiểm tra vô trùng Đếm tế bào: Pha tế bào xanh trypan với tỷ lệ 1,5 lần, đếm buồng đếm kính hiển vi phản pha Tiêu chuẩn chấp nhận: Hỗn dịch tế bào đồng nhất; Tỷ lệ sống 80%; Lượng tế bào đủ ni cấy 100 bình Roux II Ni cấy tế bào • Pha tế bào mơi trường phát triển LHE để đạt nồng độ 70.000 tế bào/1ml • Môi trường LHE gồm: 50% LH0,5% + 50% Eargle + NaHCO3 0,025% + huyết bê 7-10% + kháng sinh; ni cấy vào bình Roux dung tích 1200 ml, diện tích ni cấy 250cm2, khối lượng 170ml hỗn dịch tế bào pha lỗng • Ni cố định 370C 4-5 ngày, thay môi trường môi trường trì có 2-5% huyết bê Tiếp tục ni 3-4 ngày để tế bào mọc kín lớp • Kiểm tra phát triển tế bào hàng ngày Tiêu chuẩn chấp nhận: - Tế bào mọc kín lớp; - Khơng nhiễm khuẩn; - Số tế bào thai khoảng 30-40 triệu III Gây nhiễm virus • Gây nhiễm virus giai đoạn chính, quan trọng q trình sản xuất vacxin nói chung Mỗi chủng virus có nồng độ gây nhiễm riêng đảm bảo thu vacxin an toàn, đạt hiệu cao 3.1 Pha lỗng giống vacxin: Tính số lượng virus cần gây nhiễm lơ sản xuất • Dùng chủng gốc virus bại liệt typ I: WHO-IS-90C viện nghiên cứu bại liệt Nhật Bản cung cấp, chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO) cấy truyền lần (SO+2) hiệu giá 108,3TCID50/ml • Pha lỗng với LH3E, với khối lượng cần thiết 3.2 Rửa tế bào - Loại bỏ hết môi trường chai tế bào; - Cho vào chai 100ml Hank’s láng qua, lắc nhẹ, hút hết dịch rửa Hank’s; - 25% số chai tế bào chọn ngẫu nhiên làm đối chứng 3.3 Gây nhiễm Cho vào chai 3ml hỗn dịch giống bơm tự động, láng hỗn dịch virus lên bề mặt tế bào 3.4 Hấp phụ virus Toàn số chai tế bào gây nhiễm chai đối chứng để hấp phụ 33,50C/1 Cứ 15 phút láng nhẹ lần hỗn dịch virus toàn bề mặt chai tế bào 3.5 Bổ sung môi trường Cho vào chai 110 – 120ml LH3E nuôi 33,30C, theo dõi hủy hoại tế bào Những chai thu hoạch 80% tế bào bị hủy hoại với mức CPE3+ đến 4+ IV Thu hoạch vacxin: Thu hoạch vacxin quy trình mang lại hiệu cao sản xuất Kiểm tra tế bào đối chứng: Môi trường vàng cam, suốt, tế bào bám khắp bề mặt chai, tế bào khơng bị thối hóa Kiểm tra chai gây nhiễm virus: - Mơi trường có màu vàng sẫm, suốt; - Soi kính hiển vi thấy có tượng hủy hoại: Tế bào co tròn, bong khỏi thành chai: 3+: hầu hết tế bào thối hóa; 4+: tế bào bong hết khỏi thành chai) Thu hoạch – – – – Thời gian thu hoạch khoảng 65 – 90h sau gây nhiễm Dùng tay lắc mạnh chai cho tế bào bong hết khỏi thành chai, bảo quản tủ -200C Ta thu vacxin bán thành phẩm Thử vô trùng bán thành phẩm V Kiểm định vacxin • Nếu kiểm định đạt yêu cầu – quy trình chế tạo vacxin hồn thiện MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN Tập trung vacxin • Lấy chai tế bào khỏi tủ đá để nhiệt độ phòng gần tan hết đá, dùng tay lắc mạnh để đập vỡ tế bào giải phóng virus • Chuyển vacxin từ bình Roux sang chai 2,5 lít, chuyển chai 2,5 lít sang chai 20 lít, xác định số lượng vacxin thu • Chia vacxin từ chai 20 lít chai 1,5 lít, bảo quản -200C, lấy 100ml mẫu kiểm định, thử vô trùng Lọc vacxin: Nhằm loại bỏ tế bào tạp chất trình ni cấy, đảm bảo vơ trùng Trộn vacxin thành vacxin thành phẩm • Các vacxin bại liệt đơn giá typ I, II, III sau chế đơn giá trộn lại với thành vacxin bại liệt thành phẩm, chai, dán nhãn, bảo quản Quy trình sản xuất vacxin phó thương hàn lợn vơ hoạt (Swine Salmonella vaccine) Giống gốc gồm chủng S1, S2 Kiểm tra khiết Muller kofman 370C/8h Kiểm tra khiết Tập trung giống sản xuất 10 lít Cấy giống vacxin Kiểm tra khiết 370C/sau 8h Lên men sục khí 370C/24h tiệt trùng formol 0,8%) Đếm số (10 tỷ vi khuẩn/1ml) Kiểm tra vô trùng Lắc giải độc 370C/7 ngày Kiểm tra an toàn độc tố Pha loãng tới nồng độ 10 tỷ vi khuẩn/ml Kiểm tra bán thành phẩm Bổ sung nước phèn 10% Lọ nước thịt 50ml Kiểm tra thành phẩm Vật lý, an toàn, vô trùng, hiệu lực Ra chai dán nhãn bảo quản -100C/18 tháng Quy trình sản xuất vacxin nhiệt thán (Anthrax spore vaccine) • Vacxin nhiệt thán chế tạo từ nha bào vi khuẩn nhiệt thán vơ độc khơng có giáp mơ (Avirulenous B anthracis strain) • Vacxin sản xuất từ thể: – Thể đông khô – Thể lỏng dung dịch glyxerin, ml vacxin chứa khoảng 30 triệu nha bào Quy trình sản xuất vacxin nhiệt thán Giống gốc Giống sản xuất Kiểm tra khiết Martine 370C/24h Cấy giống sản xuất vacxin Kiểm tra mức độ hình thành nha 370C/7-10 ngày bào ( 90% thu hoạch Tập trung thành phẩm Bổ sung Glycerin 30% 15 lít Kiểm nghiệm Kiểm nghiệm Ra chai dán nhãn bảo quản -100C/2 năm Đông khô dán nhãn bảoquản Quy trình sản xuất vacxin tụ dấu (Swine Erysipelas and Pasteurella live vaccine) ArPs3 Giống gốc Bình 10 lít Kiểm tra khiết Bình 20 lít VR2 Mơi trường Hottinger Nước dày Pepton bột NaCl Môi trường Hottinger Nước dày Pepton bột NaCl + Agar Nuôi cấy tĩnh 370C/36-370C Kiểm nghiệm Ra chai dán nhãn bảo quản -150C/9 tháng VACXIN VIRUS NHƯỢC ĐỘC CHẾ TRÊN PHÔI TRỨNG Giống gốc Pha với nước sinh lý nồng độ 10-1 xELD50) Kiểm tra vô trùng Gây giống sản xuất Gây nhiễm phôi trứng Ấp tiếp 370C/x Thu trứng, để lạnh 40C/12h Mổ trứng Thu chất chứa virus Kiểm tra vô trùng chuẩn độ hiệu giá Kiểm nghiệm vacxin Bán thành phẩm Ra chai dán nhãn bảo quản -100C/2 năm Ra chai Đông khô dán nhãn bảoquản ... quy trình kỹ thuật phải đào tạo đ? ?y đủ về: • Quy trình sản xuất giống gốc (master seed), giống sản xuất (working seed) • Thực nguyên lý sản xuất • Số lượng nhân viên: Phải đ? ?y đủ để thực quy... để tạo sản phẩm vacxin • T? ?y quy mơ sản xuất mà phải nhân giống sản xuất tới số lượng cho phù hợp • Giống sản xuất tạo từ giống gốc cách c? ?y chuyển tiếp khơng q – 10 lần • Số lần c? ?y chuyển tiếp... tiết tài liệu sản xuất cho loại vacxin Tài liệu phải nêu rõ nguyên lý sản xuất, công đoạn sản xuất phương pháp kiểm tra sản phẩm sau cơng đoạn • Tài liệu nên nêu rõ q trình giữ sản xuất giống gốc