Nghiên cứu phân lập Vitexin và Isovitexin từ cây bồ kết ( Gleditsia Australis Hemsl.)

Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Trường đại học sư phạm hà nội Khoa hóa học ĐỖ THỊ THOAN Nghiên cứu phân lập vitexin isovitixin từ bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.) khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : Hóa hữu Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Nam Hà Nội-2010 Đỗ Thị Thoan Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Khoá luận tốt nghiệp hồn thành Phịng Hóa hữu - Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Với lịng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS TS Châu Văn Minh, PGS.TS Phan Văn Kiệm anh chị phịng Hóa hữu tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Hồi Nam Viện Hố học hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học công nghệ Việt Nam, người tận tình hướng dẫn em suốt trình thực hồn thành khố luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên tạo điều kiện cho em học tập sử dụng thiết bị tiên tiến Viện để hoàn thành tốt mục tiêu đề khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Văn Bằng tồn thể thầy giáo khoa Hố học, thầy giáo Trường Đại học Sư phạm Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt trình học tập trường Sinh Viên Đỗ Thị Thoan Đỗ Thị Thoan Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết luận án hoàn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Sinh Viên Đỗ Thị Thoan Đỗ Thị Thoan Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Mục lục Danh mục hình khóa luận Danh mục bảng khóa luận Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Mở đầu Chương TổNG QUAN 1 Giới thiệu sơ lược bồ kết (Gleditsia australis Hemsl) 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Công dụng y học cổ truyền bồ kết 1.2 Tổng quan nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học của loài chi Gleditsia 1.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học 1.2.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi chi Gleditsia Chương 2: đối tượng Phương pháp 10 nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu 10 2.2 Phương pháp chiết xuất 10 2.3 Các phương pháp phân lập 10 2.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 10 2.3.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế 11 2.3.3 Sắc kí cột (CC) 11 2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 2.4.1 Điểm nóng chảy (Mp) Đỗ Thị Thoan 13 13 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp 2.4.2 Độ quay cực ([ỏ]D) 13 2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 14 2.4.4 Phổ khối lượng MS (Mass spectroscopy) 16 2.5 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 16 2.6 Phân lập hợp chất 17 Chương kết thảo luận 20 3.1 Hằng số vật lý kiện phổ hợp 20 chất 3.1.1 Hợp chất BK3C (isovitexin): 20 3.1.2 Hợp chất GF 7.8(vitexin): 20 3.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất: 21 3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 21 3.3.1 Hợp chất BK3C (isovitexin) 21 3.3.2 Hợp chất GF 7.8 (vitexin) 26 3.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Đỗ Thị Thoan 33 Kết luận 34 Tài liệu tham khảo 35 Phụ lục 38 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Danh mục Hình khóa luận Hình 1.1 Hình ảnh bồ kết Hình 3.3.1.1 Phổ 1H-NMR BK3C 22 Hình 3.3.1.2 Phổ 13C-NMR BK3C 23 Hình 3.3.1.3 Phổ 13C-NMR phổ DEPT BK3C 25 Hình 3.3.1.4 Phổ ESI-MS BK3C 25 Hình 3.3.1.5 Cấu trúc hóa học BK3C 26 Hình 3.3.2.1 Phổ 1H-NMR GF7.8 27 Hình 3.3.2.2 Phổ 13C-NMR GF7.8 27 Hình 3.3.2.3 Phổ HSQC GF7.8 28 Hình 3.3.2.4 Phổ HMBC GF7.8 29 Hình 3.3.2.5 Phổ MS GF7.8 31 Hình 3.3.2.6 Phổ MS GF7.8 31 Hình 3.3.2.7 Cấu trúc hóa học GF7.8 31 Đỗ Thị Thoan Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Danh mục bảng khóa luận Bảng 3.2.1 Kết hoạt tính kháng sinh in vitro hợp chất 21 Bảng 3.3.1.1 Kết phổ NMR BK3C 24 Bảng 3.3.2.1 Kết phổ NMR GF7.8 32 Đỗ Thị Thoan Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Danh mục chữ viết tắt APCI-MS Atmospheric pressure Phổ khối ion hoá học áp chemical ionization xuất thường CC Column Chromatography Sắc ký cột 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR Resonance Spectroscopy DEPT cacbon 13 Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer ESI-MS Electronspray Ionization Mas Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Spectrum FAB-MS Fast Atom Bombardment Phổ khối lượng bắn phá Mass Spectrometry H-NMR nguyên tử nhanh Proton Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectroscopy HMBC proton Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity HPLC_MS High Performance nhiều liên kết Liquid Sắc ký lỏng cao áp hiệu Chromatography with Mass- cao kết nối khối phổ Spectrometry HSQC Heteronuclear Single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua Quantum Coherence liên kết IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại IUPAC International Union of Pure Hiệp hội Hóa học Quốc tế and Applied Chemistry Mp Melting Point Điểm chảy TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng Đỗ Thị Thoan Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội TMS Khoá luận tốt nghiệp Tetrametyl Silan Đỗ Thị Thoan Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Mở đầu Ngày giới phải đối mặt với hàng loạt bệnh nguy hiểm, đặc biệt bệnh lây nhiễm gây nên vi khuẩn, virút, nấm động vật kí sinh Mặc dù khoa học ngày gặt hái nhiều tiến mới, tăng cường điều kiện sống người bệnh lây nhiễm mối đe dọa thường trực sức khỏe Những vấn đề đặc biệt quan trọng nước phát triển môi trường sống điều kiện y tế không đảm bảo kháng thuốc dòng lây nhiễm ngày gia tăng Việc phát triển thuốc kháng sinh đặc hiệu giúp giảm thiểu lây lan bệnh dịch, tăng cường cơng tác chăm sóc sức khỏe người dân Chính vậy, việc nghiên cứu, tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng y học, nông nghiệp mục đích khác đời sống người nhiệm vụ quan trọng nhà khoa học nước quan tâm Cây bồ kết (Gleditsia australis Hemsl Hay Gleditschia australis Hemsl.) mọc hoang miền Bắc miền Nam nước ta với trữ lượng lớn Trong y học đại, số bệnh viện dùng bồ kết chữa bí đại, trung tiện sau mổ, tắc ruột, dùng cho trẻ em người lớn Quả bồ kết dùng trường hợp trúng phong, hôn mê bất tỉnh, cấm khẩu, hen suyễn, mụn nhọt, viêm tuyến vú, đau nhức Những nghiên cứu tác dụng dược lý cho thấy bồ kết có tác dụng kháng khuẩn mạnh kháng tràng cầu khuẩn, trực khuẩn lỵ shigella, trực khuẩn thương hàn, trực khuẩn mủ xanh phảy khuẩn tả Theo xu hướng nghiên cứu trên, mục tiêu khóa luận tập trung nghiên cứu, phân lập xác định cấu trúc hợp chất có thành phần hố học bồ kết nhằm góp phần tạo sở cho nghiên cứu tiếp Đỗ Thị Thoan 10 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Phổ Khoá luận tốt nghiệp 13 C-NMR GF7.8 xuất tín hiệu tương ứng 21 cacbon có 15 cacbon thuộc vào khung flavon cacbon thuộc vào phân tử đường Nhóm cacbonyl xác định tín hiệu  182,11, vịng B para xác định tín hiệu  128,98 (CH) 115,84 (CH) mà chúng có cường độ píc cao gấp đơi tín hiệu CH khác Các giá trị C phân tử đường (73,41, 70,87, 78,69, 70,58, 81,85, 61,32) hoàn toàn phù hợp với tín hiệu tương ứng đường glucopyranozyt có liên kết C-C [20] Các giá trị  GF7.8 so sánh với giá trị tương ứng hợp chất 8-C--D-glucopyranosyl-apigenin (vitexin) [21] cho kết phù hợp Ngoài ra, phổ HSQC HMBC GF7.8 thực để gán cách xác giá trị độ dịch chuyển hoá học vị trí tương ứng Kết phổ HSQC nêu bảng 4.2, tương tác phổ HMBC mơ tả hình 4.8 Tương tác HMBC H1′′glc với C-2′′, C-3′′, C-5′′, C-6, C-7, C-8 khẳng định thêm giá trị  C-2′′, C-3′′, C-5′′ mà cịn khẳng định có mặt liên kết C-C vị trí liên kết C-8 Tương tác HMBC H-6 ( 6,28) với C-8, C-10, tương tác H-3 ( 6,78) với C-10, C-1′ khẳng định có mặt hai nhóm hyđroxyl C-5 C-7, nối đơi C2/C-3 Thêm vào đó, tín hiệu tương tác HMBC rõ 5-OH ( 13,17) với C-5 ( 160,42) tương tác H-1′′glc với C-9 ( 156,02) khẳng định giá trị C C-9 156,02 C-5 phải 160,42 Đỗ Thị Thoan 40 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khố luận tốt nghiệp H×nh 3.3.2.5 Phỉ MS cđa GF7.8 Hình 3.3.2.6 Phổ MS GF7.8 Các kết phân tích nêu cho thấy cơng thức dự kiến GF7.8 C21H20O10 Kết khẳng định thêm xuất pic ion phân tử m/z 433 [M+H]+ (positive), 431,0 [M-H]-(negative) phổ khối lượng ESI-MS Từ kết nêu trên, hợp chất GF7.8 xác định vitexin, hợp chất lần tìm thấy từ bồ kết OH 6" HO 3" 4" O 1" HO OH 5" 2" OH 2' HO 1' O OH 6' 4' 5' 10 3' O Hình 3.3.2.7 Cấu trúc hóa học GF7.8 Đỗ Thị Thoan 41 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Bảng 3.3.2.1 Kết phổ NMR GF7.8 HMBC C) C C C H (J, Hz) 164,0 163,98 - 102,5 102,47 6,28 (s) 182,1 182,11 - 156,0 156,02 - 98,1 98,17 6,78 (s) 162,5 162,57 - 104,1 104,63 - 162,5 161,15 - 10 104,6 104,08 - 1′ 121,6 121,64 - 2′, 6′ 129,0 128,98 8,03 (d, 8,5) 1′, 4′ 3′, 5′ 115,8 115,84 6,90 (d, 8,5) 1′ 4′ 160,4 160,42 - 1′′ 78,6 78,69 4,70 (d, 10,0) 2′′ 73,4 73,41 3,85 9,5) 3′′ 70,8 70,87 3,28* 4′′ 70,5 70,58 3,40 (br s) 5′′ 81,8 81,85 3,24* 6′′ 61,3 61,32 3,54 (br m) 4′′, 5′′ 3,77 (br d, 4′′, 5′′ 11,5) 5-OH a (br (H- 2, 4, 1′ 5, 7, 8, 10 7, 8, 9, 3′′ t, 1′′, 4′′ 13,17 Đo DMSO-d6, b125MHz, c500MHz, H vitexin [21], *Tín hiệu bị che khuất Đỗ Thị Thoan 42 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp 3.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Các chất phân lập từ bồ kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết cho thấy hợp chất hợp chất 13a (BK3C) kháng chủng E coli S cerevisiae với giá trị MIC = 50 g/ml Đây lần hợp chất phân lập từ bồ kết Đỗ Thị Thoan 43 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Kết luận Từ bồ kết (Gleditschia australis Hemls.), phương pháp chiết làm giàu phân đoạn phương pháp sắc ký kết hợp phân lập hợp chất sạch, là:  Vitexin hay 8-C--D-glucopyranosyl-apigenin  6--D-glucopyranosyl-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1- benzopyran-4-one hay isovitexin Hợp chất isovitexin lần tìm thấy từ chi Gleditschia Cấu trúc hóa học hợp chất xác định phương pháp phổ đại, bao gồm phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều, phổ khối lượng ESI-MS phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS) Đã đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập Kết cho thấy hợp chất 13a (BK3C) kháng chủng E coli S cerevisiae với giá trị MIC = 50 g/ml Đỗ Thị Thoan 44 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Tài liệu tham khảo Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt nam, tr 732-734, Nxb Y học Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt nam, tr 114-115, Nxb Y học Đỗ Huy Bích cộng (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật Phạm Hoàng Hộ (1999) Cây cỏ Việt nam, I, tr 838-869, Nxb Trẻ Takao Konoshima and Tokunosuke Sawada (1982) Legume saponins of Gleditsia japonica Miquel IV 13C-Nuclear magnetic resonance spectral studies for structure elucidation of Gleditsia saponins B and C Chem Pharm Bull., 30 (8), pp 2747-2760 Zhang Z., Koike K., Jia Z., Nikaido T., Guo D and Zheng J (1999) Four new triterpenoidal saponins acylated with one monoterpenic acid from Gleditsia sinensis, J Nat Prod., 62 (5), pp 740-745 Zhang Z., Koike K., Jia Z., Nikaido T., Guo D and Zheng J (1999) Triterpenoidal saponins acylated with two monoterpenic acids from Gleditsia sinensis, Chem Pharm Bull (Tokyo), 47 (3), pp 388-393 Zhang Z., Koike K., Jia Z., Nikaido T., Guo D and Zheng J (1999) Gleditsiosides N-Q, new triterpenoid saponins from Gleditsia sinensis J Nat Prod., 62 (6), pp 877-881 Zhang Z., Koike K., Jia Z., Nikaido T., Guo D and Zheng J (1999) Triterpenoidal saponins from Gleditsia sinensis Phytochemistry, 52 (4), pp 715-722 10 Lim JC., Park JH., Budesinsky M., Kasal A., Han YH., Koo BS., Lee SI and Lee DU (2005) Antimutagenic constituents from the thorns of Gleditsia sinensis Chem Pharm Bull (Tokyo), 53 (5), pp 561-564 Đỗ Thị Thoan 45 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp 11 Zhou L., Li D., Wang J., Liu Y and Wu J (2007) Antibacterial phenolis compounds from the spines of Gleditsia sinensis Lam Nat Prod Res., 21 (4), pp 283-291 12 Zhou L., Li D., Wang J., Qin Z., Zhao S., Qiu M and Wu J (2007) Two ellagic acid glycosides from Gleditsia sinensis Lam With antifungal activity on Magnaporthe grisca Nat Prod Res., 21 (4), pp 303-309 13 Shoemaker M., Hamilton B., Dairkee SH, Cohen I and Campbell M.J (2005) In vitro anticancer activity of twelve Chinese medicinal herbs Phytother Res., 19 (7), pp 649-651 14 Chow LM., Chui CH., Tang JC., Teo IT., Lau FY., Cheng GY., Wong RS., Leung TW., Lai KB.,Yau MY., Gou D and Chan AS (2003) Gleditsia sinensis fruit extract is a potential chemotherapeutic agent in chronic and acute myologenous leukemia Oncol Rep., 10 (5), pp 16011607 15 Chow LM., Tang JC., Lau FY., Teo IT., Yau MY., Wong RS., Cheng GY., Ho SK., Leung TW., Hui KS., Wong MM., Fatima S., Cheng CH., Cheung F., Tan WQ., Chow LM., Guo D and Chan AS (2004) Gleditsia sinensis fruit extract induced growth inhibition involves basic fibroblast growth factor and nitric oxide Int J Mol Med., 13 (1), pp 169-173 16 Ahmed AA., Hegazy ME., Hassan NM., Wojcinska M., Karchesy J., pare PW and Mabry TJ (2006), Constituents of Chrysothamnus viscidiflorus, Phytochemistry, 67 (14), pp 1547-1553 17 Akao Y., Maruyama H., Matsumoto K., Ohguchi K., Nishizawa K., Sakamoto T., Araki Y., Mishima S and Nozawa Y (2003), Cell growth Đỗ Thị Thoan 46 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp inhibitory effect of cinnamic acid derivatives from propolis on human tumor cell lines, Biol Pharm Bull., 26 (7), pp 1057-1059 18 Arbiser JL., Li XC., Hossain CF., Nagle DG., Smith DM., Miller P., Govindarajan B., DiCarlo J., Landis-Piwowar KR and Dou QP (2005), Naturally occurring proteasome inhibitors from mate tea (Ilex paraguayensis) serve as models for topical proteasome inhibitors, J Invest Dermatol., 125 (2), pp 207-212 19 Zhou HY., Zhang H and Li SM (2005), Chemical constituents from leaves of Phyllostachys pubescens I, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 30 (24), pp 1933-1934 20 Barron D., Kaouadji M and Mariotte AM (1984), Cinnamic acid esters from Meum athanmanticum, J Nat Prod., 47 (4), pp 737-738 21 Bernkop-Schnurch A., Krist S., Vehabovic M and Valenta C (1998), Synthesis and evaluation of lysozyme derivatives exhibiting an enhanced antimicrobial action, Eur J Pharm Sci., (4), pp 303-309 Đỗ Thị Thoan 47 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Phụ lục Các phổ hợp chất: 8-C--D-glucopyranosyl-apigenin (vitexin, GF7.8) Phổ 1H-NMR GF7.8 Đỗ Thị Thoan 48 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khố luận tốt nghiệp Phỉ 13C-NMR cña GF7.8 Phổ HSQC GF7.8 Đỗ Thị Thoan 49 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Phổ HMBC GF7.8 Đỗ Thị Thoan 50 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Phổ MS GF7.8 Đỗ Thị Thoan 51 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Các phổ hợp chất: (isovitexin, BK3C) Phổ 1H-NMR BK3C Đỗ Thị Thoan 52 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Phổ 13C-NMR BK3C Phổ 13C-NMR BK3C Đỗ Thị Thoan 53 Lớp K32C – Khoa Hoá Học Trường đại học sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp Phổ 13C-NMR phổ DEPT BK3C Phổ ESI-MS BK3C Đỗ Thị Thoan 54 Lớp K32C – Khoa Hoá Học ... Gr (- ) Gr (+ ) mẫu Nấm mốc Nấm men E P B S Asp F S C co li aeruginosa subtillis aureus niger oxysporum cerevisiae albicans GF7.8 (- ) (- ) (- ) (- ) (- ) (- ) (- ) (- ) BK3C 50 (- ) (- ) (- ) (- ) (- ) 50 (- )... ảnh bồ kết 1.1.2 Công dụng y học cổ truyền bồ kết Cây bồ kết dược liệu dân gian dùng phổ biến Việt nam Cây Bồ kết cung cấp vị thuốc sau đây: Bồ kết- Fructus Gleditsiae, thường gọi tạo giác; gai Bồ. ..  Gleditsia fera (Lour.) Merr. -Bồ kết Hoa Nam  Gleditsia ferox Desf  Gleditsia japonica Miq - Bồ kết nỳi hay bồ kết Nhật Bản  Gleditsia macracantha Desf  Gleditsia microphylla H.D.Gordon-Bồ