ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG (Copy > Word > OK)

Pi ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  ĐINH NGỌC HƯƠNG ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hồng Mậu THÁI NGUN - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) gọi đậu nành trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất cải tạo đất tốt [5] Vì đậu tương gọi "Ơng Hồng loại họ đậu" Hiện nay, nước hình thành vùng sản xuất đậu tương: vùng Đơng Nam có diện tích lớn (26,2% diện tích đậu tương nước), miền núi Bắc bộ: 24,7%, đồng sông Hồng: 17,5%, đồng sông Cửu Long: 12,4%[2] Tổng diện tích vùng chiếm 80% diện tích trồng đậu tương nước, cịn lại đồng ven biển miền Trung Tây Nguyên [5] Các giống đậu tương nước ta phong phú bao gồm giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến tập đoàn giống đậu tương địa phương Các giống đậu tương địa phương Việt Nam đa dạng, phong phú kiểu hình kiểu gen Đây nguồn vật liệu quý cho công tác chọn tạo giống đậu tương phù hợp với điều kiện sản xuất vùng, miền khác [10] Đánh giá đa dạng di truyền giống đậu tương địa phương tạo sở cho công tác chọn tạo giống nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hiện nay, nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền giống trồng nói chung đậu tương nói riêng RAPD, RFLP, AFLP, SSR, STS, Các phương pháp phát huy hiệu mà khắc phục nhược điểm phương pháp chọn giống truyền thống hiệu sàng lọc cao, tiết kiệm thời gian tin cậy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Trên giới, kỹ thuật RAPD nhiều tác giả sử dụng để nghiên cứu quan hệ di truyền số giống đậu tương như: [26], [32], [34], [43], [49], [50] Ở Việt Nam, Vũ Anh Đào (2009), đánh giá đa dạng di truyền mức phân tử 16 giống đậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên kỹ thuật RAPD tổng số phân đoạn DNA thu 766 Trong phạm vi vùng phân tích có 56 phân đoạn DNA nhân bản, có 21 băng vạch cho tính đa hình (tương ứng 37,5%) [4], Chu Hồng Mậu đtg (2002) sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích sai khác hệ gen dòng đậu tương đột biến với với giống gốc, tạo sở cho chọn dịng đột biến có triển vọng [12] Nhằm tạo sở cho việc lựa chọn giống đậu tương có chất lượng tốt phục vụ công tác lai tạo giống, lựa chọn tiến hành nghiên cứu đề tài luận văn thạc sĩ là: “Đánh giá đa dạng di truyền số giống đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) địa phƣơng” Mục tiêu nghiên cứu Xác định khác biệt hệ gen mối quan hệ di truyền 30 giống đậu tương địa phương kỹ thuật RAPD Nợi dung nghiên cƣ́u 3.1 Phân tích đa dạng số đặc điểm hình thái, khối lượng hạt như: màu vỏ hạt, rốn hạt, hình dạng hạt, khối lượng 1000 hạt giống đậu tương nghiên cứu 3.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) để khuếch đại phân đoạn DNA với sàng lọc với 16 mồi ngẫu nhiên có kích thước 10 nucleotide 3.3 Xác định hệ số đa dạng hệ gen giống đậu tương nghiên cứu 3.4 Thiết lập sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ khoảng cách di truyền giống đậu tương nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Theo từ điển thực phẩm, đậu tương biết có nguồn gốc xa xưa từ Trung Quốc coi thực phẩm cho đời sống người từ 4000 năm trước, sau truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng kỷ thứ VIII, vào nhiều kỷ sau có mặt nước Á Châu Thái lan, Malaisia, Korea Việt Nam Cây đậu tương có mặt Âu Châu vào đầu kỷ XVII Hoa Kỳ vào kỷ XVIII Ngày Hoa Kỳ quốc gia đứng đầu sản xuất đậu tương chiếm 50% sản lượng toàn giới, đến Braxin, Achentina, Trung Quốc [19] Đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae Phaseoleae Đậu tương có tên khoa học Glycine Max (L) Merrill, có NST 2n = 40 [5], [2] Do xuất phát từ yêu cầu, tiêu chí phân loại khác nên có nhiều cách phân loại khác Nhưng đến nay, hệ thống phân loại vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lượng nhiễm sắc thể nhiều người sử dụng [5] Hệ thống phân loại vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lượng (NST) nhiễm sắc thể Hymowit Newell (1984) xây dựng Theo hệ thống ngồi chi Glycine cịn có thêm chi phụ Soja Chi Glycine chia thành loài hoang dại lâu năm, chi phụ Soja chia làm loài: loài đậu tương trồng Glycine (L.) Merr loài hoang dại hàng năm G Soja Sieb Zucc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học đậu tƣơng Cây đậu tương trồng cạn thu hạt, gồm phận chính: rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đậu tương Rễ đậu tương có rễ rễ phụ Rễ ăn sâu 30-50cm 1m Trên rễ mọc nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp tập trung nhiều tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2 Trên rễ rễ phụ có nhiều nốt sần Bộ rễ phân bố nơng sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu kỹ thuật trồng Q trình phát triển rễ phân làm thời kỳ: (i) Ở thời kỳ thứ nhất, lớp rễ phát triển, rễ rễ phụ phát triển mạnh kéo dài sinh nhiều rễ Thời kỳ thường kéo dài từ 30-40 ngày sau mọc (ii) Ở thời kỳ thứ hai, lớp rễ phát triển chậm dần, rễ khơng nhú chí có số rễ khơ Lúc gốc thân gần cổ rễ rễ phụ nhỏ kéo dài phát triển gần thu hoạch Số lượng 30-40 rễ phụ ăn phía gần mặt đất Lớp rễ có nhiệm vụ cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho phát triển thân, làm Trong kỹ thuật trồng nên ý thời kỳ này, cần vun đất cho lớp rễ phát triển mạnh Một đặc điểm quan trọng cần lưu ý rễ đậu tương có nhiều nốt sần Đó u bướu nhỏ bám vào rễ Nốt sần kết cộng sinh số loại vi sinh vật có tên khoa học Rhizobium Japonicum với rễ đậu tương Vi sinh vật thường có dạng hình cầu hình que [5] Trong nốt sần có khoảng 3-4 tỷ vi sinh vật, mà ta nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại 600 - 1000 lần [5], [19] Nốt sần rễ đậu tương thường tập trung tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần dần sâu có khơng có Nốt sần đóng vai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn trị q trình cố định đạm khí trời cung cấp cho Lượng đạm cung cấp cho lớn khoảng 30-60 kg/ha Nốt sần dài l cm, đường kính - mm, hình thành có màu trắng sữa, tốt có màu hồng (màu globulin có cấu tạo gần giống hemoglobin máu có Fe) [5] Thân đậu tương Thân đậu tương thuộc thân thảo, có hình trịn, thân có nhiều lơng nhỏ Thân cịn non có màu xanh màu tím già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc thân cịn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc hoa sau Nếu thân lúc cịn non màu xanh hoa màu trắng cịn non thân có màu tím hoa có màu tím đỏ Thân có trung bình 14-15 lóng, lóng phía thường ngắn, lóng phía thường dài (vì lóng phía phát triển từ ngày 35-40 trở vào lúc sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tuỳ theo giống thời vụ gieo mà chiều dài lóng có khác thường biến động từ - 10 cm Cây đậu tương vụ hè thường có lóng dài vụ xn vụ đơng Chiều dài lóng góp phần định chiều cao thân Thân đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m Giống đậu tương dại cao 2-3 m Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bị thường làm thức ăn cho gia súc Những giống thân to thường thân đứng có nhiều hạt chống gió bão Tồn thân có lớp lơng tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cuống Thực tế có giống khơng có lơng tơ Những giống có mật độ lơng tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn chịu rét khoẻ Ngược lại giống khơng có lơng tơ thường sinh trưởng khơng bình thường, sức chống chịu Thân có lơng tơ nhiều dài ngắn, dày thưa đặc điểm phân biệt giống với nhau[19] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Căn vào tập tính sinh trưởng đặc điểm thân người ta chia làm loại: (i) Loại mọc thẳng: thân cứng, đường kính thân lớn, thân khơng cao lắm, đốt ngắn, nhiều tập trung thường giống hoa hữu hạn; (2) Loại bị: thân phân cành nhỏ, mềm, phủ mặt đất thành đám dây, thân dài, đốt dài, nhỏ phân tán; (3) Loại nửa bò: loại trung gian loại mọc thẳng mọc bò trên; (4) Loại mọc leo: thân nhỏ dài, mọc bò đất leo lên giá thể khác Thân đậu tương có khả phân cành từ nách đơn kép Những cành thân phân gọi cành cấp 1, cành cấp phân cành cấp Số lượng cành nhiều hay thay đổi theo giống, thời vụ, mật độ gieo trồng đ iều kiện canh tác Trung bình thường có 2-5 cành, có số giống điều kiện sinh trưởng tốt có 10 cành Thường sau mọc khoảng 20-25 ngày đậu tương bắt đầu phân cành Vị trí phân cành phù hợp cao 15cm, thấp q khơng có lợi cho việc giới hố Giống đậu tương có góc độ phân cành hẹp tốt cho việc tăng mật độ[5] Lá đậu tương Lá đậu tương có loại: Lá mầm, nguyên, kép Lá mầm (lá tử diệp) mọc có màu vàng hay xanh lục, tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi mầm, hết chất dinh dưỡng mầm khô héo đi, kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ chọn hạt to mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên (lá đơn) xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng Lá đơn to màu xanh bóng biểu sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lá kép gồm có chét, có 4-5 chét Lá kép mọc so le, kép thường có màu xanh tươi già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống chín giữ màu xanh, giống thích hợp trồng làm thức ăn gia súc Phần lớn có nhiều lơng tơ Lá có nhiều hình dạng khác tuỳ theo giống, giống nhỏ dài chịu hạn khoẻ thường cho suất thấp Những giống to chống chịu hạn thường cho suất cao Nếu kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét Số lượng kép nhiều hay ít, diện tích to hay nhỏ chi phối lớn đến suất phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các nằm cạnh chùm hoa giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa Nếu điều kiện làm cho bị úa vàng vị trí thường bị rụng lép Các nhà chọn giống đậu tương đưa sở để nâng cao suất đậu tương tăng cường trình quang hợp muốn quang hợp với hiệu cao phải chọn có nhỏ, dày, đứng có dạng hình trứng Số nhiều to khoẻ vào thời kỳ hoa rộ Khi phiến phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi biểu sinh trưởng khoẻ có khả cho suất cao [5] Hoa đậu tương Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc hoa thay đổi tuỳ theo giống thường có màu tím, tím nhạt trắng Đa phần giống có hoa màu tím tím nhạt Các giống đậu tương có hoa màu trắng thường có tỷ lệ dầu cao giống màu tím Hoa phát sinh nách lá, đầu cành đầu thân Hoa mọc thành chùm, chùm có từ 1-10 hoa thường có 3-5 hoa Hoa đậu tương nhiều tỷ lệ rụng cao khoảng 30% có lên tới 80% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính hoa có nhị nhụy, hoa gồm đài, cánh hoa có 10 nhị nhụy - Đài hoa có màu xanh, nhiều - Cánh hoa: Một cánh to gọi cánh cờ, cánh bướm cánh thìa - Nhị đực: nhị đực thành ống ôm lấy vòi nhuỵ nhị riêng lẻ - Nhụy cái: Bầu thượng, tử phịng ngăn có 1-4 tâm bì (nỗn) nên thường đậu tương có 2-3 hạt [5] Các cánh hoa vươn khỏi đài từ ngày hôm trước việc thụ phấn xẩy vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 sáng trước nụ hoa chưa nở hoàn toàn Mùa hè hoa thường nở sớm mùa đông thời gian nở hoa ngắn sáng nở chiều tàn Hoa đậu tương thường thụ phấn trước hoa nở tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn thấp chiếm trung bình 0,5 - 1% [2] Thời gian bắt đầu hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống thời tiết khác Giống chín sớm sau mọc 30 ngày hoa giống chín muộn 45-50 ngày hoa Thời gian hoa dài hay ngắn theo giống theo thời vụ Có giống thời gian hoa kéo dài 10-15 ngày Kết nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ đến ngày thứ 10 sau hoa bắt đầu nở Hoa đợt rộ tạo nhiều, trước sau đợt hoa rộ tỷ lệ đậu thấp Điều kiện thích hợp cho nở hoa nhiệt độ 25-280C, ẩm độ khơng khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80% Căn vào phương thức hoa người ta chia giống đậu tương làm nhóm: Nhóm hoa hữu hạn: Thuộc giống sinh trưởng hữu hạn, hướng hoa theo trình tự từ xuống từ vào Những giống thường thấp hoa tập trung, hạt đồng Nhóm hoa vơ hạn: Thuộc giống sinh trưởng vơ hạn, có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hướng hoa theo trình tự từ lên từ Những giống thường hoa phân tán, chín khơng tập trung phẩm chất hạt không đồng [5] Trong thực tế, giống hoa tập trung gặp điều kiện bất thuận, hoa rụng nhiều nên thất thu nặng Còn giống thời gian hoa dài chín khơng tập trung bị rụng vào đợt hoa tiếp đợt sau nên không thất thu nặng Một hoa có từ 1800-6800 hạt phấn tuỳ theo giống khác nhau, giống hạt to có bao phấn to nhiều hạt phấn Hạt phấn thường hình trịn, số lượng kích thước hạt phấn tuỳ giống khác nhau, giống hạt to thường có hạt phấn to nhiều so với giống có hạt nhỏ Hạt phấn nảy mầm tốt điều kiện nhiệt độ 18-230C Quả hạt Số biến động từ đến 20 chùm hoa đạt tới 400 một chứa từ tới hạt, hầu hết giống thường từ đến hạt Quả đậu tương thẳng cong, có chiều dài từ tới cm Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu đen Màu sắc phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc lông, có mặt sắc tố antocyanin Lúc non có màu xanh nhiều lơng (có khả quang hợp có diệp lục) chín có màu nâu Hoa đậu tương nhiều tỷ lệ đậu thấp 20-30% Ví dụ vụ xn có 120 hoa đậu 30-40 cao, chùm 5-8 hoa đậu 2- Những đốt phía gốc thường khơng có quả, từ đốt thứ 5-6 trở lên tỷ lệ đậu cao nhiều Trên cành thường từ đốt 2-3 trở lên có chắc, đầu cành thường lép nhiều Sau hoa nở ngày cánh hoa héo rụng, ngày thứ đến ngày thứ sau hoa nở hình thành -8 ngày sau thấy nhân xuất Trong 18 ngày đầu lớn nhanh sau chậm dần, vỏ dày lên chuyển từ màu xanh sang màu vàng Hạt lớn nhanh vịng 3035 ngày sau hình thành Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Các giống đậu tương thuộc nhánh thứ Nhất phân bố nhóm, nhóm I gồm giống: VNlc1, VNlc3 VNlc4, VNlc5; nhóm II gồm giống: VNlc2, VNlc7, VNlc8, VNlc9, VNlc10, VNlc11, VNlc12, VNlc13; nhóm III gồm giống: VNlc6, VNlc14, VNlc15 Nhóm II nhóm III có khoảng cách di truyền 20% hai nhóm có khoảng cách so với nhóm I 22,5% Nhánh thứ Hai gồm 15 giống: VNlc16, VNlc17, VNlc18, VNlc19, VNlc20, VNlc21 VNlc22, VNlc23, VNlc24, VNlc25, VNlc26, VNlc27, VNlc28, VNlc29, VNlc30 Các giống đậu tương thuộc nhánh thứ Hai phân bố nhóm, ký hiệu IV, V, VI, VII, VIII Nhóm IV có giống: VNlc16, VNlc17 nhóm V gồm giống: VNlc18, VNlc19, VNlc20 Hai nhóm có khoảng cách 24,5% Nhóm VI có giống: VNlc21; nhóm VII có giống VNlc22; nhóm VIII gồm giống cịn lại là: VNlc23, VNlc24, VNlc25, VNlc26, VNlc27, VNlc28, VNlc29, VNlc30 Khoảng cách di truyền nhóm VIII so với nhóm VI 25% Từ kết phân nhóm chúng tơi nhận thấy tính đa hình 30 giống đậu tương phạm vi phân tích 16 mồi ngẫu nhiên phản ứng RAPD chứng minh khác cấu trúc DNA hệ gen giống đậu tương địa phương nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Các giống đậu tương nghiên cứu có đa dạng màu sắc hạt, hình dạng hạt, màu sắc rốn hạt khối lượng 1000 hạt Khối lượng 1000 hạt giống đậu tương dao động từ 74,6g đến 194,61g Trong đó, giống VNlc8 có khối lượng hạt cao (194,61g), thấp giống VNlc28 (74,6g) 1.2 Bằng kỹ thuật RAPD với việc sàng lọc 16 mồi ngẫu nhiên nhân 1388 phân đoạn DNA từ hệ gen 30 giống đậu tương Trong số mồi sử dụng có 9/16 mồi biểu tính đa hình cao (M1, MTr4, M7, M5, M17, M4, M2, M15, M8 ), với giá trị PIC > 0,5 1.3 Hệ số đa dạng di truyền giống đậu tương dựa phân tích RAPD với 16 mồi ngẫu nhiên HRAPD = 66,23% Hệ số sai khác di truyền cặp giống đậu tương nghiên cứu dao động từ 4% đến 42% 1.4 Đã xác định thị phân tử RAPD đặc trưng giống đậu tương địa phương: (VNlc6/M2-2,0 kb), (VNlc10/M2-0,6 kb), (VNlc1/M5-1,2 kb), (VNlc22/M7-0,6 kb), (VNlc8/M10-0,4 kb), (VNlc15/M15-0,6) 1.5 Các giống đậu tương nghiên cứu phân bố nhóm (I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII) thuộc nhánh phát sinh với khoảng cách di truyền 31% ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục sử dụng kỹ thuật RAPD với số lượng mồi nhiều kết hợp với số kỹ thuật khác (SSR, AFLP, RFLP) để có thơng tin đầy đủ đa dạng di truyền giống đậu tương địa phương, tạo sở cho việc sử dụng hợp lý giống đậu tương địa phương chọn tạo giống Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Đinh Ngọc Hương, Hoàng Văn Mạnh, Lê Đức Huấn (2011), Sự đa dạng hệ gen số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương Tạp chí Khoa học&Cơng nghệĐại học Thái Nguyên (Đã nhận đăng) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nxb Khoa học&Kỹ thuật Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp Trần Thị Ngọc Diệp (2009), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền số giống ngô (Zea mays L.), Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Vũ Anh Đào, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2009), Đánh giá đa dạng di truyền mức phân tử số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương, Tạp chí Khoa học&Cơng nghệĐại học Thái Nguyên, 57(9), tr 85-90 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nơng Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Danh Đông (1984), Trồng đậu tương, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Vũ Thị Hiền Nguyễn Thị Thư (2004) Hoá sinh học, Nxb Đại Học Sư Phạm Phạm Thành Hổ (2006), Di truyền học Nxb Giáo dục Nguyễn Thị Kim Liên (2003), Nghiên cứu định vị locus số tính trạng hình thái lúa cạn phục vụ cho việc chọn dòng lúa chịu hạn, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, tr 24 - 34 10 Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nơng Nghiệp, Hà Nội 11 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội 12 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dịng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 13 Chu Hồng Mậu, Nơng Thị Man, Lê Xn Đắc, Đinh Thị Phịng, Lê Trần Bình (2002), “Đánh giá genome số dòng đậu tương đột biến kỹ thuật phân tích đa hình DNA nhân ngẫu nhiên”, Tạp chí sinh học, 22tr 21 - 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chị hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 15 Đinh Thị Phịng, Ngơ Lam Giang (2008), “Phân tích mối quan hệ di truyền 19 giống đậu tương thị RAPD”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 6, tr 327 – 334 16 Nguyễn Minh Quế (2009), Đánh giá mối quan hệ di truyền số mẫu dẻ nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 17 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, Nxb Khoa học&Kỹ thuật 18 Hoàng Thị Thao (2010), Nghiên cứu quan hệ di truyền số giống đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek], Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường ĐH Khoa học – ĐHTN 19 Phạm Văn Thiều (1997), Cây đậu tương kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 20 Triệu Thị Thịnh cs (2010), “ Phân tích đa dạng di truyền đậu tươngbàng thị SSR”, Tạp chí khoa học phát triển, 8(4), tr 638 – 646 21 Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả chịu cóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 22 Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên (2006), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương địa phương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt thị SSR” Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thôn, tr 21, 30 - 32 23 Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thành Danh (2008), “Đánh giá đa hình DNA số giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) kỹ thuật RAPD”, Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn, số Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU TIẾNG ANH 24 Awan F S., (2007), “Study of genetic divergence among wheat genotypes through random amplied polymorphic DNA, centre of Agricultural biochemistry and biotechnology”, Unversity of Agricultural Faisalabad Pakistan, 6(3), pp 476 - 481 25 Betal S., (2004) Roy C.P., Kundu S., Sen R.S, “Estimation of geneetic variability of Vigna radiata cultivars by RAPD analysis”, Biologia plantrum, 48(2), pp 205 - 209 26 Brown-Guedira, J.A Thompson, R.L.Nelson, M.L Warburton (2000), “Evaluation of Genetic Diversity of Soybean Introductions and North American Ancestors Using RAPD and SSR Markers”, Crop Science, 40, pp 815-823 27 Chen Y., Wang D., Arelli P., Ebrahimi M., Nelson R.L., (2006), “Molecular marker diversity of SCN-resistant sources in soybean”, Genome; 49, 8; ProQuest Central 28 Dey N., Subarsana B., Chaudhuri T.R.,Dey S.R., Mitu De, Ghose T.K., (2005), “RAPD - base genetic diversity analysis of aromatic rice”, Cababstractsplus, 6(3/4), pp 133 - 142 29 Doldi M., Vollmann J., Lellry T., (1997), Genetic doversity in soybean as determined by RAPD and microsatellite analysis, pp 331 - 335 30 Foolad, Arusekar, Rodriguer (1995), Applicationof polymerase Chain Reation (PCR) to plant genome analyis In: Tissue and organ culture, Fundamenatal mathods Springer Verlag, Berlin, Heidelerg, pp 282 – 289 31 Gawel N.J., Jarret R.H., (1991), Geneomic DNA isolation 32 Gyu-Taek Cho, Jeongran Lee, Jung-Kyung Moon, Mun-Sup Yoon, Hyung-Jin Baek, Jung-Hoon Kang, Tae-San Kim, Nam-Chon Paek (2008), “Genetic Diversity and Population Structure of Korean Soybean Landrace [Glycine max (L.) Merr.]”, J Crop Sci Biotech, (2), pp 83 – 90 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn 33 Jorge (2003), “Genetic diffrentiation of Portugues tea plant using RAPD markers”, Hrt Science, 38(6), pp 1191 - 1197 34 Li Z., Nelson R.L., (2002), “RAPD Marker Diversity among Cultivated and Wild Soybean Accessions from Four Chinese Provinces”, Crop Science, 42, pp 1737 - 1744 35 Matsumura H., Liu B., Abe J., Takahashi R.,(2008), “AFLP mapping of soybean maturity gene E4”, J Hered, 99(2), pp 193-197 36 Orozco C., Chalmers K J., Powell W., Waugh R., (1996), “RAPD and organelle specific RCR re-affirms taxonomic relationships within the genus Coffea”, Plant Cell Reports, 15(5), pp 337 - 341 37 Paulo S., (2004), “Genetic diversity among maize (Zea mays L.) landraces assessed by RAPD markers”, Genetics and molecular biology, 27(2) 38 Pham Thi Be Tu, Nguyen Thi Lang, Bui Chi Bưu(2003), “ Soybean genetic diversity anlalysis ”, Omono rice, 11, pp.138 -142 39 Tantasawat P., J Trongchuen, T Prajongjai, S Jenweerawat, Chaowiset W.,(2011), “SSR analysis of soybean (Glycine max (L.) Merr.) genetic relationship and variety dentification in Thailand ”, AJCS, 5(3), pp 283-290 40 Raghunathachari P., Khanna V K., Singh U S., Singh N K., (2000), “RAPD analysis of genetic variability in Indian Scented germplasm (Oryza sativa L.)”, Curent sience, pp 994 – 998 41 Raina S.N.V, Kojima T., Ogihara Y., Singh K.P., Devarumath R.M., (2001), “RAPD and ISSR figerprints as useful genetic marker for analysis of genetic diversity, varietal identification, and phylogenetic relationships in peanut (Arachis hypogaea L.) cultirs and wild species”, Genome, 44(5), pp 763 - 72 42 Ranade R., Gopalakrishna T., (2001), “Characterization of blackgram [Vigna mungo (L.) Hepper) varieties using RAPD”, Plant varieties & Seeds, 14(3), pp 227-233 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 Seitova A.M, Ignatov., Suprunova T.P, Tsvetkov I.L., Deineko E.V., Dorokhov D.B., Shumnyi V.K, Skriabin K.G., (2004), “Assessment of genetic diversity of wild soybean (Glycine soja Siebold et Zucc.) in the far eastern region of Russia”, Genetika , 40(2) pp 224-31 44 Sholihin, Hautea D.M., (2002), “Molecular mapping of drought resistance in mungbean (Vigna radiata L.): 1.QTL linked to drought resistance, 2.Linkage map in mungbean using AFLP markers”, Jurnal Bioteknologi Pertanian, 7(12), pp 17 - 61 45 Subramanian V., Gurtu S., Nageswara R.C., Nigam S N., (2000), “Identification of DNA polymorphism in cultivated groundnut using random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay”, Maharastra Hybrid Seeds Company (MAHYCO) Ltd., Andhra Pradesh, India, 43(4), pp 656 - 660 46 Xingliang Zhou, Thomas E Carter Jr, Zhanglin Cui, Shoji Miyazaki, Joseph W Burto (2002), “Genetic diversity patterns in Japanese soybean cultivars based on coefficient of Parentage” Crop Science, 42, pp 1331-1342 47 Venkata C.L., Sreedhar R.V., Bhagyalakshmi N., (2007), “The use of genetic markers for detecting DNA polymorphism among banana cultivars”, Plant Cell Biotechnology Department, Central Food Technological Research Institute, KRS Road, Mysore, Karnataka 570 020, India, 18(12) 48 Yiwu Chen, Randall L Nelson (2005), “Relationship between Origin and Genetic Diversity in Chinese Soybean Germplasm”, Crop Science, 45, pp 16451652 49 Yiwu Chen, Dechun Wang, Prakash Arelli, Mohsen Ebrahimi, Randall L Nelson (2006), “Molecular marker diversity of SCN-resistant sources in soybean”, Genome, 49, pp 938 - 949 50 Yong-Bi Fu, Gregory W Peterson, Malcolm J, Morrison (2007), “GeneticDiversity of Canadian Soybean Cultivars and Exotic Germplasm Revealed by Simple Sequence Repeat Marker”, Crop Science, 47, pp 1947-1954 51 Weian, Hongkun Zhao,…(2009), “Genetic diversity in annual wild soybean( Glycine soja sieb Et zucc.) and cutivated soybean( G Max Merr.) from different latitudes in China”, Pak J Bot., 41(5), pp 2229-2242 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, ngày 19 tháng 06 năm 2011 Tác giả luận văn Đinh Ngọc Hương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hồng Mậu - Đại học Thái Ngun tận tình hướng dẫn, tài trợ phần kinh phí tạo điều kiện để tơi hồn thành kết luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên trực tiếp hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ kỹ thuật viên phịng thí nghiệm sinh học – Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác - Viện nghiên cứu Ngô Trung tâm giống trồng địa phương cung cấp hạt số giống đậu tương làm vật liệu nghiên cứư cho đề tài luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè nhiệt tình ủng hộ động viên tơi suốt q trình thực luận văn Cơng trình thực với tài trợ kinh phí dự án TRIG Tác giả luận văn Đinh Ngọc Hương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyênii 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc) cs Cộng CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide DNA Deoxy ribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic) Đtg Đồng tác giả EDTA Ethylen Diamin Tetracetic Acid ISSR Inter Simple Sequence Repeats Kb Kilo base NST Nhiễm sắc thể Nxb Nhà xuất PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PIC Polymophism Information Content ( Thơng tin tính đa hình) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản) TAE Tris Acetate EDTA Tris Trioxymetylaminometan Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyêniii 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục chữ viết tắt iii Mục lục iv Danh mục bảng vi Danh mục hìn vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cƣ́u Chƣơng 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học đậu tƣơng 1.1.3 Thành phần hoá sinh hạt đậu tƣơng 10 1.1.4 Vị trí, tầm quan trọng đậu tƣơng 11 1.2 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT 13 1.2.1 Một số phƣơng pháp sinh học phân tử phân tích quan hệ di truyền thực vật 13 1.2.1.1 Kỹ thuật RAPD 13 1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP 15 1.2.1.3 Kỹ thuật RFLP 16 1.2.1.4 Kỹ thuật SSR 16 1.2.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa dạng mối quan hệ di truyền thực vật 17 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22 2.1.1 Vật liệu thực vật 22 2.1.2 Hoá chất thiết bị 22 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.1 Phƣơng pháp sinh học phân tử 25 2.2.1.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 25 2.2.1.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng độ tinh DNA tổng số 26 2.2.1.3 Phƣơng pháp RAPD 26 2.2.1.4 Phân tích số liệu RAPD 28 Chƣơng 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ KHỐI LƢỢNG 1000 HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 29 3.2 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG TRONG HỆ GEN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG BẰNG KỸ THUẬT RAPD 31 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ đậu tƣơng 31 3.2.2 Kết nhân phân đoạn DNA kĩ thuật RAPD 32 3.2.3 Hệ số đa dạng di truyền phân đoạn DNA đặc trƣng giống đậu tƣơng nghiên cứu 51 3.2.4 Mối quan hệ khoảng cách di truyền giống đậu tƣơng dựa phân tích RAPD 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 KẾT LUẬN 56 ĐỀ NGHỊ 56 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v 67 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng luận văn Trang 2.1 Nguồn gốc giống đậu tương nghiên cứu 23 2.2 Trình tự nucleotide 16 mồi sử dụng nghiên cứu 27 2.3 Thành phần phản ứng RAPD 27 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD 28 3.1 Đặc điểm hình thái khối lượng 1000 hạt 30 giống đậu 30 tương 3.2 3.3 3.4 3.5 Tỉ lệ phân đoạn đa hình sử dụng 16 mồi RAPD 33 Thơng tin đa hình PIC mồi ngẫu nhiên phản ứng RAPD nhân DNA 30 giống đậu tương nghiên cứu Chỉ thị RAPD đặc trưng 30 giống đậu tương nghiên cứu Bảng hệ số tương đồng di truyền 30 giống đậu tương nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi 68 35 52 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình luận văn Hình Trang 2.1 Hạt giống đậu tương nghiên cứu 24 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số 30 giống đậu tương nghiên cứu 32 3.2 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 30 giống đậu tương 36 3.3 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 30 giống đậu tương 37 3.4 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M3 30 giống đậu tương 39 3.5 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 30 giống đậu tương 40 3.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 30 giống đậu tương 42 3.7 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M8 30 giống đậu tương 43 3.8 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M9 30 giống đậu tương 44 3.9 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M10 30 giống đậu tương 45 3.10 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M11 MTr2 30 giống đậu tương 46 3.11 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 30 giống đậu tương 46 3.12 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M15 30 giống đậu tương 47 3.13 Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M17 30 giống đậu tương 49 3.14 Sơ đồ mối quan hệ di truyền 30 giống đậu tương 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii 69 http://www.lrc-tnu.edu.vn